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1、1Bmi1基因及其编码蛋白在 SKM1细胞系中的表达【摘要 】 目的 探讨人类 Blymphoma MoMLV insertion region（Bmi1 ）基因及其编码蛋白在骨髓增生异常综合征（myelodysplasia syndrome，MDS）发病中的地位和作用。方法 以正常骨髓和白血病细胞系 K562 为对照，利用半定量 RTPCR和 Western Blot 研究 MDS 细胞系 SKM1中 Bmi1基因在mRNA 和蛋白水平的改变。结果 SKM1中 Bmi1在 mRNA 和蛋白水平均较正常组织有明显表达（P0.05） 。结论 Bmi1基因在 MDS亚型 RAEB 细胞系 SKM1
2、中有明显表达，其在 RAEB 发病中可能具有重要意义。 【关键词】 Bmi1 MDS SKM10 引言Bmi1是 Polycomb 家族成员，其最初发现是作为一种原癌基因与另一种癌基因 cmyc共同导致 B 细胞淋巴瘤的发病。近2年来研究发现，该基因对于维持干细胞及肿瘤干细胞的自我更新，进而维持干细胞池的大小具有重要意义。骨髓增生异常综合征（MDS）是一种干细胞水平的恶性血液疾病，Bmi1 在 MDS 中的表达国内外尚无相关研究。我们通过研究 Bmi1在 MDS 细胞系SKM1中的表达水平，初步探讨了 Bmi1在 MDS 发病中的作用，以期为进一步指导临床治疗提供新的思路。1 材料与方法1.1
3、 主要材料Bmi1单克隆抗体（ Santa Cruz 产品） ，二抗（HRP 标记羊抗鼠 IgG,晶美） ，K562 细胞系（本室保存） ，SKM1 细胞系（JCRB0118，Kawaguchi.R）,蛋白标准品（Sigama） ，ECL 发光试剂盒、一步法 RTPCR试剂盒（晶美） ，BeyozolRNA 抽提试剂盒、硝酸纤维素膜（展晨） ，Bmi1,GAPDH 引物均由上海生工合成，显影液、定影液（晶美） 。1.2 方法1.2.1 细胞培养3SKM1、K562 细胞系培养传代，每周半量换液，培养条件为含 10%小牛血清的 RPMI1640，37，5% CO2。1.2.2 正常对照取正常人骨
4、髓，常规分离单个核细胞备用。1.2.3 RTPCR（）收集细胞：取对数生长期的细胞，按 1107 浓度制备细胞悬液，1 000r/min 离心 3min，去上清， 1PBS 洗涤沉淀 1次; （）提取 RNA 按 Beoyozol 试剂盒说明提取总 RNA，取少量琼脂糖凝胶电泳测试 RNA 完整性; （）一步法 RTPCR 按试剂盒说明进行。反应体系：5buffer 10l,25mmol/L MgCl2 2l,dNTP各 2l，Taq 酶 2l，模板 1.5l，p1、p2(5pmol/l)各1l， DEPC 处理 ddH2O 水补足 50l，混匀，离心。反应条件：逆转录 60 30min;预变
5、性 95 5min；变性 95 1min，退火 54 1min,延伸 72 1min，进行 25 个循环，最后 72 延伸 10min。结束后，取产物 5l, 1%琼脂糖凝胶电泳（80V，10min） ，灰度扫描。Bmi1引物序列： p1: 5CTG 4GTTGCCCATTGACAGC3; p2: 5CAGAAAATGAATGCGAGCCA3, 片段长度为 70bp。GAPDH 引物序列：p3: 5CCATGGAGAAGGCTGGGG3; p4: 5CAAAGTTGTCATGGATGA CC3, 片段长度为 199bp。扩增条件见文献1 。1.2.4 Western Blot常规提取蛋白， B
6、radford 法蛋白定量， 蛋白电泳， 电转膜（80mA 恒流电 20h） ， 0.01M PBS 洗膜 3 次， 8%脱脂奶粉室温封闭 2h， 加入一抗（11 000） ， 4过夜， 洗膜 3 次， 加入二抗（11 000）, 37孵育 1h， 洗膜 3 次， 按 ECL 发光试剂盒说明操作， 显影， 定影， 冲洗， 晾干， 灰度扫描。1.2.5 统计学分析KS400 图像系统进行灰度分析，结果以 s 表示，统计学处理采用 oneway anova(SPSS10.0)。2 结果52.1 Bmi1 mRNA 在 MDS 细胞系 SKM1中的表达Bmi1 mRNA/GAPDH mRNA 表达灰
7、度比值（s ）在正常骨髓单个核细胞以及白血病细胞系 K562，MDS 细胞系 SKM1中分别为 0.9840.112，4.4060.163，4.6320.226，如图 1 显示Bmi1 mRNA 在 SKM1中有明显表达，而在正常组织中仅有少量表达，表达量经统计学处理有显著差异（P0.05） 。图 1 Bmi1 mRNA 在正常骨髓、K562 以及 MDS 患者骨髓中的表达（略）M 为 marker;1 为正常骨髓单个核细胞； 2 为 K562;3 为SKM12.2 Bmi1蛋白在 SKM1中的表达以正常人骨髓以及白血病细胞系 K562 为对照。图 2 显示在上样蛋白量基本一致的条件下，Bmi
8、1 蛋白在 SKM1中有明显表达，而在正常组织中仅有少量表达，前者是后者的 3.94 倍。K562细胞系中 Bmi1蛋白表达亦较明显（3.01） 。这一结果与 Bmi1 6mRNA 在 SKM1中的表达吻合。图 2 Bmi1蛋白表达（略）3 讨论Bmi1是人类基因组中小鼠 Bmi1基因的相似基因，二者在序列上有较强的同源性，事实上，关于人类 Bmi1基因的许多功能都是通过对小鼠 Bmi1基因的研究得到的。早期研究表明，Bmi1 主要功能是作为一种原癌基因参与多种肿瘤的发生，如 B 细胞淋巴瘤，神经系统肿瘤等1。其发挥作用的途径是通过一种叫 Bmi1的信号通路控制下游人们所熟知的癌蛋白以及细胞周
9、期调控蛋白，如 cmyc、 pRB 等的激活。近年来研究发现2,3，Bmi1 信号通路对于维持干细胞的自我更新，进而维持干细胞池大小的稳定具有重要意义。近年来兴起的肿瘤干细胞理论认为，肿瘤的行为学特征和干细胞非常相似，有可能肿瘤的发生是来源于肿瘤干细胞4,5。这种恶性的干细胞不同于一般的肿瘤细胞，因为它可以按严格的方式自我更新、自我复制，从而维持自身数量的恒定，而其子代肿瘤细胞则不具有这种能力。许多研究证明69，能够转化实验动物产生肿瘤的是一些具有干细胞标志的细胞，而干细胞相关基因在肿瘤的发生中具有重要地位。7MDS 是一类干细胞水平的血液疾病，众多研究表明 MDS 是一类异质性很强的疾病，不
10、同的 MDS 亚型，甚至属于同一亚型的不同病人，从发病机理到临床表现、预后都有很大不同，这给治疗带来很大困难。另外，同其他类型肿瘤相比，MDS 研究存在一个重要问题，即目前缺乏广泛认可的动物模型和细胞系，这严重阻碍了MDS 研究进展 10。本项研究试图通过对 MDS 亚型 RAEB 细胞系 SKM1的研究，初步探讨 Bmi1在骨髓增生异常综合征发病中的地位和作用。我们的研究结果表明，Bmi1 mRNA 和 Bmi1蛋白在 SKM1细胞系中均较正常组织有显著表达，这表明 Bmi1可能在 MDS 亚型RAEB 的发病中具有重要意义。限于 MDS 细胞系的缺乏，我们的研究仅仅限于 RAEB 亚型MD
11、S。至于 Bmi1在其他亚型 MDS 发病中的地位和作为，尚需进一步结合相关细胞系和临床研究的结果来证实。另外，Bmi1 信号通路的组成以及激活的始动因素尚不清楚，有待于进一步研究。【参考文献】1 Jacobs JL, Scheijen B, Vonken JW, et al. Bmi1 collaborates with cmyc in tumorigenesis by inhibiting 8cmycinduced apoptosis via INK4A/ARFJ.Genes Dev,1999,3(9):26782690.2 Park I.K., Qian D, Kiel M,et al.
12、 Bmi1 is required for maintenance of adult selfrenewing haematopoietic stem cellsJ.Nature,2003,423(6937):302305.3 Molofsky AV, Pardal R, Iwashita T,et al. Bmi1 dependence distinguishes neural stem cell selfrenewal from progenitor proliferationJ. Nature,2003,425(6961):962967.4 Muhammad AH, Michael BW
13、, Max W, et al. Therapeutic implication of cancer stem cellsJ. Curr Opin Genet Dev,2004,14(1):4347.5 Blair A, Hogge DE, Allies LE,et al. Lack of expression of thy1(CD90)on acute myeloid leukemia cells with longterm proliferative ability in vitro and in vivoJ. Blood,1997,89(9):31043112.6 Blair A, Hog
14、ge DE, Sutherland HJ. Most acute myeloid leukemia progenitor cells with longterm 9proliferative ability in vitro and in vivo have the phenotype CD34+/CD71-/HLA-DR-J. Blood, 1998,92(11):43254335.7 Muhammad AH, Max SW, Adalberto BH, et al. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cellsJ
15、. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(7):354735498 Dick JE. Breast cancer stem cells revealedJ.Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):35473549.9 邵宗鸿，郝玉书. 骨髓增生异常综合征某些研究进展 J.中华血液学杂志，1996，17（2）:106108 10Morrissey JJ, McCracken R, Kaneto H, et al. Location of an inducible nitric oxide synthase mRNA in the normal kidneyJ.Kidney Int, 1994, 45(4):9981005.
