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1、核酸检测实验室的规范化管理核酸检测实验室的规范化管理 一 规范化设置及管理一 规范化设置及管理 一一 临床基因扩增检验实验室区域设置原则临床基因扩增检验实验室区域设置原则 1 临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增区 扩增产物分析区 如使用全自动分析仪 区域可适当合并 2 各工作区域必须有明确的标记 避免不同工作区域内的设备 物品混用 3 进入各工作区域必须严格按照单一方向进行 即 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制 和扩增区 扩增产物分析区 4 不同工作区域使用不同的工作服 例如不同的颜色 工作人 员离开各工
2、作区域时 不得将工作服带出 二 工作区域仪器设备配置标准 二 工作区域仪器设备配置标准 1 试剂贮存和准备区 2 8 和 15 冰箱 混匀器 微量加样器 覆盖1 1000 l 移动紫外灯 近工作台面 消耗品 一次性手套 一次性吸水纸 耐高压处理的离心管和加样器吸头 带滤芯 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 2 标本制备区 1 8 冰箱 20 或 80 冰箱 高速台式冷冻离心机 混匀器 水浴箱或加热模块 微量加样器 覆盖1 1000 l 可移动紫外灯 近工作台面 超净工作台 消耗品 一次性手套 一次性吸水纸 耐高压处理的离心管和加样器吸头 带滤芯 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 如需处理大分子
3、DNA 应备有超声波水浴仪 3 3 扩增反应混合物配制和扩增区扩增反应混合物配制和扩增区 核酸扩增仪 微量加样器 覆盖1 1000 l 可移动紫外灯 近工作台面 消耗品 一次性手套 一次性吸水纸 耐高压处理的离心管和加样器吸头 带滤芯 专用工作服和工作鞋 专用办公用品 4 4 扩增产物分析区扩增产物分析区 基本仪器设备如下 基本仪器设备如下 微量加样器微量加样器 覆盖覆盖1 1000 l 1 1000 l 可移动紫外灯 消耗品 可移动紫外灯 消耗品 专用工作服和工作鞋 专用办公用品专用工作服和工作鞋 专用办公用品 三 各区操作注意事项 三 各区操作注意事项 下述操作在该区进行 下述操作在该区进
4、行 储存试剂的制备 试剂的分装和主反应混合液的制备储存试剂的制备 试剂的分装和主反应混合液的制备 在本区的实验操作过程中 必须戴手套并经常更换 在本区的实验操作过程中 必须戴手套并经常更换 操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施 操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施 严禁用嘴吸取液体 加样器和吸头等必须经高压处理 严禁用嘴吸取液体 加样器和吸头等必须经高压处理 工作结束后必须立即对工作区进行清洁 工作结束后必须立即对工作区进行清洁 实验室及其设备的使用必须有日常记录 实验室及其设备的使用必须有日常记录 1 1 试剂贮存和准备区试剂贮存和准备区 2 2 标本制备区标本制备区
5、 下述操作在该区进行 下述操作在该区进行 标本保存 核酸 标本保存 核酸 RNARNA DNADNA 提取 贮存及其加入至扩 提取 贮存及其加入至扩 增反应管和测定增反应管和测定RNARNA时时cDNAcDNA的合成 的合成 为避免样本间的交叉污染 加入待测核酸后 必须盖好含反为避免样本间的交叉污染 加入待测核酸后 必须盖好含反 应混合液的反应管 应混合液的反应管 对具有潜在传染危险性的材料 必须有明确的样本处理和灭对具有潜在传染危险性的材料 必须有明确的样本处理和灭 活程序 活程序 样本处理对核酸扩增有很大影响 必须使用有效的核酸提取样本处理对核酸扩增有很大影响 必须使用有效的核酸提取 方法
6、 方法 3 3 扩增扩增区区 下述操作在该区进行 下述操作在该区进行 DNADNA或或RNARNA扩增 扩增 在巢式在巢式PCRPCR测定中 通常第一轮扩增后必须打开反应管 因此巢式测定中 通常第一轮扩增后必须打开反应管 因此巢式 扩增由较高的危险性 第二次加样必须在本区内进行 扩增由较高的危险性 第二次加样必须在本区内进行 不能从本区再进入任何不能从本区再进入任何 上游上游 区域 可降低本区的气压以避免气区域 可降低本区的气压以避免气 溶胶从本区漏出 溶胶从本区漏出 为避免气溶胶所致的污染 尽量减少在本区的走动 为避免气溶胶所致的污染 尽量减少在本区的走动 4 4 扩增产物分析区扩增产物分析
7、区 下述操作在本区内进行 扩增片段的测定 下述操作在本区内进行 扩增片段的测定 本区是最主要的扩增产物污染来源 因此必须注意避免通过本本区是最主要的扩增产物污染来源 因此必须注意避免通过本 区的物品及工作服将扩增产物带出 区的物品及工作服将扩增产物带出 本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭 本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭 丙稀酰胺 甲醛或同位素等 应注意实验人员的安全防护 丙稀酰胺 甲醛或同位素等 应注意实验人员的安全防护 本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前 面区域的可能性面区域的可
8、能性 二 质量保证二 质量保证 临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩 增检验所有阶段 即测定分析前的标本采集处理 测定中增检验所有阶段 即测定分析前的标本采集处理 测定中 的核酸提取 扩增和产物分析以及测定后的结果报告等 的核酸提取 扩增和产物分析以及测定后的结果报告等 一 标本的采集 一 标本的采集 二 标本的稳定化处理 二 标本的稳定化处理 三 标本的运送 三 标本的运送 四 标本的贮存 四 标本的贮存 五 标本的处理 五 标本的处理 核酸提取核酸提取 六 靶核酸的逆转录 六 靶核酸的逆转录CFIT CFIT 和扩增和扩增 七 污染
9、七 污染 八 扩增产物的分析 八 扩增产物的分析 九 质量控制 九 质量控制 一 标本的采集 一 标本的采集 n n 常用于基因扩增检测的临床标本包括常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTAEDTA或构橼酸钠抗凝全血或或构橼酸钠抗凝全血或 骨髓 血清或血浆 痰 脑脊液 尿及分泌物等 采血液等样本骨髓 血清或血浆 痰 脑脊液 尿及分泌物等 采血液等样本 时 应使用一次性密闭容器 如真空采血管 当使用非密闭采样时 应使用一次性密闭容器 如真空采血管 当使用非密闭采样 系统时 如尿 分泌物和骨髓的采样 必须注意防止来自采样者系统时 如尿 分泌物和骨髓的采样 必须注意防止来自采样者 的皮屑或分泌物的污
10、染 采样时必须戴一次性手套 的皮屑或分泌物的污染 采样时必须戴一次性手套 n n 玻璃器皿在使用前应高压处理 玻璃器皿在使用前应高压处理 n n 临床用于临床用于RNARNA 如 如HCV HCV RNARNA 扩增检测的血标本建议进行抗凝处理 扩增检测的血标本建议进行抗凝处理 并尽快 并尽快 3 3小时以内 分离血浆 以避免小时以内 分离血浆 以避免RNARNA的降解 如未作抗的降解 如未作抗 凝处理 则抽血后 必须在凝处理 则抽血后 必须在1 1小时内分离血清 小时内分离血清 二 标本的稳定化处理 二 标本的稳定化处理 用于用于DNADNA扩增检测的标本 应及时送至实验室 扩增检测的标本
11、应及时送至实验室 用于用于RNARNA测定的标本应进行稳定化处理 异硫氰酸胍盐测定的标本应进行稳定化处理 异硫氰酸胍盐 Guanidine Guanidine thiocyanatethiocyanate CITC CITC 可使可使DNADNA酶和酶和RNARNA酶立即失活 因此在采集标酶立即失活 因此在采集标 本时 可将标本材料如血清或血浆按本时 可将标本材料如血清或血浆按1 1 4 4的比例加至含有的比例加至含有5mol5mol L L GITCGITC的试管中 从而使血清的试管中 从而使血清 浆浆 中的中的RNARNA酶不可逆失活 酶不可逆失活 三 标本的运送三 标本的运送 q标本采集
12、后必须尽快送至实验室 q经过稳定化处理的标本可在常温下邮寄运送 q用于RNA检测的标本 如果未经稳定化处理 须速冻后 放在干冰中运送 四 标本的贮存 四 标本的贮存 临床体液标本如血清 血浆等可于临床体液标本如血清 血浆等可于 70 70 下长时间贮存 下长时间贮存 用于用于DNADNA测定的已纯化核酸样本可在测定的已纯化核酸样本可在10 mmol10 mmol L TrisL Tris 1mmol1mmol L EDTAL EDTA缓冲液缓冲液 pH7 5 pH7 5 8 0 8 0 中中4 4 保存 保存 用于用于RNARNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中
13、 80 80 或液氮或液氮 中贮存 中贮存 用乙醇沉淀的核酸样本贮存在用乙醇沉淀的核酸样本贮存在 20 20 即可 即可 用用GITCGITC处理的处理的RNARNA标本在室温可保存标本在室温可保存7 7天 天 五 标本的处理 五 标本的处理 核酸提取核酸提取 n标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步 骤 在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板 前 应对其进行充分评价以验证其提取的有效性 n当靶核酸为RNA时 逆转录PCR测定失败的常见原因是标本 在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA酶的 污染 故建议使用高质量的商品核酸提取试剂 六 靶核酸的逆转录 六 靶核酸
14、的逆转录 RT RT 和扩增和扩增 1 1 靶 靶RNARNA的逆转录的逆转录 下述因素通常影响下述因素通常影响cDNAcDNA合成的效率 合成的效率 1 1 逆转录效率的降低逆转录效率的降低 或完全缺乏 其可能的原因有逆转录酶质量不高 试剂降解变质或完全缺乏 其可能的原因有逆转录酶质量不高 试剂降解变质 或加样错误等 或加样错误等 2 2 用于逆转录的标本中存在逆转录或用于逆转录的标本中存在逆转录或TaqTaq酶的抑酶的抑 制物制物 如酚 氯仿 血红素等如酚 氯仿 血红素等 3 RNA 3 RNA酶的存在导致酶的存在导致RNARNA的降解 的降解 2 2 核酸的扩增 核酸的扩增 有多种因素可
15、引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果 如有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果 如 扩增靶核酸中抑制剂存在 扩增靶核酸中抑制剂存在 TaqTaq酶失活 退火温度不对 酶失活 退火温度不对 MgMg2 2 浓度 浓度 不佳 患者标本或试剂受污染等 扩增仪孔中热传导的均一性极不佳 患者标本或试剂受污染等 扩增仪孔中热传导的均一性极 为重要 必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一为重要 必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一 致性进行检查 以避免假阴性结果 致性进行检查 以避免假阴性结果 七 污七 污 染染 在实际工作中 常见有以下几种污染类型 扩增片段的污染在实际工作
16、中 常见有以下几种污染类型 扩增片段的污染 产物污染 天然基因组 产物污染 天然基因组DNADNA的污染 试剂污染 储存液或工作的污染 试剂污染 储存液或工作 液 以及标本间交叉污染 如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本液 以及标本间交叉污染 如气溶胶从一个阳性标本扩散到原本 阴性的标本 临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是阴性的标本 临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源是 扩增产物的污染 扩增产物的污染 1 1 测定分析前的污染源 测定分析前的污染源 2 2 测定分析阶段的污染源 测定分析阶段的污染源 3 3 污染的避免 污染的避免 工作区的严格划分的目的即是为了预防污染 为避免以工作区的严格划分的目的即是为了预防污染 为避免以 前测定中所产生的扩增产物的污染 可设法将其破坏掉 如在扩增前测定中所产生的扩增产物的污染 可设法将其破坏掉 如在扩增 反应中用反应中用dUTPdUTP取代部分取代部分dTTPdTTP 持续的长波紫外灯照射 不能用其来 持续的长波紫外灯照射 不能用其来 替代严格的实验室设置和管理 尤其是这些方法不能防止外来非扩替代严格的实验室设置和管理 尤其是这些方法不
