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1、1135Hz 极低频电磁场对 Hep G作者：黄小军，杨家骥，王春梅，黄晓峰，李珍，曹云新，于华，王爽，陈丹【关键词】 细胞凋亡Growth and apoptosis of Hep G2 cells affected by extremely lowfrequency electromagnetic field【Abstract】AIM: To investigate the effects of exposure to extremely lowfrequency electromagnetic field (ELF) on the growth and apoptosis of Hep
2、G2 cells. METHODS: Hep G2 cells were exposed to a 135Hz ELF for 6, 12, 24 h respectively and then the cellular viability, cell cycle and percentage of apoptotic cells in the treated Hep G2 cells were measured respectively by methe thiazolyl tetrazolium (MTT) reduction assay and flow cytometry. The u
3、ltrastructural changes were observed by scanning and transmission electron microscopy. RESULTS: The absorbent value（A） was greatly decreased in Hep G2 cells exposed to ELF, compared with that in the corresponding control groups (P0.01). The cellular 2viability was remarkably decreased with the incre
4、asing of exposure time (P0.01). The G1 stage of the Hep G2 cells exposed to ELF was delayed and the percentage of apoptotic cells was increased with the increasing of exposure time. As shown by scanning and transmission electron microscopy, the treated cells were characterized by several specific mo
5、rphologies: apoptotic cells shrank, formed blebs, while the plasma membrane and cellular organelles remained intact. In the nucleus, the chromatin condensed at the nuclear membrane. The cells disintegrated into apoptotic bodies. CONCLUSION: Exposure to 135Hz ELF can inhibit the viability of Hep G2 c
6、ells and induce cell apoptosis.【Keywords】 extremely lowfrequency electromagnetic fields; apoptosis; Hep G2 cells【摘要】 目的： 观察 135Hz 极低频电磁场（ ELF）照射对Hep G2 细胞生长及凋亡的影响. 方法： 用 MTT 比色法、流式细胞仪，检测经 135Hz ELF 照射 6, 12, 24 h 后相应时间点细胞的活性、细胞周期、凋亡细胞的比例，并用扫描电镜以及透射电镜观察细胞超微结构变化. 结果： ELF 磁场暴露后，与相应对照组相比其A 值均下降（P0.01） ，
7、细胞活性随照射时间延长而下降3（P0.01） ；使 Hep G2 细胞 G1 期阻滞，凋亡率随照射时间延长逐渐增高. 扫描电镜以及透射电镜观察到实验组细胞几种特殊的形态学特征： 凋亡细胞收缩，出泡，质膜及细胞器保持完整. 染色质浓缩于核膜，最后，细胞解离成凋亡小体. 结论： 135Hz 的 ELF照射抑制 Hep G2 细胞生长并促进其凋亡 .【关键词】 极低频电磁场；细胞凋亡；Hep G2 细胞0 引言手提电话、计算机等家用电器方便人们生活的同时所产生的极低频电磁场(ELF)越来越引起人们的广泛关注. 如何诱导肿瘤细胞发生凋亡，成为治疗肿瘤的主要研究思路之一2.Simko 等3报道 ELF
8、持续照射可诱导肿瘤细胞凋亡. 研究表明细胞内游离 Ca2+的浓度与细胞凋亡密切相关4 ，胞内高浓度的 Ca2+可以激活内源性核酸内切酶从而导致细胞发生凋亡5. 我们采用流式细胞仪技术、MTT 法、扫描电镜以及透射电子显微镜对细胞周期、细胞活性、凋亡率及细胞超微结构进行观测.1 材料和方法1.1 材料4人肝癌 Hep G2 细胞，由病理教研室隋延仿教授惠赠. 主要试剂： 10 mL/L 四氧化锇（美国 FISHERSCIENTIFIC.CO） ，丙酮（天津化学试剂有限公司） ，EPON812 （天津化学试剂有限公司） ，乙腈（天津博迪化工有限公司） ，醋酸双氧铀（LKBProdukter AB,
9、 Bromma） . 主要仪器：流式细胞仪（美国 Couter ELITE ESP 型） ，JEE4X 真空蒸发仪（日本电子公司） ，JFC1100 离子溅射仪（日本电子公司） ， S520 扫描电子显微镜（日本 Hitachi） ， LKBNova超薄切片机（瑞典） ， JEM2000EX 透射电子显微镜（日本电子光学公司）.1.2 方法1.2.1Hep G2 细胞培养将 Hep G2 细胞按照 2.5108/L 密度接种于带孔的培养皿以及培养瓶中，以完全培养基(10 mL/L 胎牛血清，青、链霉素 1105 U/L) 送入 50 mL/L CO2 的培养箱，37常规培养.1.2.2 实验分
10、组将细胞随机分为 6 组，实验组为 3 组，分别是 6, 12, 24 h 照射组；对照组为 3 组，分别是 6, 12, 24 h 对照组，对照组置于 37孵箱中.51.2.3ELF 照射将 Hep G2 细胞放入 XFDS 超低频信号发生器中的 TEM 小室（Transverse electromagnetic cell，横电磁波传输小室)中，小室内温度被控制在（35.20.2），并保持恒温. 将频率调至 135Hz，电场强度为 80 V/m，分 6, 12, 24 h, 37进行辐照.1.2.4MTT 法检测细胞活性将 Hep G2 细胞均匀接种于 96 孔板，每组 10 个样本，细胞密
11、度为 1107/mL，分别照射 6, 12, 24 h 后实验组以及对应时间点对照组弃去培养液，96 孔板每孔加入MTT（5 g/L）20 L, 37继续培养 4 h，吸弃上清液，每孔加入150 L 二甲亚砜（DMSO） ，振荡 10 min，使结晶充分溶解，选取A490 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测各孔 A 值.1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率 分别将 6, 12, 24 h 照射组及对应时间点对照组的 Hep G2 细胞消化，吹打成单细胞悬液； 将单细胞悬液在室温条件下离心，1400 r/min 离心 5 min 后弃上清； 用冷 PBS 液洗涤一次； 将细胞以 1109/L
12、的浓度重新悬浮于 700 mL/L 的乙醇中室温下固定 30 min， PI 染色；待测细胞凋亡率的活细胞用膜联素 V（ Annexin V）试剂盒进行标记， Couter ELITE ESP 型流式细胞仪（FCM）检测细胞周期分布及凋亡率.1.2.6 扫描电镜观察 制备细胞爬片： 将细胞制成细胞悬液，6接种于含 12 mm12 mm 盖玻片的培养板中，密度为 4108/L，常规培养；待细胞长成单层后，135 Hz ELF 照射 24 h; 0.01 mol/L PBS 洗，5 min2 次，30 mL/L 戊二醛固定 30 min, 0.01 mol/L PBS 洗，5 min2 次； 4
13、保存待用. 样品制备： 将爬片依次经乙腈梯度脱水；真空干燥仪干燥，喷金，扫描电镜下观察.1.2.7 透射电镜观察 样品制备： 将对数生长期各组的细胞制成悬液，离心成 1 mm3 细胞团，加入 30 mg/L 戊二醛，4固定 2 h 以上，0.01 mol/L PBS 漂洗，5 min2 次；10 g/L 锇酸后固定2 h, 0.01 mol/L PBS 漂洗，5 min2 次；丙酮梯度脱水，浸透；Epon812 包埋， 65聚合 24 h. 制备 50 nm 超薄切片，电子染色； 透射电镜下观察.统计学处理： 数据均以 xs 表示，采用 SPSS11.0 统计软件进行析因设计方差分析，组间两两
14、比较用 LSDt 检验，P0.05 认为差异有统计学意义.2 结果2.1Hep G2 细胞正常对照组之间 A 值差别不大， 照射 6, 12, 24 h 组与相应对照组有明显差异（Tab 1）. 135 Hz 的 ELF 作用细胞后，Hep G2 细胞周期发生了改变， 凋亡率升高(Tab 2). 表1135Hz ELF 对 Hep G2 细胞活性的影响（略）表 2 细胞周期及凋7亡率比较（略）2.2 电镜观察正常对照组细胞呈扁平状，细胞生长旺盛，核分裂相常见，细胞表面有丰富的微绒毛，符合肿瘤细胞形态特点（Fig 1A）. 照射 24 h，细胞收缩，变圆，细胞表面出现大小不等的泡状隆起（Fig
15、1B）.透射电镜下， 6, 12, 24 h 的正常对照组细胞呈圆形或椭圆型，体积大小不等，异型性明显，细胞表面微绒毛丰富，细胞之间可见桥粒连接（Fig 1C） ，符合肿瘤细胞形态特点. 6 h 照射组，少量细胞变圆，表面微绒毛减少，部分细胞表面出泡，线粒体浓缩，部分滑面内质网扩张，胞浆及染色质发生浓缩，核膜腔轻度扩张，异染色质增多，发生边集（Fig 1D）. 12 h 照射组，部分细胞胞浆内轻度泡状隆起突出于细胞表面，胞浆及部分线粒体浓缩，异染色质边集（Fig 1E）. 24 h 照射组，胞浆及染色质浓缩，分解成大小不等，形态不一的有膜包绕的团块，突出于细胞表面，团块脱落形成凋亡小体（Fig
16、 1F）. 3 讨论细胞增殖调控与肿瘤发生的密切关系已被人们所认识. 关于ELF 是否影响正常细胞以及肿瘤细胞的增殖、分化无疑成为研究的热点6，7. 我们在实验中，应用透射电镜观察 135 Hz 的 ELF照射 Hep G2 细胞所发生的形态学变化，表明这种照射可抑制 Hep 8G2 细胞生长并促进其凋亡.细胞发生凋亡有其独特的形态学特征8,9： 亚细胞水平上，染色质浓缩，核裂解，核膜完整. 胞浆浓缩，内质网扩张. 随着凋亡的进一步发展，染色质沿核膜聚集成块，扩张的内质网与细胞膜融合，细胞膜卷曲，分别包绕各种细胞器和细胞核的染色质，并以出芽的方式使细胞发生碎裂，形成凋亡小体. 本实验中，我们观察到了 135 Hz 的 ELF 照射所引发的 Hep G2 细胞发生凋亡的细胞超微结构改变，但考虑到体外实验的局限性，135 Hz 的 ELF 的这一作用尚需在动物体内实验加以验证.我们实验的结果表
