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1、线性评价及分析测量 范围的确定 陈明 湖南 长沙 参考材料 nCLSI EP6-A ：Evaluation of Linearity of Quantitative Analytical Methods; Approved Guide-Second Edition（美国临床和实验室标 准化协会） n临床检验方法学评价P168 nWS/T 408-2012 临床化学设备线性评价指 南（中华人民共和国卫生行业标准，2013-8-1 实施） 概念 n线性(Linearity)：在给定的测量范围内，使测定结果与样 本中分析物的量直接成比例的能力。此处的测定结果指最 终的分析结果，而非仪器输出的原始信号
2、。 n线性范围(Linear Range)：实验系统最终分析结果为可接 受的线性的浓度范围，此时的非线性误差应低于允许误 差。 n分析测量范围(Analytical Measurement Range)：指患 者样本未经任何处理（稀释、浓缩或其他预处理），由检 测系统直接测量得到的可靠结果范围，在此范围内一系列 不同样本分析物的测量值与其实际浓度（真值）呈线性比 例关系。 检测系统要求 n实验操作人员要求：熟悉仪器操作、质控、校准、正确处 理样品。在进行线性评价之前，检测系统应在实验室常规 运行一段时间。 n检测系统要求：仪器应有较好的精密度及不存在明显的携 带污染。试剂在效期内并储存条件合格
3、。宜采用与评价试 剂配套的校准品或经经验证可用于此线性评价检测系统的 产品。 样品浓度水平选择 n所选用浓度水平应尽可能覆盖整个预期测定范围 并包括与临床有关的重要评价浓度，如最小测定 浓度或线性范围的最低限，不同的医学决定水平 ，最大测定浓度或线性范围的高限等。 样品（浓度水平）数量 EP6-A n证实分析测量范围有效性时：需5-7个样品，每个 样品重复测定2次。 n验证声明范围或改良方法时：需7-9个样品，每个 样品重复测定2-3次。 n建立分析测量范围时：需9-11个样品，每个样品 测定2-4次。可比预期的分析测量范围宽20-30%， 以期检测到“拐点”。 样品（浓度水平）数量 WS/T
4、 408-2012 n验证：4-6个样品，覆盖线性范围，3-4次测定。 n建立：9-11个样品，3-4次测定。如欲发现最宽的 浓度范围，可将预期测量范围加宽至130%，在此 范围内选择更多的浓度水平，然后逐渐减少数据 点直至表现出线性关系。 样品种类选择 依据产生基质效应的可能性，应尽可能按以下顺序选择样品种类 n临床混合样品 n用适当稀释液稀释的临床样品（如血清等） n添加分析物的临床样品 n用处理过的低浓度物质或处理过的血清物质稀释的临床样品 n校准品、线性物质、质控品 n使用生理盐水稀释的样品 n浓缩或过度稀释的质控品 n水溶液 n其它溶剂的溶液 样品制备 n高浓度样品可通过在低浓度水平
5、的患者样品中添 加分析物的方法制备。加入量尽可能少，原则上 少于总体积的10%。 n低浓度样品可直接从患者样本中收集，或经透 析、热处理、层析等预处理而降低分析物浓度水 平达到所需浓度。注意预处理不能改变分析物或 基质的理化特性。 样品制备 n样品稀释液应选用厂家推荐或实验室证明可使用的产品， 如5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。 n如用溶液作为样品添加剂，添加体积应小于10%，并注明 溶剂。 n避免溶血、脂血、黄疸等。 n用接近于预期的分析测量范围上限和下限（或测量低限） 的两个分析浓度的样本配成所有样本浓度。 添加分析物的建议原料 添加分析物的建议原料 分析物原料分析物原料 ALT纯酶Cr无
6、水标准品或高值患者样本 ALB白蛋白干粉，人因子片段-GT纯酶 ALP纯酶Hb洗涤后的人红细胞溶血液 AST纯酶LDH纯酶 淀粉酶唾液或胰腺提取物脂酶胰腺提取物 BIL纯胆红素，或低稀释度的高值 质控品或标准品 TP干粉白蛋白，人（首选）或牛 因子片段 胆固醇纯胆固醇或低稀释度的质控品Mg氯化镁 CK 纯酶P磷酸二氢钠或钾 CO2碳酸钠或碳酸氢钠 样品制备 样品号1234567891011 低浓度混合血清/ml5.004.504.003.503.002.502.001.501.000.500.00 高浓度混合血清/ml0.000.501.001.502.002.503.003.504.004.
7、505.00 样品号12345 低浓度混合血清/ml5.003.752.501.250.00 高浓度混合血清/ml0.001.252.503.755.00 浓度计算 n如果高/低浓度混合血清的值已知，可依据公式C=C1V1 C5V5 / V1V5计算各浓度 n如果高/低浓度混合血清的值未知，可将每种混合血清编 码。编码可代表每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样 品，编码可用整数（如1、2、3、4、5等）代表连续样 品。本实验方案不需预先知道样品浓度，在确定线性范围 时可使用样品测定结果的均值。 浓度计算 n可用计算浓度或标定浓度作为X值，仪器测量结 果或仪器输出值（均值）作为Y值。 n也可用相
8、对浓度作为X值，如浓度间为等间隔， 可用样品编号（如1、2、3、4、5等）代表X值。 n如所制备的样品系列非等间隔，其浓度间的关系 应明确，在测定时可以这些间隔间的相对比值做 为X值，此时的样品编号可以不为整数。 实验程序 n一般要求：实验人员必须熟练掌握仪器操作和维护程序、 样本准备方法和校准。 n全部实验和数据采集宜在同一试验批（run）内或者相隔 简短的实验批中完成（在一天内完成）。样本随机排列。 有显著携带污染时，应用空白隔开样本。每个浓度样本重 复测定2-4次。记录分析结果。 初步数据检查 EP6-A n以样本浓度或相对浓度为X轴，测定浓度为Y轴绘制散点 图，将各样品测定均值画在图上
9、，用手工或计算机方法将 这些均值点连接起来，观察各测定值与均值连线的大致偏 差。 n当某个样品的某测定值明显偏离其它测定值时，目视判断 它是个离群点。 n单个离群点可从数据组中剔除，如发现两个或两个以上离 群点应考查造成误差的可能原因，纠正后对整套样品重新 测定。 初步数据检查 EP6-A n目视检查散点图可很容易发现非线性或实 验样品浓度范围过宽或过窄，同时还可以 为后续的统计分析选择合适的统计方法提 供依据。 检测离群点WS/T 408-2012 检测离群点 多项回归分析 n将测定数据进行多项回归分析，得出一级、二级、三级多 项式，此步骤可用统计学软件（如SPSS, SAS）完成。 阶数多
10、项式回归自由度 一阶y=b0b1x2 二阶y=b0b1xb2x23 三阶y=b0b1xb2x2b3x34 多项式回归方程模式 n一级多项式模型为直线，这是判断某种方法是否 为线性的最适方程。 n二级多项式模型为一种抛物线反应曲线，有增加 趋势（曲线上升）或减少趋势（曲线下降）两 种。 n三级多项式模型代表一种“S”形反应曲线，在测量 范围的两端呈非线性。 多项式回归分析思路 n第一步判断用非线性多项式拟合数据是否 比线性好。 n第二步判断最适非线性模型与线性拟合之 间的差值是否小于预先设定的该方法的允 许偏差。 符号与缩略语 回归方程的线性检验 n t = bi / SEi bi-回归系数 S
11、Ei -每个非线性系数的标准误 n自由度 df=LRRdf L-样本数 R-每个样本的测定次数 Rdf-回归自由度，即回归方程中系数（包括b0）的个数 回归方程的线性检验 n当检测到非线性时，通过计算回归标准误(sy.x)， 确定最优的二次或三次多项式回归方程， sy.x是 测量均值与回归方程对应值的差值量度，反应样 本回归系数与总体回归系数之间的抽样误差。因 而sy.x越小，说明该回归方程越适合数据组。 回归方程的线性检验 n多元回归方程二阶模式中b2为非线性系数，三阶 模式中b2和b3为非线性系数，每个SEi可由回归计 算程序得出。对非线性回归系数b2和b3做 t 检验， 判断回归系数与0
12、是否有显著性差异。如回归系数 与0有显著差异(P0.05)，则该组数据存在非线 性。前两个系数b0与b1因不反映非线性故不需检 验。 回归方程的线性检验 n如二级多项式L = 5，R = 2，Rdf = 4，df = 52-4 = 6。在t 值表中寻找t界值（双侧检验，=0.05），如非线性系数b2t t0.05(df)，则差异无显著性（P0.05），数据组被认为具 线性。此时可对数据组进行精密度检验，精密度符合线性 判断要求时，数据分析结束并得出结论为数据组具有统计 学线性或一阶线性。如任一非线性系数具显著性（P0.05 ），数据组则为非线性。此时应进行临床标准的线性与非 线性检验。 非线性
13、程度判断临床标准的线性与非 线性检验 n线性评价是为临床服务。 n多项式回归是强调利用统计学方法判断线性，没有考虑临 床允许有一定的误差。 n临床实验室或生产厂家可根据临床上对方法测定误差的具 体要求制定本室的线性判断标准或称允许误差。 nWS/T408-2012设定统计量PctBnd，对大多数分析物 PctBnd取5%。 非线性程度判断WS/T408-2012临床 标准的线性与非线性检验 非线性程度判断WS/T408-2012临床 标准的线性与非线性检验 将ADL与临界值表比较，ADL小于临界值，判定为临床可接受 的非线性，即二阶或三阶线性。否则判定为临床不可接受的 非线性，即非线性。 P标
14、注P的表格表示最优拟合方程的精密度太差，无法进行 线性判断 非线性程度判断-EP-6A n计算每一个浓度处的线性偏离(deviation from linearity.DL) DLip(xi) (b0bixi) x的取值范围x1到xs， p(xi) 为最适多项式回归模型在xi处的 值，因而 DLi为在每个不同浓度处二次或三次多项式模型 与一次多项式（线性）模型的差值，也即非线性模型与线 性模型在每个浓度点的差值。 nDLi可为绝对值，或将每个DLi除以该浓度已知值或测量均 值再乘以100%。 非线性程度判断-EP-6A n将每个浓度的DLi与设定的误差范围比较，如DLi 设定误差，则非线性误差
15、小于设定目标，采用 线性方式处理患者结果引入的误差不超过临床允 许误差，临床上可接受。 非线性程度判断-EP-6A n如果任一点超过设定误差，则代表该点可能是非线性，可 按以下两种方法处理： n寻找非线性的原因：样品准备、干扰、仪器校准等，进行 纠正。 n观察散点图，如非线性点位置在两端，可先删除太大的点 并重新进行统计分析，但这样会缩小线性范围。 WS/T408-2012EP6-A 参数ADL，计算较复杂参数DL，计算简单 评估整个稀释范围的非线性程 度。 评估每个稀释浓度的非线性程 度。 可得出更宽的线性范围可能缩小线性范围 可用来对不同实验室或不同方 法之间进行比较。可能一些非 线性点得
16、出线性结论。 更适合于实验室日常操作。当 呈曲线关系的数据用直线回归 时，直线回归估计值明显偏高 ，用估计值（非测量均值）计 算导致差异超过5%，得出非线 性结论。 两种方法比较 两种方法比较 WS/T408-2012EP6-A 精密度检验评估所有数据与 最优拟合值的差异 精密度检验只评估每个浓度 点数据与均值的差异 n多项式回归分析要求具有较高的测量精密 度，否则会降低统计功效。 n采取对明显的非线性不作判断，剔除离群 值，检验测量数据的精密度的措施，达到 有足够统计功效的目的。 数据的精密度检验WS/T408-2012 精密度判断 精密度判断EP6-A 精密度判断EP6-A n如Sr不精密度设定目标，则数据组精密度 太低，
