《CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1CCKB-R mRNA 在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达作者：赵琼 廖敏 丁维俊 李秀亮 瞿佳【摘要 】 目的探讨胆囊收缩素受体 CCKB-R mRNA 在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响。方法借助特制饲料喂养幼龄厌食大鼠模型，采用 RT-PCR 技术检测CCKB-R 在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达，并观察加减益胃汤对该模型 CCKB-R 表达的影响。结果正常大鼠结肠平滑肌细胞中 CCKB-R 有低水平表达，特制饲料喂养造模后其表达水平异常增高，与空白对照组比较有极显著的统计学意义（P0.001） ；加减益胃汤高、中、低剂量组均能显著抑制或下调 CCKB
2、-R 的高表达，且有一定的量-效趋势。结论 CCKB-R 基因高表达可能是厌食发生的主要病理环节之一，抑制或下调 CCKB-R 基因表达可能是加减益胃汤治疗厌食症的主要作用靶点之一。 【关键词】 胆囊收缩素受体；厌食Abstract：ObjectiveTo investigate the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats, and the effect of modified Yi Wei Decoction on 2it.MethodsThe anorexia ra
3、t model was establisbed by feeding rats with specially prepared forage. The expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia pedo-rats was examined by RT-PCR, and the effect of modified Yiwei decoction on it was observed.ResultsCompared with blank control, the expression of CCK
4、B-R mRNA in anorexia rats was significantly increased (P0.001). Highdosage, middledosage or lowdosage of Yiwei decoction all could obviously decrease the expression of CCKB-R mRNA as compared with model group(P0.001).ConclusionThe expression of CCKB-R mRNA can be obviously increased in colon smooth
5、muscle cells of the anorexia pedo-rats, which is one of the mechanisms of anorexia.Modified Yiwei decoction can decrease the expression of CCKB-R mRNA in colon smooth muscle cells of the anorexia rats.Key words：CCKB-R; Anorexia近年来研究证实胆囊收缩素（CCK）等脑肠肽在小儿厌食症的发病中起着重要的作用，但对其受体表达及进一步的分子信号转导机制还不十分清楚。本研究在近年来
6、中药复方加减益胃汤治疗小儿厌食症取得良好临床疗效和我们前期研究1的基础上，借助特制饲3料喂养幼龄厌食大鼠模型，对 CCKB-R 在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响进行了初步研究。现报道如下。1 材料与仪器加减益胃汤：北沙参 15 g，麦冬 10 g，乌梅 5 g，山药 15 g，莲米 15 g，生麦芽 15 g，生谷芽 15 g，藿香 10 g 等（由成都中医药大学制剂教研室制备） ；阳性对照药：儿宝颗粒（江西清江制药厂产品，产品批号：050411） 。抑肽酶（丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司产品） ，50 000 KIU/支，使用前用生理盐水稀释为 25 IU/m
7、l；PCR 反应试剂盒：TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0 试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司生产。PCR 仪：Thermo Hybrid 生产，型号：Px2；凝胶成像系统：BIO-RAD 生产，型号：GEL-DOC。2 方法2.1 分组及造模2.1.1 动物及分组实验用 SD 大鼠 72 只（成都中医药大学动物实验中心提供，SPF 级动物） ，日龄 4045 d，体重（7510）4g，随机分为 6 组，即空白对照组、模型组、阳性对照组、加减益胃汤高、中、低剂量组，每组 12 只。2.1.2 造模及给药方法除空白对照组外，其余各组参考文献2采取特制饲料喂养 “病因模拟
8、”法造模。灌胃给药，实验过程中每日记录动物进食量，实验第 8 天开始灌胃，空白对照组和模型组灌生理盐水，阳性对照组灌服儿宝颗粒，加减益胃汤低剂量组灌服 17.5 g 生药/kg ，加减益胃汤中剂量组灌服 35 g 生药/kg，加减益胃汤高剂量组灌服 70 g 生药/kg ，1 次/d。第 28 天晚 8 时起禁食，第 29 天处死，取标本。2.2 样本提取与保存大鼠处死后，迅速剪取结肠中段 , 生理盐水洗尽血迹，去除黏膜层, 取肌层组织并置于液氮中保存待测。2.3 RTPCR 检测 CCKB-R 表达2.3.1 引物设计与合成从美国国立卫生院所维护的国际权威数据库网站获得最新版本的 CCKB-
9、R 和内参基因 -actin 的 mRNA 序列。利用引物设计专业软件 Primer Primier 5.0 设计其引物。然后委托大连宝生物完成引物合成。将引物溶于去离子水之中，终浓度调整为 20 5pmol/l，20保存备用。CCKB 受体引物：5-CTAAGAACGGTCACCAACG；3-GTGTAAGTAGAAGCCGTG。2.3.2 RNA 提取采用美国 TriZol 试剂(Cat NO: 15596-018)，按试剂盒提供的方法提取结肠中段组织中的总 RNA，各组使用相同剂量的结肠中段组织总 RNA。1.5%琼脂糖电泳确定质量与含量后，80 保存备用。2.3.3 RTPCR按试剂盒
10、说明程序进行，先经逆转录酶系统合成cDNA。PCR 仪进行 CCKB-R 扩增，取 10 l cDNA 反应液进行PCR。PCR 的条件：变性：94预变性 5 min，94 变性 1 min；退火：54， 30 s；延伸 72，30 s。30 个循环后，72再延伸 10 min 终止反应，4 。CCKB-R PCR 扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳（电压 100 V，时间 30 min） ，取出后于紫外线下观察，利用凝胶成像系统分别测定扩增条带的积分光密度值。比较各组 CCKB-R 相对光密度值并进行组间统计，判定 CCKB-R mRNA在幼龄厌食大鼠结肠平滑肌细胞中的表达及加减益胃汤对其表达的影响
11、。62.4 统计学处理数据用 SAS 软件包处理，计量资料均以s表示。多组资料比较用方差分析，两组资料比较用 t 检验。3 结果见表 1。表 1 实验各组对幼龄厌食大鼠结肠平滑肌组织 CCKB-R mRNA 表达的影响（略）表 1 所示，模型组 CCKB-R mRNA 表达与空白组比较有显著差异（P0.001） ；与模型组比较，阳性药组、加减益胃汤高剂量组、中剂量组、低剂量组均使结肠平滑肌组织 CCKB-R mRNA 表达下调（P0.001） ；与阳性药组比较，加减益胃汤各组下调CCKB-R mRNA 表达程度高于阳性药组，但差异不显著；加减益胃汤各组间比较无显著性差异（P0.05） ，但下调
12、 CCKB-R mRNA表达水平表现为高剂量组中剂量组低剂量组，有一定量-效关系趋势。4 讨论胆囊收缩素（cholecystokinion, CCK）是一种广泛分布于中枢及外周神经系统的典型的脑肠肽，具有调节胃肠运动、消化液分泌、摄食、情绪、记忆等多种生理功能。研究结果已证实，小儿厌食症7的临床表现与八肽胆囊收缩素（CCK-8）等脑肠肽水平和胃肠运动功能状态有着密切的关系。文献报道“病因模拟”厌食模型鼠中枢和外周 CCK-8 均显著增高3 ，但 CCK 受体在厌食症发病中的具体作用机制尚不十分清楚。CCK 对胃窦、幽门、小肠、胆囊平滑肌细胞有收缩作用，能增强胆囊收缩和小肠结肠的动力，且通过其受
13、体及信号转导通路发挥其生理作用。通常认为 CCK 与胃肠平滑肌细胞膜上的 CCK-B 受体结合后使 G 蛋白活化，激活膜上的磷脂酶 C（PLC）信号级联，通过 Ca2+-CaM 途径产生胃肠平滑肌细胞收缩。据此，本实验研究中幼龄厌食大鼠模型结肠 CCK-B 受体基因较空白组表达显著增高(P0.05), 提示幼龄厌食大鼠模型结肠 CCK 耦联 Ca2+-CaM 信号通过高度活化，受体上调，使胃肠平滑肌收缩增强。然而近年的研究表明，CCK 对进食后的胃排空有抑制作用。Wechsung 等4研究发现,CCK 通过舒张近端胃和提高幽门括约肌张力以及改变胃排空模式对胃排空发挥抑制作用。也有学者发现，即使
14、是胆囊平滑肌收缩“正常”的胆囊结石患者,其 CCK 受体 mRNA 表达亦显著低于正常人5 。因此本实验特制饲料喂养幼龄大鼠后 CCK 受体表达上调，可能使胃肠平滑肌收缩异常，平滑肌处于紧张或痉挛状态，胃排空抑制，胃肠运动减弱，排空减慢，进而产生饱胀感、厌食等。而加减益胃汤通过下调胃肠 CCK-B 受体基因表达，使高表达的 CCK-B 受体恢复正常，胃肠平滑肌紧张或痉挛状态缓解，胃肠8运动恢复正常，从而达到治疗厌食的目的。我们推测，由于 CCK-8 对摄食的控制有两种作用方式，一是脑组织分泌的 CCK-8 的中枢作用，二是腹迷走神经传入纤维介导的外周 CCK-8 的作用。而 CCK 对消化管运
15、动的调节有神经介导和直接作用于平滑肌两种途径。CCK 直接作用于平滑肌, 因需较高浓度的 CCK, 故认为只有较低的亲和力。 CCK 对消化管的调节被认为主要是以高亲和力的神经调节为主。因此，CCK 对胃肠道平滑肌的作用主要依靠的是神经调节。但由于生理状态下体内 CCK 的作用浓度还不清楚，其他激素、神经递质等与 CCK 在厌食发生中的相互作用影响又是怎样的，CCK 受体在厌食症发病中的具体作用机制还需要我们进一步深入研究和探讨。【参考文献】1赵琼，徐世军，崔敏俐.加减益胃汤治疗小儿脾胃阴虚厌食症的实验研究J.成都中医药大学学报，2005,28（3）：15.2汪受传, 张月萍 .特制饲料喂养幼
16、龄大鼠建立小儿厌食模型J. 南京中医药大学学报，1999，15（3）：148.3彭玉, 吴高鑫 .运脾散对厌食大鼠下丘脑和血浆 CCK8的调节作用J.中医儿科杂志，2007，3(2):20.94Wechsung E, Houvenaghel A. Effect of CCK8 on myoelectrical activity of the gastrointestinal tract in the conscious miniature pigJ. Peptides,1995,16(8):1429.5朱铭岩, 王志伟，陈锦鹏，等 .胆囊结石患者 CCK 受体mRNA 测定的临床意义 J. 肝胆胰外科杂志， 2004,16（4）：255.
