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1、1BRCA1 蛋白在胰腺癌组织中的分布和表达作者：王春杨，张金山，张远强，孙圣坤，蔡伟， 高江平，洪宝发，王晓雄 ，王红 【摘要 】 目的： 研究肿瘤抑制基因 BRCA1 对胰腺癌的作用和其蛋白在胰腺癌组织中的分布和肿瘤发生中的蛋白特性. 方法： 以乳腺癌的细胞株作为阳性对照组，对胰腺癌组织中的 BRCA1 亚细胞分布做了免疫荧光双重染色，免疫组织化学等实验并进行量化. 结果： BRCA1 蛋白在胰腺癌的组织中呈一定比例分布，这点在不同的胰腺癌患者组织标本中得到证实. 免疫荧光双重染色法证实BRCA1 蛋白在胰腺癌细胞胞质和胞核间互动，这是国内首次发现和报道 BRCA1 在胰腺癌组织细胞中胞质
2、和胞核间互动现象和其亚细胞分布情况. 结论： 我们的多病例研究结果都证实 BRCA1 的胞质胞核有比例明确分布，提示可能是参与胰腺癌组织中蛋白功能调节机制，并可能具有与胰腺癌发生相关的蛋白特性，在胰腺癌细胞其亚细胞分布现象预示着将有更好的胰腺癌临床治疗的生物靶点. 【关键词】 胰腺肿瘤；BRCA1 ；组织；出核【Abstract】AIM： To investigate BRCA1 distribution 2in pancreatic cancer tissue and its protein characters in the development of cancer. METHODS：
3、Using the human breast cancer cell line MCF7 as positive control, the subcellular distribution of BRCA1 was investigated in pancreatic cancer tissue by double immunofluorescence staining and immunohistochemistry. RESULTS： BRCA1 was distributed in different pancreatic cancer tissues. Double immunoflu
4、orescence staining revealed that the interaction of BRCA1 protein between cell plasm and nucleus stimulated BRCA1 nuclear export was obvious in different pancreatic tissues. BRCA1 nuclearcytoplasmic shuttling manner was correlated with cancer development. CONCLUSION: Distribution of BRCA1 in plasm a
5、nd nucleus of pancreatic cancer cells indicates that it may be involved in protein function regulation of pacreatic cancer tissue, possess the characters of proteins related to cancer development, and become a better biological target for the clincal therapy of pancreatic cancer.【Keywords】 pancreati
6、c neoplasms; BRCA1; tissues; nuclear export30 引言近年来研究表明，BRCA1 的背景是乳腺癌相关蛋白，其基因是肿瘤抑制基因之一. BRCA1 蛋白由 1863 个氨基酸组成，有 N 端、C 端和中间 ATM, ATR 的磷酸化区组成. 如果有 BRCA1 基因突变的患者直到 70 岁前其乳腺癌的发病率 85%左右，这比普通人群远远高出 20 倍. 许多高度散发型乳腺癌和卵巢癌的病例也有 BRCA1 蛋白表达明显降低的现象，许多研究已经提示了其在散发型乳腺癌和卵巢癌中的重要作用1 ；但 BRCA1 在胰腺癌组织的分布及其作用近年鲜有报道. 很多证据证
7、实 BRCA1 在许多细胞过程中是非常必须的：如 DNA 修复, 细胞周期，checkpoint control, 转录调节和凋亡，直到染色体重建2-5, 但是其肿瘤抑制功能中的作用机制有待进一步研究，尤其是在胰腺肿瘤等与激素有关的肿瘤中BRCA1 特性蛋白和导致肿瘤发生的原因需要进一步研究，我们对BRCA1 蛋白在胰腺癌的分布和特性以及可能有关机制进行了研究和讨论.1 材料和方法1.1 材料解放军总医院确诊胰腺癌病例石蜡包埋标本 20 例，第四军4医大学组胚教研室胰腺癌病例石蜡包埋存档标本 15 例. 荧光显微镜（Olympus BX60） ，小鼠抗人 BRCA1 mAb（molecular
8、 probes）, FITC 标记的和 AvidinTexas red 标记的第 2 抗体（山羊抗小鼠 IgG，molecular probe 公司）和苏木精和伊红（HE）染料.1.2 方法1.2.1 组织切片制备胰腺癌组织切成 4 mm5 mm 的方块，经 40 g/L 多聚甲醛固定(含苦味酸)后梯度脱水、浸蜡过夜高温包埋. 石蜡切片机进行切片，成 5 m 石蜡切片，经贴片、脱蜡、复水等过程后准备做抗体染色或 HE 染色.1.2.2 免疫荧光双重染色和免疫荧光显微镜观察细胞阳性对照操作：消毒无菌的盖玻片无菌操作在洁净台下用镊子放在 6 孔板中，2.5 g/L 的胰酶消化后的 MCF7 用 D
9、MEM 培养液悬浮后分装到 6孔板中，每孔细胞数量 2105，细胞贴壁后 24 h 置入-20, 700 mL/L 乙醇中固定 10 min，pH 值 7.27.4 的 0.01 mol/L PBS 冲洗充分后与准备好的组织切片成套以 20 mL/L BSA 封闭 1 h，浸润BRCA1 第一抗体（稀释比例 1100，molecular probes）4过夜. 第二抗体 FITC羊抗小鼠（稀释比例 1400，molecular probes）或者第二抗体 AvidinTexas red 山羊抗小鼠（稀释比5例 1400，molecular probes）室温摇动充分浸润 4 h. pH 值7.
10、27.4 的 0.01 mol/L PBS 冲洗 3 遍，最后以 DAPI 复染 10 min，荧光封片剂封片（ vector）待观察计数。每组实验重复进行3 次. 显微镜观察时每个病例取 5 组切片，每张切片读取 10 个高倍视野约 500 个肿瘤细胞.1.2.3HE 染色选择相邻组织切片经贴片、脱蜡、复水的胰腺癌病例组织切片后，再经苏木精染色 10 min，常规梯度脱水，800 mL/L 乙醇脱水后经伊红染色 1 min，依次经 900, 1000 mL/L 乙醇脱水、二甲苯透明，封片剂封片待观察以确定显微镜下肿瘤组织和细胞.统计学处理: 所有数据均采用 xs 表示， 组间比较采用 t 检
11、验，P0.05 为差异有统计学意义 .2 结果2.1BRCA1 蛋白在人胰腺癌组织的表达免疫荧光染色实验和荧光显微镜的形态学观察结果证实胰腺癌存在 BRCA1 蛋白表达，作为阳性对照的人类乳腺癌系细胞株有 85%以上的细胞表达BRCA1，35 例胰腺癌组织有 40%的细胞表达 BRCA1，且其中有25%蛋白在细胞核分布, 40%胞核、胞质同时存在，35%只在胞质中存在 BRCA1 蛋白（图 13）. 免疫荧光显微镜观察到细胞表达6BRCA1 以中等强度的 AvidinTexas red 或 FITC 荧光信号为标准.2.2BRCA1 蛋白在不同胰腺癌患者标本的分布 BRCA1 蛋白出核现象在一
12、些病例非常明确，BRCA1 的组织分布有核质比例改变，甚至 BRCA1 蛋白在细胞核没有分布，仅在细胞质可以观察到BRCA1 的分布，这样的病例有 14 个包埋标本，比例是 40%左右. 对于大多数胰腺癌患者的组织切片 BRCA1 蛋白在细胞核和质的细胞分布比例是均匀的，这部分病例组织中 BRCA1 蛋白分布在细胞质和细胞核占 45%53%，BRCA1 蛋白在细胞质的细胞分布比例由31%到 47%（图 13）.3 讨论BRCA1 是肿瘤抑制基因之一， BRCA1 是乳腺癌、卵巢癌相关蛋白，在前列腺癌和结肠肿瘤等众多肿瘤中存在；由 1863 个氨基酸组成，有 N 端、C 端和中间 ATM, AT
13、R 的磷酸化区组成. 在对DNA 损伤的细胞性反应中有许多重要关键作用. 近年来有关文章报道 BRCA1 在乳腺肿瘤细胞的分布很明确6-7 ，并在 DNA 修复，细胞周期，转录调节和细胞凋亡等功能中有相应的重要作用，但是关于 BRCA1 在胰腺肿瘤的分布和相关功能报道很少，本研究的创新性就在于首次以免疫组织化学和免疫荧光双重标记等方法证实了BRCA1 蛋白在胰腺癌细胞存在，提出了 BRCA1 与乳腺癌，卵巢癌、7结肠癌以外还与另一种激素相关的腺体肿瘤胰腺癌相关.BRCA1 蛋白功能的许多方面都需要其有细胞核分布 ，例如DNA 修复、转录调节和细胞周期 checkpoint 控制。 最近的研究表
14、明 BRCA1 蛋白是一种细胞核、细胞质的互动蛋白 8. 尤其是在乳腺肿瘤细胞、卵巢肿瘤细胞中照射后其出核现象和功能的讨论有很多相关报道9-10. 但是关于其真正的出核机制研究却不是特别清楚. 本研究还通过免疫荧光双重染色法结果明确表明胰腺癌的 BRCA1 蛋白表达也有细胞核、细胞浆的互动现象，并且和以往关于其他肿瘤的研究不同，BRCA1 蛋白表达在细胞质和核同时存在的比例非常高. 我们的研究证实 BRCA1 蛋白在胰腺癌细胞胞质和胞核间互动现象，这是国内首次发现和报道 BRCA1 在胰腺癌组织细胞中胞质和胞核间互动现象和其亚细胞分布情况.本研究重点发现了胰腺癌组织的 BRCA1 蛋白表达，而
15、且与BRCA1 在乳腺和卵巢癌细胞株也是胞质胞核互动性蛋白的观点也一致，但发生 BRCA1 蛋白的核质比例改变在胰腺癌组织很特殊，并且与肿瘤发生发展机制和功能可能有密切关系. 在胰腺癌细胞其亚细胞分布现象提出了科学研究下一步问题，而明确在胰腺癌组织细胞 BRCA1 蛋白的出核现象，有助于将来对他们进一步检测和判定其与胰腺癌的恶性程度和进程相关性，也可能为将来引用新的生物治疗胰腺癌办法提供新的思路.8综上所述，我们得出以下结论：胰腺癌组织细胞中明确存在 BRCA1 蛋白表达，其正常分布比例为细胞核占 25%，细胞核与质占 40%；细胞质占 35%。提示可能是参与胰腺癌组织中蛋白功能调节机制; 其
16、质核分布比例在不同的病例各有特点, 即 BRCA1 在胰腺癌组织有蛋白出核现象，从而核质比例改变，进一步提示BRCA1 可能具有与胰腺癌的发生相关的蛋白特性; BRCA1 出核现象可能与 DNA 修复功能以及与肿瘤恶性程度相关，也提示是好的临床治疗靶点.【参考文献】1Rahman N, Stratton MR. The genetics of breast cancer susceptibility J. Annu Rev Genet, 1998, 32: 95-121.2Kerr P, Ashworth A. New complexities for BRCA1 and BRCA2 J. Curr Biol, 2001, 11: R668-R676. 3Pierce AJ, Stark JM, Araujo FD, et al. Doublestrand breaks and tumorigenesi
