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1、1CT-1 对神经再支配骨骼肌功能恢复的促进作用【摘要】 目的 探讨经心脏营养素-1（CT-1 ）治疗后的失神经骨骼肌重获神经支配后的功能恢复情况。方法 60 只 Swiss 小鼠，切断右侧胫神经，随机分成 2 组，其中一组每天注射外源性 CT-1（100 g/kg） ，另外一组注射等量 CT-1 溶媒，1 个月后修复胫神经。分别于 4、8 和 12 周后检测再生胫神经的有髓神经纤维数、神经再支配骨骼肌的复合肌肉动作电位（CMAP ）和肌张力，并与对照组比较。结果 与对照组相比，CT-1 注射组的再生神经有髓神经纤维数、重获神经支配后的骨骼肌的 CMAP 和肌张力均有显著提高（t=6.3943
2、.36,P0.01） 。结论 CT-1 具有促进神经再生和改善骨骼肌收缩功能的双重作用，有效促进了神经再支配骨骼肌的功能恢复。 【关键词】 心脏营养素-1 去神经支配 肌 骨骼 功能恢复 ABSTRACT ObjectiveTo investigate the function of reinnervated skeletal muscle treated with Cardiotrophin-1 (CT-1).MethodsSixty Swiss mice with cut-off right tibial nerve were evenly randomized to two groups
3、: 30 mice were intraperitoneally injected exogenous CT-1 (100 g/kg BW) for one month; others were injected the same amount of CT-1 solvent as control group. One month later, the tibial nerves were repaired. The numbers of myelinated nerve fibres of 2repaired nerve, the CMAP, latency and tension of r
4、einnervation skeleton muscle were assayed on week 4, 8 and 12.ResultsCompared with those of the control, the numbers of regenerated myelinated nerve fibres of the nerve, CMAP and tension of reinnervated gastrocnemius muscle of the experiment were significantly increased (t=6.39-43.36,P0.01).Conclusi
5、onCT-1 has dual effects of promoting nerve regeneration and improving the muscle contractile function. KEY WORDSCardiotrophin-1; Denervation; Muscle, skeletal; Recovery of function 失神经骨骼肌萎缩的防治和神经再支配骨骼肌的功能恢复是周围神经外科领域的难题，目前尚无有效治疗措施。研究证实，心脏营养素-1（CT-1 ）作为一种新型细胞因子，可通过作用于失神经骨骼肌细胞表面的 gp130/LIFR- 受体，激活相关信号传
6、导途径，促进骨骼肌细胞的蛋白合成，抑制骨骼肌细胞的凋亡，有效地延缓失神经骨骼肌的萎缩，是一种很有前景的肌营养因子1 。本实验在此基础上，进一步探讨了经 CT-1 治疗后的失神经骨骼肌重获神经支配后的功能恢复情况，现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 实验动物和主要试剂 健康成年雄性 Swiss 小鼠 60 只，体质量 3035 g。重组小鼠3CT-1（ rmCT-1）由美国 R&D 公司生产。 1.2 方法 1.2.1 动物模型的建立和给药方法 5 g/L 的硫喷妥钠腹腔注射麻醉，显微镜下解剖出胫神经上段后切断胫神经干，将两断端移开，用 8-0 的无创线分别固定于邻近的股二头肌表面，防止
7、神经断端回缩或自行愈合，并各留一长线头作为标记，缝合切口。将胫神经切断后的 60 只小鼠，随机分成 2 组，每组 30 只，送回动物房饲养。实验组小鼠每日腹腔注射 rmCT-1 （CT-1 注射组）100 g/kg，对照组每日腹腔注射等量 CT-1 溶媒。1 个月后，停止给药，再次手术，行胫神经修复。从原切口进入，分别在股二头肌表面找到胫神经远、近端，修剪神经断端瘢痕直至出现正常的神经束后，以 11-0无创伤尼龙线作神经端端缝合，关闭切口后继续饲养。 1.2.2 腓肠肌复合肌肉动作电位和坐骨神经诱发电位潜伏期的测定 分别将动物饲养 4、8 和 12 周后，以 5 g/L 的硫喷妥钠行腹腔注射麻
8、醉，显露修复后的胫神经和近侧的坐骨神经主干，以及相应的靶肌肉 腓肠肌。同心针电极插入腓肠肌，刺激电极于神经吻合口近侧 2 cm 处刺激坐骨神经，检测神经再支配后腓肠肌复合肌肉动作电位（CMAP）和神经诱发电位潜伏期（Lat） ，以对侧正常胫神经和腓肠肌作为对照组。电刺激和记录参数如下：方波；持续时间 0.1 ms，刺激强度 0.3 mA，刺激频率 1 Hz。 1.2.3 腓肠肌肌张力的测定 实验小鼠进行完电生理检测后，解剖并完全显露出腓肠肌，在近止点处将跟腱切断，向近侧游离腓肠肌，4保护好腓肠肌的血管神经束。用 1-0 丝线将跟腱断端连接到肌张力换能器的力臂上，换能输出线与二道生理记录仪相连。
9、刺激电极位置在坐骨神经主干，调整记录仪敏感度，肌肉张力定标 2.0 g，肌肉收缩力的方向与换能力臂上的弹片垂直。单刺激的刺激量为 3.84 V，时程 1 s，频率 1 Hz；强直收缩的刺激量为 3.84 V，时程 10 s，频率 50 Hz。根据记录仪上描记出的收缩曲线，测量肌张力，并与对照组比较。 1.2.4 有髓神经纤维计数 按照不同组别，分别切取胫神经吻合口以远 5 mm 的再生胫神经标本 5 mm，甲醛溶液固定后，石蜡包埋、切片，快蓝染色。所得切片每隔 3 张取一张，连取 5 张，应用Leica FW 4000 图像分析软件进行分析，计算有髓神经纤维数，观察再生轴突数目随时间的变化,并
10、与对照组比较。 1.3 统计学分析 资料由复旦大学上海医学院卫生统计教研室用 SPSS 11.0 软件处理。数据采用 xs 表示。两组间比较行 t 检验。 2 结 果 2.1 胫神经吻合口远端有髓神经纤维数量 各组术后不同时间胫神经再生轴突数目比较见表 1。结果显示，胫神经断端重新吻合后 4 周，已经可见到再生的神经轴突，随着时间的延长，再生的神经纤维数逐渐增多。CT-1 注射组 4、8、12 周再生神经轴突数目明显多于对照组（t=7.1010.80,P0.05） 。但对神经再支配腓肠肌的 CMAP 检测结果显示，神经修复前 CMAP 测不出。在神经修复后 4、8、12 周，均可测出CMAP，
11、各时间点两组 CMAP 比较差异有显著性（t=19.99 32.00，P0.01 ） ，见表 3。 2.3 外源性 CT-1 对神经再生后腓肠肌肌张力的影响 各组术后不同时间腓肠肌单刺激收缩力比较见表 4。可以看出，随着神经修复后时间的延长，CT-1 注射组单刺激坐骨神经腓肠肌肌张力逐渐增大。CT-1 注射组 4、8 、12 周的肌张力比对照组明显增高（t=6.3943.36,P0.01） 。各组术后不同时间腓肠肌强直收缩力的比较见表 5，CT-1 注射组 4、8、12 周肌张力比对照组明显增高（t=6.3943.36,P0.01） 。表 1 两组再生神经轴突数目比较表 2 两组小鼠胫神经修复
12、后不同时间的潜伏期比较表 3 两组小鼠胫神经修复不同时间腓肠肌 CMAP 比较表 4 单刺激坐骨神经两组腓肠肌肌张力比较 表 5 强直刺激坐骨神经两组腓肠肌肌张力比较 3 讨 论 骨骼肌是周围神经系统的靶器官，其结构和功能均受到运动神经的支配和调节，以及各种细胞因子的营养。一旦失去神经支配，骨骼肌不仅丧失了来自运动神经的神经冲动，同时正常完整的运动神6经元所产生和分泌的营养因子也减少，骨骼肌体积逐渐减小，肌纤维逐渐萎缩并失去收缩功能，肌细胞也发生一系列改变2 。失神经后骨骼肌萎缩发展迅速，而神经纤维再生缓慢，往往在神经再支配前已丧失了肌细胞再生的物质基础，表现为不可逆肌萎缩，严重影响神经修复术
13、后的功能恢复。加快神经再生，尽早恢复神经支配，同时采取措施延缓肌肉萎缩，是恢复骨骼肌功能的两个重要环节。 CT-1 是 PENNICA 于 1995 年分离出的一种细胞因子，可作用于靶器官上的受体 gp130/LIFR-，产生多种生物学效应 3 。我们的前期研究显示，骨骼肌细胞表面也存在受体 gp130/LIFR-，外源性 CT-1 可与此受体结合，激活细胞内的 MAPK（丝裂素活化蛋白激酶）途径和 JAK-STAT（信号传导和转录激活蛋白 3）途径4 ，促进骨骼肌细胞的蛋白合成，增加失神经骨骼肌的总蛋白含量，抑制失神经骨骼肌细胞的凋亡，延缓失神经骨骼肌的萎缩，改善失神经骨骼肌的收缩特性，这为
14、骨骼肌重获神经支配后的功能恢复奠定了基础5 。本实验对经 CT-1 治疗后的失神经骨骼肌在重获神经支配后的功能恢复情况进行了探讨。结果表明，应用外源性CT-1 可明显增加修复后的周围神经的有髓神经纤维数量，显著提高重获神经支配的骨骼肌 CMAP 和肌张力，有效改善神经再支配骨骼肌的收缩功能。CMAP 和肌张力是衡量神经再支配骨骼肌收缩功能的两个重要指标，CMAP 反映的是再生神经可兴奋的神经纤维数，以及有神经支配的肌纤维数，即运动单位的数量。刺激支配神经所记录到的骨骼肌的肌张力是再生神经、运动终板和骨骼肌本身特性7的综合反映。 已有研究证实，CT-1 能够减轻受损神经元的损害，抑制近端运动神经
15、轴突的变性，促进轴突再生，改善突触结构。经腺病毒 CT-1转染后的进行性运动神经元病小鼠，有更多的肌纤维获得了神经的再支配。神经传导速度和神经-肌接头的传递速度均有所改善6 。腺病毒 CT-1 转染也可以防止受损的神经细胞的死亡和萎缩，并刺激成年大鼠脊髓损伤后红核脊髓束的再生。另外，LESBORDES 等7报道，肌内注射可表达 CT-1 的腺病毒载体能提高脊髓性肌萎缩小鼠的存活时间，减轻小鼠运动神经元的损害，以及抑制近端运动神经轴突的变性，并改善突触结构。这些研究结果均表明，外源性 CT-1 可以通过作用于运动神经元和促进周围神经的再生，来间接改善病变骨骼肌的功能。而 CT-1 对骨骼肌的直接营养作用中所产生的形态学和骨骼肌本身特性的改善，为神经再支配骨骼肌的功能恢复奠定了基础。由此可见，CT-1 对神经再生和对骨骼肌的双重作用，有效地促进了神经再支配骨骼肌的功能恢复，CT-1 的应用有望成为治疗失神经骨骼肌萎缩的有效方法。 【参考文献】 1 马学晓, 张高孟, 冯勇,等. 心脏营养素 -1 对失神经骨骼肌的营养和保护作用J. 中华手外科杂志, 2006,22(2)：112-115. 2 邢洪涛 ,尚宇阳,李崇杰. 周围神经损伤与肌肉萎缩J. 实用手外科杂志, 2003,17(1):36-37. 8
