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1、1p38 MAPK 在嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞释放 MCP作者：王成彬，童红莉，田亚平,汪德清，黄振国，叶伟基，李洛谊，林伟基【关键词】 上皮细胞Regulatory role of p38 MAPK for MCP1 release from activated bronchial epithelial cells by eosinophils【Abstract】 AIM: To investigate the release of monocyte chemoattractant protein （MCP）1 from the coculture of human bronchial
2、 epithelial cells and eosinophils and the related mechanisms. METHODS: MCP1 in culture supernatant was determined by Cytometric Bead Array (CBA) Kit in flow cytometry to compare MCP1 release in bronchial epithelial cells and eosinophils cultured alone or together, and investigate the inhibitive effe
3、ct of SB 203580, a selective inhibitor of p38 MAPK, on MCP1 release. The reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to analyze the gene expression of MCP1 in bronchial epithelial 2cells during coculture with eosinophils and the effect of SB 203580. RESULTS: The interaction of eo
4、sinophils and bronchial epithelial cells was found to upregulate the gene expression of MCP1 in epithelial cells. MCP1 in coculture supernatant of bronchial epithelial cells and eosinophils was elevated significantly (1266127) ng/L vs (13425) ng/L,P0.001. Fixed eosinophils, which lost the ability to
5、 release MCP1, could also elevate epithelial cells to release MCP1 (77348) ng/L vs (10715) ng/L, P0.001 in coculture. SB 203580 could effectively inhibit MCP1 gene expression of bronchial epithelial cells during coculture with eosinophils, and decreased the release of MCP1 in the coculture of epithe
6、lial cells and eosinophils or fixed eosinophils (1335115) ng/L vs (48142) ng/L, (86889) ng/L vs (23926) ng/L, P0.001. CONCLUSION: Eosinophils can activate bronchial epithelial cells to express MCP1 in coculture by p38 MAPK pathway so as to regulate the airway inflammatory reaction.【Keywords】 bronchi
7、; epithelial cells; eosinophils; monocyte chemoattractant protein1; p38 MAPK3【摘要】目的： 探讨支气管上皮细胞与嗜酸性粒细胞联合培养过程中炎性介质的释放及其机制. 方法：应用流式细胞微珠实验（CBA）方法定量比较嗜酸性粒细胞、支气管上皮细胞及其联合培养上清液中单核细胞趋化蛋白（MCP）1 的释放以及 p38 MAPK抑制剂 SB 203580 干预的影响；用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）分析联合培养过程中嗜酸性粒细胞对支气管上皮细胞MCP1 基因表达的活化及 SB 203580 对 MCP1 表达的抑制作用. 结果
8、： 经嗜酸性粒细胞活化后，支气管上皮细胞中 MCP1 基因表达明显上调；嗜酸性粒细胞和支气管上皮细胞联合培养上清液中MCP1 蛋白质释放显著增加(1266127) ng/L vs (13425) ng/L, P0.001 ；多聚甲醛固定后的嗜酸性粒细胞不能释放 MCP1，但其在与支气管上皮细胞联合培养过程中仍可增加支气管上皮细胞释放 MCP1 (77348) ng/L vs (10715) ng/L, P0.001 ；p38 MAPK 抑制剂 SB 203580 可有效抑制嗜酸性粒细胞活化支气管上皮细胞表达 MCP1 基因，显著降低正常嗜酸性粒细胞和多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与支气管上皮细胞联合
9、培养过程中 MCP1 的释放(1335115) ng/L vs (48142) ng/L 和(86889) ng/L vs (23926) ng/L, P0.001. 结论： 嗜酸性粒细胞可通过 p38 MAPK 信号传导通路活化支气管上皮细胞表达 MCP1，调控过敏性气道炎症反应.【关键词】支气管；上皮细胞；嗜酸细胞；单核细胞化学吸4引蛋白质 1；p38 MAPK0 引言过敏性哮喘的显著特点就是大量炎性细胞，特别是嗜酸性粒细胞在支气管炎症部位聚积，活化后的嗜酸性粒细胞可通过脱颗粒释放嗜酸性粒细胞阳性蛋白（ECP） 、主要碱性蛋白(MBP)等毒性蛋白，而这些毒性蛋白可造成支气管上皮损伤1. 损
10、伤的支气管上皮修复和气道重建可导致气道水肿、增厚、狭窄和对不同刺激的反应性增高，从而引发常见的咳嗽、呼吸困难等一系列临床症状. 支管上皮对外环境的屏障功能已被广泛认识，但作为哮喘炎症反应的发生部位，其在过敏性哮喘发生、发展中的免疫调控作用未能引起广泛重视. 我们通过嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触培养为实验模型，探讨哮喘过程中嗜酸粒细胞从外周血移行至支气管上皮后，通过活化支气管上皮释放炎性介质细胞趋化因子 MCP1，调控过敏性哮喘炎性反应的过程.1 材料和方法1.1 材料密度 1.082 kg/L Percoll 溶液: 混合 87.92 mL Percoll 原液 (密度 1.130, 瑞典
11、Amersham 公司产品)，15 mL 1.5 mol/L NaCl 和 47.1 mL 去离子水；抗 CD16 抗体磁珠和细胞磁性5分离系统（MACS）购自德国 Miltenyi Biotec 公司；p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂 SB 203580 购自美国Calbiochem 公司；DMEM/F12，RPMI 1640 细胞培养液购自美国 Gibco Invitrogen 公司；RNA 抽提试剂 TRIReagent 购自美国Molecular Research Center 公司；人细胞趋化因子 CBA 测定试剂盒购自美国 BD 公司；第一条链 cDNA 合成试
12、剂盒购自瑞典Amersham 公司；MCP1 和 actin PCR 扩增引物为美国Invitrogen 公司产品；流式细胞仪（FACSCalibur）为美国 BD 公司产品；DNA 热循环仪（PTC200）为美国 MJ 公司；新鲜人全血由香港红十字会输血服务中心提供.1.2 方法1.2.1 嗜酸性粒细胞分离新鲜人全血中血细胞通过密度为1.082 kg/L Percoll 溶液离心分层，去除淋巴细胞层后用冰浴去离子水裂解红细胞，所剩嗜中性、酸性粒细胞与抗 CD16 抗体磁珠反应使细胞表面带有 CD16 蛋白质的嗜中性粒细胞与磁珠结合. 当嗜中性、酸性粒细胞混悬液通过磁性分离柱时，由于磁性作用使
13、结合在磁珠上的嗜中性粒细胞吸附于分离柱上，而表面不表达 CD16 的嗜酸性粒细胞则可以顺利通过分离柱. 分离后的嗜酸性粒细胞用伊红染色鉴定其纯度，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640 细胞培养液中待用.61.2.2 嗜酸性粒细胞固定分离后的嗜酸性粒细胞用 10 g/L 多聚甲醛在室温中固定 3 h，再用含 20 mL/L 小牛血清的 PBS 清洗 3遍，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含 100 mL/L 小牛血清的RPMI 1640 细胞培养液中待用.1.2.3 细胞培养人支气管上皮细胞系（BEAS2B，美国 ATCC公司购买）置含 100 mL/
14、L 小牛血清的 DMEM/F12 细胞培养液中，37, 50 mL/L CO2 孵育.1.2.4MCP1 释放试验 BEAS2B 细胞被培养在 24 孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，移净原培养液并立即加入 1 mL 含 1109/L 正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L 小牛血清）RPMI 1640 细胞培养液，嗜酸性粒细胞与BEAS2B 细胞联合培养 12 h.1.2.5p38 MAPK 抑制剂干预实验 BEAS2B 细胞被培养在 24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，弃原培养液并立即加入含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640 细胞
15、培养液 0.5 mL，然后加入 20 mol/L SB 203580 培养 1 h，再加入含 2109/L 正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入 100 mL/L 小牛血清）RPMI 1640 细胞培养液 0.5 mL. 1106 正常或经多聚甲醛固7定嗜酸性粒细胞与 BEAS2B 细胞在 10 mol/L SB203580 存在情况下联合培养 12 h.1.2.6 细胞培养上清液收集正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与 BEAS2B 细胞联合培养到实验设计时间后，收集培养上清液，510 g, 4 离心 10 min，分离无细胞上清液并立即置于-80 保存.1.2.7 细胞趋化因子测定细
16、胞培养上清液中的细胞趋化因子MCP1 应用流式细胞微珠实验（CBA）试剂盒定量（美国 BD 公司产品） 2.1.2.8BEAS2B 细胞总 RNA 抽提融合的 BEAS2B 细胞与4106 嗜酸性粒细胞在 4 mL 含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640细胞培养液中联合培养 12 h（p38 MAPK 抑制剂实验，先加入 20 mol/L SB 203580 与 BEAS2B 细胞培养 1 h）. 移去细胞培养液后，BEAS2B 细胞用冰育 PBS 冲洗三次，BEAS2B 细胞总 RNA 用TRIReagent RNA 提取试剂盒根据操作说明进行提取. 所提 RNA 质量通过电泳方法鉴定，分光光度法定量其浓度，于-80冰冻保存待用.1.2.9RTPCR 分析 BEAS2B 细胞 MCP1 基因表达细胞总8RNA 用第一条链 cDNA 合成试剂反转录到 cDNA 再行 PCR 反应. PCR 反
