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1、1MAL 基因在原发食管癌组织表达及临床意义【摘要】 目的 探讨 MAL 基因表达下调与食管癌病理分期、组织学分级的相关性。方法 采用 RT-PCR 和半定量 RT-PCR 方法检测45 例食管癌组织和癌旁食管黏膜组织中 MAL 基因的表达。结果 40 例食管癌组织中 MAL mRNA 表达明显低于相应的癌旁食管黏膜组织(2=30.59,P0.01)；期病人的 MAL 基因表达水平显著高于期病人（t=5.952，P0.001） ，淋巴结转移阳性病人MAL mRNA 表达水平显著低于淋巴结转移阴性病人（t=6.743，P0.001） 。结论 MAL mRNA 在食管癌组织中的表达与临床分期、组织
2、学分级等临床病理因素有一定相关性，可作为判断食管癌恶性程度、转移潜能及预后的实验室指标。 【关键词】 食管肿瘤;MAL 基因；逆转录聚合酶链反应 ABSTRACT Objective To explore the relevance between MAL gene expression, clinical stage and histologic grade of esophagus cancer. Methods The MAL gene expression in 45 cancer patients was detected with RT-PCR and semi-quantitat
3、ive RT-PCR technique. Results The mRNA expression of MAL in 40 cancer tissue samples was lower than that in the surrounding esophagus mucous membrane (2=30.59,P0.01). The gene expression in stages and patients was higher than that in stage patients 2(t=5.952,P0.001). Those with lymph node metastasis
4、 showed lower gene expression than patients without (t=6.743,P0.001). Conclusion In esophagus cancer, the MAL gene expression was associated with histologic grade and clinical stage, which can be used for determining tumor malignancy and predicting its prognosis. KEY WORDS Esophageal neoplasms; MAL
5、gene; Reverse transcriptase polymerase chain reaction MAL 基因是由 ALONSO 等1于 1987 年分离得到的抑制肿瘤生长的新基因，MAL 基因失活及异常与细胞信号转导、肿瘤的发生发展和临床预后等有一定关系。近年来，MAL 基因与食管癌的关系已成为研究的热点。本研究利用定性和半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测食管癌组织及其癌旁组织中 MAL 基因的表达情况，旨在探讨 MAL 基因在食管癌发生发展过程中的作用，及其与临床病理因素的关系，为食管癌发病机制的研究提供新思路。 1 材料与方法 1.1 标本来源 1.1.1 病例选
6、择 2004 年 6 月2006 年 3 月，泰安市中心医院住院的食管癌病人 45 例，男 25 例，女 20 例；年龄 3679 岁，平均 57.5 岁。术前均未发现远处转移，未行放、化疗治疗。手术方式均为经左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合术，术中无肉眼可见肿瘤残留。术后病理检查均证实为鳞癌。按 UICC 食管癌3分期标准（1997）进行分期。 1.1.2 标本取材和保存 食管癌组织及癌旁组织取自食管癌病人手术标本，组织离体后立即无菌取材，从肿瘤生长活跃无坏死的部位取下约 1 cm3 癌组织及 5 cm 外癌旁组织，标本 30 min 内送实验室，新鲜提取总 RNA；不能保证 30
7、 min 内制备样品的，在取材后放-80 冰箱保存备测。 1.2 检测方法 采用半定量 RT-PCR 法检测 MAL mRNA 的相对表达水平。总 RNA 提取：采用 Trizol 提取总 RNA，并进行纯度和浓度测定。RT 反应:于 DEPC 处理的 Eppendorf 管中，加入 1 g 总RNA、MMLV 及随机引物等，快速离心混匀后， 37 1 h，95 10 min 灭活 MMLV，快速离心使蒸气沉于管底。 PCR 反应：于0.5 mL Eppendorf 管中加入 RT 反应产物、PCR 反应体系、MAL上游引物（5-AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3 ） 、MAL 下游
8、引物(5-ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3)、-actin 上游引物(5-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3)，以及 -actin 下游引物(5-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3)，扩增片段长度为 500 bp；95 5 min，离心使蒸气沉于管底，加 Taq DNA 聚合酶，快速离心混匀。循环条件：94 1 min，58 1 min，72 1 min，循环 35 次，末次延伸 7 min。电泳鉴定，观察目的基因，实验中仅出现一条 500 bp -actin 条带为 MAL mRNA 阴性；同时出现 166 bp 条带为 MAL mRNA 阳性。采用数
9、字图像分析仪 22004系统观察拍照并进行半定量分析，以 MAL-actin 比值作为 MAL mRNA 相对表达量，若比值小于 25为表达缺失，若比值小于 50%则为低表达，低表达与表达缺失均为异常表达。 1.3 统计学分析 应用 SPSS 10.0 统计软件，对定性 RT-PCR 结果进行 2 检验及确切概率法；对半定量 RT-PCR 结果进行 t 检验。 2 结 果 2.1 食管癌组织和癌旁组织中 MAL mRNA 的定性检查结果比较 45 例食管癌组织中未见 MAL 表达者 28 例，弱表达者 12 例；癌旁组织食管黏膜组织 MAL mRNA 全部呈阳性表达。食管癌组织中 MAL mR
10、NA 表达明显低于相应的癌旁食管黏膜组织，差异有显著性(2=30.59,P0.01)。见图 1。 图 1 RT-PCR 检测食管癌组织 MAL mRNA 的表达 、为食管癌组织 MAL mRNA 表达阳性；、为食管癌组织 MAL mRNA 表达阴性；为 X174/Hae分子质量标志物 2.2 MAL mRNA 的半定量 RT-PCR 检测 2.2.1 食管癌组织和癌旁组织中 MAL mRNA 表达水平比较 本文 45 例食管癌组织 MAL mRNA 相对表达水平为 0.900.11，而癌旁组织中 MAL mRNA 的表达水平为 1.510.27，两者比较差异有统计学意义(t=2.329，P0.
11、05)。 2.2.2 食管癌组织 MAL mRNA 表达水平与临床病理分期的关系 MAL mRNA 表达水平与食管癌病人性别、年龄无关，但随临床分5期的增高，其表达水平明显降低(P0.001)，且淋巴结转移阳性者MAL mRNA 表达水平显著低于淋巴结转移阴性者（P0.001） 。见表 1。表 1 食管癌组织 MAL mRNA 表达水平与临床病理特征的关系 3 讨 论 MAL 基因定位于 2q13，共含有 4 个外显子,其 cDNA 长为 1 051 bp。 MAL 是 T 淋巴细胞成熟相关蛋白，它强烈表达于正常食管上皮细胞，1987 年 ALONSO 等1报道具有特征性的 MAL cDNA
12、克隆呈现在成熟 T 淋巴细胞上。现已证实， MAL 是组成向顶端运输的细胞膜和分泌性蛋白的必不可少的组成部分26 。基于MAL 的功能是诱发广泛的大量囊泡形成，有作者提出,MAL 在顶端传送体的形成中扮演着重要角色7,8 。现在已有许多研究证明，MAL 表达和人类食管恶性肿瘤相关。有学者报道，MAL 基因在食管癌发生的不同阶段均表达下调，且从不同角度分析和探讨 MAL基因表达下调的可能机制，MAL 的不表达或表达下调在食管癌发生中可能起决定性作用9,10 。 TUGORES 等11报道，MAL 启动子区设计缺失影响转录子失活，没有观察到 MAL 基因组区有遗传性的修改，而且在 13 例食管癌细
13、胞株中有 3 例 MAL 启动子发生甲基化，9 例细胞株中 MAL表达正调节。其机制可能为 MAL 启动子 DNA 甲基化和组蛋白脱乙酰基协同作用于 MAL 基因导致肿瘤发生。然而，现在仍没有明确MAL 基因在癌组织中表达是否被其他机制调节，如染色体缺失、突6变或其他畸变。功能性测定表明，在癌细胞中外源性 MAL 的表达可引起细胞运动性降低，在活体内致瘤性下降。本研究采用定性和半定量两种方法研究了食管癌 MAL mRNA 的表达与性别、年龄、临床分期及组织学分级等因素的关系。结果显示，MAL mRNA 的表达缺失在不同性别、年龄中无明显差异，从而推测食管癌 MAL mRNA 的表达缺失与性别、
14、年龄无关，而 MAL 基因的表达与食管癌的组织学分级、临床分期也无相关性，与文献12,13报道不符，可能与病例数较少有关。本文研究结果显示，食管癌组织 MAL mRNA 相对表达量与癌旁组织比较差异有显著性，且随临床分期和组织学分级的增高，其表达水平明显降低，即 MAL 基因在食管癌组织中表达显著下调。表明 MAL 基因表达下调是食管癌发生、发展过程中的一个频发事件。国内许智雄等14通过 PCR 分析显示，在食管癌细胞系 EC109、EC8712 和 EC9706 中都存在被分析的MAL 基因片段。 本文在研究食管癌组织 MAL 基因的表达同时，也探讨了 MAL 基因与食管癌淋巴结转移的关系。
15、结果显示，淋巴结转移阳性组 MAL的表达显著低于淋巴结转移阴性组（P0.05） ，提示食管癌组织MAL 的低表达与淋巴结转移存在显著的相关性，关于 MAL 基因如何调节食管癌淋巴转移的机制仍不十分清楚。淋巴结转移是食管癌的独立危险因素，MAL 的低表达与淋巴结转移存在显著的相关性，因此，MAL 基因的表达与食管癌的预后有一定的相关性。目前，关于食管癌 MAL 基因与淋巴结转移的关系的同类研究尚未见报道，7要得到更加准确和客观的结果还需要更大样本量的研究。 【参考文献】 1ALONSO M A, WEISSMAN S M. cDNA cloning and sequence of MAL, a
16、hydrophobic protein associated with human T-cell differentiationJ . Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84:1997-2001. 2CHEONG K H, ZACCHETTI D, SCHNEEBERGER E E, et al. VIP17/MAL, a lipid raft-associated protein, is involved in apical transport in MDCK cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(11):6241-6248. 3PUERTOLLANO R, ALONSO M A. MAL, an integral element of the
