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1、一步一步教你如何做系统进化树一步一步教你如何做系统进化树 在此介绍几个进化树分析及其相关软件的使用和应用范围。这几个软件分别是 PHYLIP、 PUZZLE、PAUP、TREEVIEW、CLUSTALX 和 PHYLO- WIN（LINUX） 。 在介绍软件之前，我先简要地叙述一下有关进化树分析的一些方法学问题。 进化树也称种系树，英文名叫“Phyligenetic tree”。对于一个完整的进化树分析需要以下几个 步骤： 要对所分析的多序列目标进行排列（To align sequences） 。做 ALIGNMENT 的软件 很多， 最经常使用的有 CLUSTALX 和 CLUSTALW，
2、前者是在 WINDOW 下的而后者是在 DOS 下的。 要构建一个进化树（To reconstrut phyligenetic tree） 。构建进化树的算法主要分为两 类：独立元素法（discrete character methods）和距离依靠法（distance methods） 。所谓独立元 素法是指进化树的拓扑形状是由序列上的每个碱基/氨基酸的状态决定的（例如：一个序列上 可能包含很多的酶切位点，而每个酶切位点的存在与否是由几个碱基的状态决定的，也就是 说一个序列碱基的状态决定着它的酶切位点状态，当多个序列进行进化树分析时，进化树的 拓扑形状也就由这些碱基的状态决定了） 。 而距离
3、依靠法是指进化树的拓扑形状由两两序列的 进化距离决定的。进化树枝条的长度代表着进化距离。独立元素法包括最大简约性法 （Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods） ；距离依靠 法包括除权配对法（UPGMAM）和邻位相连法（Neighbor- joining） 。 对进化树进行评估。 主要采用 Bootstraping 法。进化树的构建是一个统计学问题。我们所构建出来的进化树只是 对真实的进化关系的评估或者模拟。如果我们采用了一个适当的方法，那么所构建的进化树 就会接近真实的“进化树” 。模拟的进化树需要一种数学方法来
4、对其进行评估。不同的算法有 不同的适用目标。一般来说，最大简约性法适用于符合以下条件的多序列：i 所要比较的序 列的碱基差别小，ii 对于序列上的每一个碱基有近似相等的变异率，iii 没有过多的颠换/转 换的倾向，iv 所检验的序列的碱基数目较多（大于几千个碱基） ；用最大可能性法分析序列 则不需以上的诸多条件，但是此种方法计算极其耗时。如果分析的序列较多，有可能要花上 几天的时间才能计算完毕。UPGMAM（Unweighted pair group method with arithmetic mean） 假设在进化过程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的变异率，也就是存在着一个分子钟。这种算 法
5、得到的进化树相对来说不是很准确，现在已经很少使用。邻位相连法是一个经常被使用的 算法，它构建的进化树相对准确，而且计算快捷。其缺点是序列上的所有位点都被同等对待， 而且，所分析的序列的进化距离不能太大。另外，需要特别指出的是对于一些特定多序列对 象来说可能没有任何一个现存算法非常适合它。 最好是我们来发展一个更好的算法来解决它。 但无疑这是非常难的。我想如果有人能建立这样一个算法的话，那他（她）完全可以在 生物秀-专心做生物 Proc.Natl.Acad.Sci.USA.上发一篇高质量的文章。 下面介绍几个软件的使用。首先是 PHYLIP。其是多个软件的压缩包，下载后双击则自动 解压。 当你解
6、压后就挥发现 PHYLIP 的功能极其强大， 主要包括五个方面的功能软件： i， DNA 和蛋白质序列数据的分析软件。 ii， 序列数据转变成距离数据后， 对距离数据分析的软件。 iii， 对基因频率和连续的元素分析的软件。iv，把序列的每个碱基/氨基酸独立看待（碱基/氨基酸 只有 0 和 1 的状态）时，对序列进行分析的软件。v，按照 DOLLO 简约性算法对序列进行分 析的软件。vi，绘制和修改进化树的软件。在此，我主要对前两种功能软件进行说明。 我们现在有几个序列如下： Mo3 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGCACGGTACCAT Mo5
7、ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo6 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo7 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT Mo8 ATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACAGTACCAT Mo9 ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo12 ATGTATTTCGTACATTACTG CCA
8、GCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT Mo13 ATGTATCTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCAT 要对这 8 个序列进行进化树分析，按照上面的步骤，首先用 CLUSTALX 排列序列，输出格式 为 *.PHY。用记事本打开如下图： 图中的 8 和 50 分别表示 8 个序列和每个序列有 50 个碱基。然后，打开软件 SEQBOOT，如 下图： 生物秀-专心做生物 按路径输入 刚才生成的 *.PHY 文件，并在 Random number seed (must be odd) ?的下面输入一个 4N+1 的 数字后，屏幕显示如
9、下： 图中的 D、J、R、I、O、1、2 代表可选择的选项，键入这些字母，程序的条件就会发生改变。 D 选项无须改变。J 选项有三种条件可以选择，分别是 Bootstrap、Jackknife 和 Permute。文章 上面提到用 Bootstraping法对进化树进行评估， 所谓Bootstraping法就是从整个序列的碱基 （氨 基酸）中任意选取一半，剩下的一半序列随机补齐组成一个新的序列。这样，一个序列就可 以变成了许多序列。一个多序列组也就可以变成许多个多序列组。根据某种算法（最大简约 生物秀-专心做生物 性法、最大可能性法、除权配对法或邻位相连法）每个多序列组都可以生成一个进化树。将
10、 生成的许多进化树进行比较，按照多数规则（majority- rule）我们就会得到一个最“逼真”的 进化树。Jackknife 则是另外一种随机选取序列的方法。它与 Bootstrap 法的区别是不将剩下的 一半序列补齐，只生成一个缩短了一半的新序列。Permute 是另外一种取样方法，其目的与 Bootstrap 和 Jackknife 法不同，这里不再介绍。R 选项让使用者输入 republicate 的数目。所谓 republicate 就是用 Bootstrap 法生成的一个多序列组。根据多序列中所含的序列的数目的不同 可以选取不同的 republicate。当我们设置好条件后，键入
11、 Y 按回车。得到一个文件 outfile Outfile 用记事本打开如下： 这个文件包括了 100 个 republicate。 打开 DNAPARS（最大简约性法）或 DNAML（最大可能性法）软件。将刚才生成的 outfile 文件更名后输入。如下图： 生物秀-专心做生物 选项 O 是让使用者设定一个序列作为 outgroup。一般选择一个亲缘关系与所分析序列组很接 近的序列作为 outgroup（本例子不选 outgroup） ，outgroup 选择的好坏将直接影响到最后的进 化树的好坏。选项 M 是输入刚才设置的 republicate 的数目。设置好条件后，键入 Y 按回车。
12、生成两个文件 outfile 和 treefile。 Outfile 打开如下图： 该文件包括了 227 个进化树。Treefile 可以用 TREEVIEW 软件打开同样包含了这 227 个进化 生物秀-专心做生物 树。 打开 CONSENSE 软件，将刚才生成的 treefile 文件更名后输入。如下图： 键入 Y 按回车。生成两个文件 outfile 和 treefile。Treefile 用 TREEVIEW 打开，如下图： Outfile 打开如下图： 生物秀-专心做生物 我们看出两个树是同样的。但在 outfile 的树上的数字表示该枝条的 Bootstrap 支持率（除以 100
13、.6） 。到现在，8 个序列的进化树分析（最大简约法）已经完成。 如果要用邻位相连法对这 8 个序列进行分析的话，也首先执行 SEQBOOT 软件将这 8 个序 列变成 100 个 republicate。然后，打开 DNADIST 软件，把 SEQBOOT 生成的文件输入，如 下图： 选项 D 有四种距离模式可以选择，分别是 Kimura 2- parameter、Jin/Nei、Maximum- likelihood 和 Jukes- Cantor。选项 T 一般键入一个 15- 30 之间的数字。选项 M 键入 100。运行后生成文件 生物秀-专心做生物 如下图： 这个文件包含了与输入文
14、件相同的 100 个 republicate， 只不过每个 republicate 是以两两序列的 进化距离来表示。文件中的每个 republicate 都省略了第一排的 Mo3 Mo5 Mo6 Mo7 Mo8 Mo9 Mo12 Mo13。以这个输出文件为输入文件，执行 NEIGHBOR 软件。如下图： 选项 M 键入 100。生成两个文件 outfile 和 treefile 用记事本和 TREEVIEW 打开后，发现这两 个文件都含有 100 个进化树。再将 treefile 文件更名后输入 CONSENSE 软件，又得到两个文 件 outfile 和 treefile，这就是最后的结果。
15、以上是对 DNA 序列的分析，如果要对蛋白质序列 进行分析， PROTDIST、 PROTPARS 等软件。 其他软件的用法可以参照 PHYLIP 的 documents。 下面介绍 PUZZLE 软件。它是用最大可能性的方法来构建进化树的一个软件，并且对树 进行 bootstrap 评估。该软件搜寻进化树时用的算法是 quartet puzzling，这个算法相对较快， 生物秀-专心做生物 但如要分析的序列较多时，也相当耗时。另有 LINUX 版，运行起来相对较快。PUZZLE 的输 入格式为 PHYLIP INTERLEAVED。CLUSTAL 可以生成此格式文件。PUZZLE 的界面与 PHYLIP 类似，也是 MS- DOS 下的软件。 PHYLO- WIN 是 LINUX 下的一个软件。界面友好，极易操作。该界面如下图： Puzzle: http/:www.tree- puzzle.de Phylo- win: http/:www.evolution.bmc.uu.se Phylip、Treeview and Clustalx: http/: 生物秀-专心做生物
