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1、 分类号 学号D200777332 学校代码 10487 密级 博士学位论文博士学位论文 炎症因子 Daintain/AIF-1 对胰腺细胞 功能影响的研究 学位申请人：黄欣媛 学 科 专 业 ：生物化学与分子生物学 指 导 教 师 ：陈正望 教授 答 辩 日 期 ：2011 年 7 月 28 日 A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy Functional Research of Inflammatory Cytokin
2、e Daintain/AIF-1 on Pancreatic Cells Ph.D.Candidate : Huang Xinyuan Major : Biochemistry and Molecular Biology Supervisor : Prof. Chen Zhengwang Huazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China July , 2011 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用
3、的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在以上
4、方框内打“”） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 本论文属于 I 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 摘摘 要要 Daintain（大炎肽）是 1994 年由 Chen 等从猪的小肠中分离纯化出的一种新的 生物活性蛋白，其氨基酸序列与 1995 年由 Utans 等人在大鼠心脏移植排斥反应中 克隆出的巨噬细胞因子 Allograft Inflammatory Factor-1（同种异体移植炎症因子-1， AIF-1）高度同源（90%） ，两者属不同物种来源的同一蛋白质，故并称为 Daintain/AIF-1。Dain
5、tain/AIF-1 分子量 17kD，主要由激活的巨噬细胞表达和分泌， 是一种多功能的细胞因子，广泛参与炎症和免疫相关的多种疾病的发生发展过程， 如血管病变、移植排斥、肿瘤以及自身免疫疾病等。 1 型糖尿病糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitum,T1DM)是一种 T 淋巴细胞介导的 自身免疫疾病，以胰岛炎引发的胰岛 细胞的选择性破坏为特征。在发病前的胰 岛炎阶段，活化的巨噬细胞、T 淋巴细胞等大量浸润胰岛，释放出炎症介质如细胞 因子和 NO 等协同作用，引起 细胞凋亡、坏死以及胰岛素分泌异常等功能损伤， 进而发展为 T1DM。目前 T1DM 发病的分子机理还未完全阐明，但大
6、量研究表明 炎症和免疫相关的细胞因子在这一进程中起着关键作用。我们的前期研究发现 Daintain/AIF-1 在正常胰腺组织中不表达，但在 T1DM 模型 BB 大鼠侵润胰腺的巨 噬细胞中大量表达， 表明炎症因子 Daintain/AIF-1 与 T1DM 的发病机理有关， 但具 体机制仍未明确。 为了研究 Daintain/AIF-1 在 T1DM 发病中的作用， 本论文主要开 展了以下工作： 第一部分：以大鼠 细胞系 INS-1 为实验模型，在细胞水平上研究了 Daintain/AIF-1 对 T1DM 中 细胞功能异常的影响。 在细胞培养基中添加不同浓度 的 Daintain/AIF-
7、1 刺激后，检测 INS-1 细胞活力、凋亡、周期、胰岛素分泌和 NO 产量的变化，结果发现： 1. Daintain/AIF-1 对 INS-1 细胞具有毒性作用，能抑制细胞活力。 2. Daintain/AIF-1 能够诱导 INS-1 细胞的凋亡，特别是早期凋亡。提示 Daintain/AIF-1 可能在凋亡的起始阶段起刺激性作用，最终导致 INS-1 细胞活力的 II 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 降低。 3. Daintain/AIF-1 不影响 INS-1 细胞的基础胰岛素分泌，但是抑制了 20mM 葡 萄糖条件下的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（
8、GSIS）水平，说明 Daintain/AIF-1 损伤了 INS-1 细胞的葡萄糖反应性，这是 Daintain/AIF-1 对 INS-1 细胞毒性作用的另一个 方面。 4. Daintain/AIF-1 显著提升了 INS-1 细胞的 NO 产量，推测 NO 水平的上升可 能和细胞凋亡的增加和 GSIS 的下降有关，可能是 Daintain/AIF-1 诱导的 细胞毒 性作用的机制之一。 5. Daintain/AIF-1 影响 INS-1 细胞周期，将细胞阻滞在 G0/G1 期，使得进入 S 期和 G2/M 期的细胞减少，以此来抑制细胞增殖，且 Daintain/AIF-1 浓度越大，
9、作 用越明显。 第二部分：寻找 Daintain/AIF-1 在胰腺中的相互作用蛋白，为深入了解 Daintain/AIF-1对细胞毒性作用机制提供思路。 采用Clontech MatchmakerTM GAL4 酵母双杂交系统 3 来进行人胰腺 MatchmakerTM cDNA 文库中 Daintain/AIF-1 相互 作用蛋白基因的筛选，主要结果为： 1. 构建了诱饵质粒 pGBKT7-Daintain/AIF-1，经检测可以在 AH109 酵母中正 确表达出诱饵融合蛋白 BD-Daintain/AIF-1，对酵母细胞无毒性，且没有自激活性。 2. 扩增了人胰腺 cDNA 文库，转化入
10、 AH109/pGBKT7-Daintain/AIF-1 酵母， 涂布 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 平板并进行 -半乳糖苷酶活性检测，初步筛选出 64 个 Ade+ His+lacZ+三阳性候选酵母克隆。 3. 进行回转实验和一对一验证实验排除假阳性，结果仅获得 1 种文库质粒。 对其 cDNA 插入片段测序后 Blast 比对并进行阅读框分析， 发现该片段翻译时发生 了移码，仅表达出一段 32 个氨基酸残基的未知小肽段，说明该质粒是假阳性。本 次筛选未获得阳性结果，是酵母双杂交系统假阳性率非常高这一重大缺陷的一次 实例。 综上，本研究首次发现 Daintain/AIF-1
11、对 INS-1 细胞具有毒性作用， Daintain/AIF-1 可能通过将细胞阻滞在 G0/G1 期来抑制细胞增殖，以及上调 NO 产 III 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 量来刺激细胞凋亡和损伤胰岛素分泌。 这说明细胞因子 Daintain/AIF-1 促进了 细 胞的功能异常，在 T1DM 的起始和发展中起重要的推动作用。 关键词：关键词：Daintain/AIF-1，酵母双杂交，1 型糖尿病，INS-1 细胞，细胞毒性，胰岛 素分泌 IV 华华 中中 科科 技技 大大 学学 博博 士士 学学 位位 论论 文文 Abstract In 1994,
12、 a bioactive polypeptideDaintain was isolated and characterized from porcine intestines by Chen et al. In 1995, Allograft inflammatory factor-1 (AIF-1) was cloned by Utans et al from activated macrophages of rat atherosclerotic allogenic heart grafts. Daintain and AIF-1 of pig, rat, and human origin
13、 are identical proteins with only species-specific amino acid differences. Hence, we call the polypeptide Daintain/AIF-1. Daintain/AIF-1 is a 17kD cytokine that expressed mainly in macrophages and activated T cell. It is regarded as a novel multifunctional inflammatory factor that plays important ro
14、les in allograft rejection, vasculopathy, cancer, and autoimmune diseases. Type 1 (Insulin-dependent) Diabetes Mellitum (T1DM) is characterized by a progressive autoimmune-mediated insulitis culminating in the death of pancreatic cells. The cell secretory dysfunction and apoptosis in the course of i
15、nsulitis are perhaps caused by direct contact with activated T-cells and macrophages, and/or exposure to inflammatory mediators secreted by these cells, including cytokines and NO. We have previously observed a particularly dense accumulation of Daintain/AIF1-immunoreactive macrophages in the insulitis affecting the pancreatic islets of prediabetic BB rats, suggesting that Daintain/AIF-1 have a role in connection with the pathogenesis of T1D. In this study, we aimed to investigate further the role of Daintain/AIF-1 in the pathogenesis of
