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1、1VEGF 基因在骨缺损模型家兔骨修复中的表达动态分析【摘要】 目的动态分析骨缺损修复过程中血管内皮生长因子(VEGF)基因表达量与骨缺损修复时间的关系.方法取新西兰家兔30 只，于右侧桡骨钻出直径为 20mm 的骨组织, 制作骨缺损模型，钻取自体髂骨骨颗粒，并移植于右侧桡骨骨缺损区域.分别于术后3d、1 周、2 周、4 周、6 周、8 周时处死动物取材，行逆转录 聚合酶链反应（RTPCR ） ，观察并分析骨缺损修复过程中 VEGF 基因表达量.结果术后第 3 日、1 周、2 周、4 周、6 周、8 周时骨缺损区域 VEGF 基因的相对表达量分别为 2.08， 1.00，0.88，3.40，1
2、.71，1.17.结论VEGF 基因在骨缺损修复过程中发挥重要作用，它的表达量在术后 3d 及第 4 周时出现高峰. 【关键词】 血管内皮生长因子；骨缺损；聚合酶链反应Dynamic quantification analysis of expression of VEGF gene in repairing of bone defect of rabbit modelABSTRACT:OBJECTIVETo study the relationship between expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and tim
3、e of reparing of bone defect.METHODS20mm standard 2bone defect modal was processed in the right middle radial shaft of rabbit in 30 New Zealand rabbits. The spongy bone was transplanted from ilium to repair right radius defect for 3 days, 1, 2, 4, 6, 8 weeks after operation.RESULTSThe experimintal g
4、roup was 2.08 after 3 days, 1.00 after 1 week and 0.88 after 2 weeks, 3.40 after 4 weeks, 1.71 after 6 weeks, 1.17 after 8 weeks.CONCLUSIONThe VEGF gene pays an important role in reparing of bone defect, and its expression is high peak in 3d and 4 weeks after operation.Key words:vascular endothelial
5、 growth factor;bone defect;pdymerase chain reaction骨组织的愈合是骨折或骨缺损的修复过程，分为组织修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板期及塑形期.骨折的愈合有多种生长因子参与，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial grouth factor, VEGF)基因在骨的生长和发育、再生及修复等生理病理过程中起重要作用.本研究通过制作家兔骨缺损模型，对 VEGF 基因在骨修复中的表达进行了动态分析，探讨了骨缺损修复过程中 VEGF 基因表达量与修复时间的关系.1 材料与方法31.1 动物模型的制作 实验动物取家兔(新西兰)30 只
6、，体重为2.02.5kg，由延边大学医学部实验动物科提供，雌雄不限 .在无菌状态下用骨磨钻于家兔右侧桡骨处钻出直径为 20mm 的骨组织,制作骨缺损模型,于髂骨钻取直径为 1.02.0mm 的骨颗粒，将其移植于右侧桡骨骨缺损区.术后肌肉注射给予 0.1g/kg 头孢唑啉钠,连续4d.分别于手术后 3d、1 周、2 周、4 周、 6 周及 8 周时处死动物,每次 5 只，剖取骨缺损区移植物标本 ,迅速置入液氮中，取出 ,研磨，用Trazol 法提取 mRNA 构建扩增，备用.1.2 方法 PCR 相关试剂为大连 TAKARA 公司产品. 采用 Real Time PCR 法检测各组的基因相对表达
7、量，将兔子骨 Total RNA（大连大学提供）作为管家基因（GAPDH ）的 RNA 标准品,以体外转录构建的 RNA 作为目的基因（VEGF）的 RNA 标准品，将家兔骨 Total RNA(500ng)反转录获得的 cDNA 用 EASY Dilution 按 10 倍梯度稀释作为模板，进行 Real Time PCR 反应，绘制管家基因的标准曲线.将体外构建的 VEGF 目的基因 RNA 标准品反转录获得的 cDNA 用 EASY Dilution 按 10 倍梯度稀释作为模板. 取 1.1 项下扩增样品进行 PCR 检测, 分别与管家基因及目的基因标准曲线相比较，进行相对表达量分析.
8、2 结果4GAPDH 及 VEGF 基因标准曲线见图 1 及图 2.VEGF 目的基因在94 30s,5565 30s,72 1min 的条件下,共进行 30 个循环,其后 72延伸 2min.将扩增物分别进行琼脂糖凝胶电泳,结果在骨缺损修复 3d、1 周、2 周、 4 周、6 周、8 周时分别为4446，2061，1611 ， 1048，245，578bp. 以 1 周循环次数为基础，3d、1 周、2 周、4 周、6 周、8 周时其比值分别为2.08,1.00,0.88,3.40,1.71,1.17,见表 1.图 1 GAPDH 管家基因扩增标准曲线图 2 VEGF 目的基因扩增标准曲线表
9、1 VEGF 基因相对表达量管家基因 GAPDH 定量结果相对表达量*目的基因 VEGF 定量结果校正结果相对表达量*3d338701.0444462.162.081 周324601.0020611.001.002 周 288950.8916110.780.884 周48440.1510480.513.406 周 23990.072450.121.718 周77690.245780.281.17* 相对表达量为以 1 周时循环次数为基础计算得出的比值3 讨论骨缺损通常由外伤、感染、恶性肿瘤及人工关节翻修手术等所致1, 骨缺损的修复, 特别是大段骨缺损的修复是骨科治疗的难题2 ，每年在美国 65
10、0 万例骨折患者中发生延期治疗者为 10%15%3,4.5新血管形成可能与诸多因素相关，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子 ,及肿瘤坏死因子等 5,其中血管内皮生长因子可特异性地作用于内皮细胞68.初同伟9报道，骨折断端存在VEGFmRNA 高表达，且高表达贯穿于骨折愈合的全过程.本实验制作了家兔桡骨骨折模型，并用自体髂骨骨松质对缺损区进行修补，采用 Real Time PCR 方法观察了骨缺损修复时间与 VEGF 基因表达量的动态关系.实验结果表明, 术后第 3 日、1 周、2 周、4 周、6 周及 8 周时 VEGF 基因的相对表达量分别为2.08，1.00，0.88，3.40，1.71，
11、1.17，提示术后 3d 时血管内皮生长因子的表达迅速增强，其原因可能与机体受到外伤后发生应急反应有关;第 4 周时 VEGF 基因表达再次出现高峰，其原因可能与移植区坏死骨被吸收，新生成软骨细胞及基质分泌的 VEGF 增多有关.综上所述，VEGF 基因在骨缺损模型家兔修复中发挥重要作用，而它的表达量在修复过程中发生变化.【参考文献】 1 曹建中.骨内科及骨外科诊断治疗学M.北京：中国科学技术出版社，2003.20.2 李志跃,孙运才. 骨基质明胶复合红骨髓及同种骨修复节段性骨缺损的实验研究J.中华骨科杂志， 2000,7:440.63 Paul H, Kenl G, Renny T, et
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