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1、 细菌内毒素检查要点 目录 1 实验原理2 实验试剂3 试验器具4 检查方法概述5 供试品溶液的制备6 内毒素限值的确定7 最大有效稀释倍数 MVD 的确定8 鲎试剂灵敏度复核9 干扰试验10 供试品的细菌内毒素检查 实验原理 利用鲎试剂与微量内毒素产生凝集反应的现象 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法 阳性结果 细菌内毒素的量用内毒素单位 EU 表示 实验试剂 鲎试剂从海洋无脊椎动物 鲎 的蓝色血液中提取的变形细胞溶解物 经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效浓度表示 即鲎试剂的灵敏度 单位为EU ml 当使用新批号的鲎试剂或试验条
2、件发生可能影响检验结果的改变时 应进行鲎试剂灵敏度复核试验 实验试剂 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制得到的内毒素 用于标定细菌内毒素工作标准品和标定 仲裁鲎试剂灵敏度 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价 用于试验中鲎试剂灵敏度复核 干扰试验及各种阳性对照 细菌内毒素检查用水指内毒素含量小于0 015EU ml 用于凝胶法 或0 005EU ml 用于光度测定法 且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水 试验器具 刻度吸管 凝集管 10 75mm 三角瓶 小试管 16 100mm 试管架 洗耳球 封口膜或金属试管帽 时钟 脱脂棉 吸水纸 剪刀砂轮 耐热器皿常用
3、干热灭菌法 250 30分钟以上 去除 塑料用具应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 目前多为无热原的一次性用品 检查方法概述 凝胶法限量试验半定量试验光度测定法浊度法 终点浊度法和动态浊度法 显色基质法 终点显色法和动态显色法 凝胶法 最简单 经济 应用最广泛 中国药典的 仲裁 方法对干扰相对不敏感 较光度测定法不灵敏 供试品溶液的制备 某些供试品需进行复溶 稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液 一般要求供试品溶液的pH值在6 0 8 0的范围内 可使用酸 碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值 内毒素限值的确定 一般按公式 L K M式中L为供试品的细菌内毒素限值 以EU ml EU mg或E
4、U U 活性单位 表示 K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量 注射剂K 5EU kg h 放射性药品注射剂K 2 5EU kg h 鞘内用注射剂K 0 2EU kg h M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量 依据药品使用说明书 临床用药须知 确定 例 某产品M为14 3mg kg L 5 14 3 0 35EU mg假如此产品的浓度为100mg ml 那么 L 0 35 100 35EU ml 最大有效稀释倍数的确定 最大有效稀释倍数 MVD 指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数 在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测 MVD cL 式中L为供试品的细菌内毒素限值 c为
5、供试品溶液的浓度 当L以EU ml表示时 则c等于1 0ml ml 当L以EU mg或EU U表示时 c的单位需为mg ml或U ml 如供试品为注射用无菌粉末或原料药 则MVD取1 可计算供试品的最小有效稀释浓度c L 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度 EU ml 鲎试剂灵敏度复核 目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确 考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时 应进行鲎试剂灵敏度复核试验 细菌内毒素标准溶液的准备1 取细菌内毒素工作标准品 或国家标准品 一支 轻弹瓶壁 使粉末落入瓶底 然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕 75 酒精棉球擦
6、拭后启开 启开过程中应防止玻璃屑落入瓶内 鲎试剂灵敏度复核 2 按照标准品说明书 加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物 用封口膜将瓶口封严 置漩涡混合器上混合15分钟 然后进行稀释 制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液 即2 0 5 和0 25 为所复核的鲎试剂的标示灵敏度 四个浓度的内毒素标准溶液 每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟 示例某待复核鲎试剂的灵敏度标示值为0 25EU ml 细菌内毒素工作标准品规格为150EU ml 将细菌内毒素工作标准品用1ml细菌内毒素检查用水溶解 再稀释制备成浓度为0 50EU ml 0 25EU ml 0 125EU ml和0 06EU ml的
7、细菌内毒素标准溶液 鲎试剂灵敏度复核 细菌内毒素标准溶液的制备图示 鲎试剂灵敏度复核 待复核鲎试剂的准备取规格为0 1ml 支的鲎试剂18支 每支加入0 1ml检查用水使溶解备用 规格大于0 1ml 支的鲎试剂 按其标示量加入细菌内毒素检查用水复溶后按0 1ml 管分装到凝聚管中 至少准备18管 加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支 管 放在试管架上 排成5列 其中4列4支 1列2支 其中4支4列分别加入0 1ml的2 0 5 和0 25 的内毒素标准溶液 另2支 管 加入0 1ml检查用水作为阴性对照 鲎试剂灵敏度复核 加样结束后 将鲎试剂用封口膜封口 轻轻振动混匀 垂直放入37 1 恒温器
8、中 保温60 2分钟 结果观察将试管轻轻取出 缓缓倒转180 若管内形成凝胶 并且凝胶不变形 不从管壁滑脱者为阳性 未形成凝胶或形成的凝胶不坚实 变形并从管壁滑脱者为阴性 阳性 阴性 鲎试剂灵敏度复核 计算当最大浓度2 管均为阳性 最低浓度0 25 管均为阴性 阴性对照为阴性时实验为有效 按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核结果 c lg 1 X 4 式中X为反应终点浓度的对数值 lg 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度 鲎试剂灵敏度复核 例子 结果判断当 c在0 5 2 包括0 5 和2 时 方可用于细菌内毒素检查 并以标示灵敏度 为该批鲎试剂
9、的灵敏度 干扰实验 目的确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用 为能否使用细菌内毒素检查法提供依据 当进行新药的内毒素检查试验前 或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时 须进行干扰试验 当鲎试剂 供试品的配方 生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时 须进行干扰试验 干扰实验 进行干扰试验一般步骤供试品限值确定根据鲎试剂的灵敏度确定MVD范围 供试品溶液浓度范围 预试验 初筛试验 确定样品最大不干扰浓度正式干扰试验干扰实验预实验目的初步确定供试品的最大不干扰浓度 当限值以EU mg或EU U活性单位表示 或最小不干扰稀释倍数 当限值以EU
10、ml表示 为正式干扰实验提供依据 避免干扰试验的盲目性 干扰实验 操作方法1 将无可检测到内毒素的供试品进行一系列倍数的稀释 但最大的稀释倍数不得超过MVD CL 0 03 0 03EU ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度 2 使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验 每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照 即该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2 浓度 另取2支细菌内毒素检查用水作阴性对照 2支加入2 浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照 例制备稀释倍数为4的供试品阳性对照溶液 0 3ml4 0 EU ml的内毒素标准液 0 3ml稀释倍数为2的供试品稀释液 0 6ml含2 EU ml内毒
11、素标准液的稀释倍数为4的供试品稀释液3 保温60 2分钟 观察并记录结果 干扰实验 4 当阴性对照为阴性 阳性对照为阳性时 实验有效 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性 供试品阳性对照2管为阳性时 认为供试品在该浓度下不干扰实验 此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数 即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验 5 当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性 或供试品阳性对照不为阳性时 说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰 则应对供试品进行更大稀释倍数 不得超过MVD CL 0 03 或通过其他适宜的方法 如过滤 中和 透析或加热处理等 排除干扰 6 当供试品的内毒素限值单位为EU mg或EU U活性单
12、位时 应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度 即稀释倍数下溶液的浓度 以mg ml或活性单位 ml表示 干扰实验 举例某注射液限值为2 5EU ml 按MVD CL 计算出灵敏度为0 03EU ml下的MVD为83倍 将供试品溶液进行一系列稀释 用灵敏度为0 25EU ml的鲎试剂预实验 结果如下 由以上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍 可在此浓度下进行正式干扰试验 干扰实验 正式干扰实验制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品 用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2 0 5 0 25 制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数 再用此
13、稀释液将同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2 0 5 0 25 的含内毒素的供试品溶液 鲎试剂的准备取规格为0 1ml 支的鲎试剂36支 备用 干扰实验 加样准备好的36支鲎试剂放在试管架上 按下图加样 0 1ml内毒素标准液 0 1ml检查用水 0 1ml含内毒素的供试品液 0 1ml供试品液 加样结束后 用封口膜封口 轻轻振动混匀 避免产生气泡 放入37 1 恒温器中 保温60 2分钟 观察并记录结果 干扰实验 实验结果计算如两组最大浓度2 0 均为阳性 最低浓度0 25 均为阴性 阴性对照4管均为阴性时 按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值 Es 和用供试
14、品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值 Et Es lg 1 Xs 4 Et lg 1 Xt 4 式中Xs Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值 lg 干扰实验 当Es在0 5 2 包括0 和2 及Et在0 5Es 2Es 包括0 5Es和2Es 时 则认为供试品在该浓度下无干扰作用 可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查 当Et不在0 5Es 2Es 包括0 5Es和2Es 时 则认为供试品在该浓度下干扰实验 应使用适宜方法排除干扰 如可将供试品进行更大倍数稀释 不超过MVD 建立新品种细菌内毒素检查方法时 每个厂家至少取三个批号
15、的供试品 用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验 供试品细菌内毒素检查 在细菌内毒素检查中 每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照 同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照 供试品溶液的制备根据内毒素限度值 计算MVD CL 然后将供试品进行稀释 其稀释倍数不得超过MVD 一般稀释至MVD 如样品有干扰作用 选择符合干扰试验要求的第二浓度作为日常检查浓度 阳性对照溶液的制备用检查用水将内毒素标准品稀释制成2 浓度的内毒素标准溶液 供试品细菌内毒素检查 供试品阳性对照溶液的制备用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2 浓度的内毒素溶液 阴性对照即细菌内毒素检查用水
16、鲎试剂的准备取规格为0 1ml 支的鲎试剂8支 每支加入0 1ml检查用水使溶解备用 加样8支管中2支加入0 ml供试品溶液或其稀释液作为供试品管 2支加入0 1ml阳性对照溶液作为阳性对照管 2支加入0 1ml检查用水作为阴性对照管 2支加入0 1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管 将试管中溶液轻轻混匀后 用封口膜封闭管口 垂直放入37 1 水浴或适宜恒温器中 保温60 2分钟 供试品细菌内毒素检查 结果判断当阳性对照都为阳性 供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时 实验方有效 若供试品2管均为阴性 认为该供试品符合规定 如供试品2管均为均为阳性 应认为不符合规定 如2管中1管阳性 1管阴性 则另取4支供试品管复试 4管中如有1管为阳性 即认为不符合规定 若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中1管为阳性时 按同样方法复试 复试时要求将稀释至MVD 供试品细菌内毒素检查 例某葡萄糖注射液 其内毒素限值为0 5EU ml 设所用鲎试剂的灵敏度为0 125EU ml MVD CL 0 5 0 125 4将样品进行4倍稀释 并做4倍稀释下的供试品阳
