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1、中山大学 博士学位论文 大黄素叠氮甲基蒽醌衍生物AMAD抗肿瘤作用及机制研究 姓名：闫燕艳 申请学位级别：博士 专业：肿瘤学 指导教师：符立梧 20090520 中山人学博士学位论文大黄素叠氮甲基蒽醌衍生物A M A D 抗肿瘤作用及机制研究 大黄素叠氮甲基蒽醌衍生物A M A D 抗肿瘤 一、研究背景 作用及机制研究 专业： 博士研究生： 导师： 肿瘤学 闰燕艳 符立梧教授 中文摘要 癌症具有较高的发病率和致死率，严重威胁着人类的健康和生命。每年全世 界约有7 0 0 万人死于癌症，并且近几年肿瘤的死亡率呈明显上升趋势。目前，化疗 是治疗肿瘤的主要手段之一，因此新药的开发仍然是寻找攻克肿瘤的
2、途径之一。 H E R 2 n e u 过表达与肿瘤的发生、转移、肿瘤血管形成、抗凋亡及化疗耐药 等有关。针对H E R 2 n e u 的抗体H e r c e p t i n 以及小分子酪氨酸激酶抑制剂L a p a t i n i b 已经被美国F D A 批准在临床应用，对H E R 2 n e u 过表达的肿瘤具有很好的治疗 效果。然而K 期使用L a p a t i n i b 和H e r c e p t i n 的病人出现耐药、严重的副作用和费 用高等不利因素，因此有必要开发新的针对H E R 2 n e u 的治疗策略。 中药足中华民族的瑰宝，几千年来在防病治病上立下了不可磨
3、灭的功绩，至 今仍被广泛使用。随着现代科学技术的发展，人们开始深入研究中药对疾病的作 用及原理，甚至从分子水平及基因水平上来研究其作用机制，以期找到新的化学 药物实体，或扩大其治疗范围或增加新的适应征，达到充分挖掘中药的潜力为人 类健康服务的目的。近年来，从中药中筛选抗肿瘤药物己经成为国内外研究的热 点。人们希望通过对中药抗肿瘤作用和机制的研究寻找到新的、更有效的抗肿瘤 药物，提高恶性肿瘤的治愈率。 大黄素属单葸环类l ，8 二羟基葸醌衍生物，与阿霉素、柔红霉素等抗癌药同 l ，I J J 大学博：l ：学位论文 大黄素叠氮甲基葸醌衍生物A M A D 抗肿瘤作用及机制研究 属葸醌类化合物，结
4、构式是l ，3 ，8 三羟基6 一甲基蒽醌，是大黄、虎杖、何首乌等 多种中药的有效成分之一。大黄素药理作用广泛，具有免疫调节、抗菌、抗炎、 抗肿瘤等方面的作用。近来来研究表明大黄素体内外可以抑制多种肿瘤细胞如乳 腺癌、肺癌、结直肠癌以及前列腺癌增殖，诱导其凋亡；也能通过诱导肿瘤细胞 发生分化或增强肿瘤细胞对化疗药的敏感性而发挥抗肿瘤作用。研究表明，大黄 素可以有效地抑制H E R 2 n e u 蛋白酪氨酸激酶的活性，并且能够增加H E R 2 n e u 过表达肿瘤细胞对化疗药的敏感性。这些都表明大黄素可能是一种最具潜质的抗 肿瘤药物，其C l 和C 3 位点被认为是抗肿瘤作用的重要功能位置
5、，因此国内外 许多学者对此倾注了大量的心血。然而，相对于其他中药单体如紫杉醇、喜树碱 等来说，大黄素抗癌活性并不高并且具有心脏毒性等副作用，从而限制了它在肿 瘤化疗方面的临床应用。因此，我们与中山大学化学与化学工程学院古练权教授 课题组合作，以大黄素母核为先导结构，通过相应的结构改造合成了一系列葸醌 衍生物，其中6 一叠氮甲基1 羟基3 ，8 二甲氧基9 ，1 0 葸醌( A M A D ) 是从中筛选 出的一种抗癌效果最强的化合物，我们对该化合物进行了一系列体内外抗肿瘤活 性研究。体内实验结果表明A M A D 能明显抑制非小细胞肺癌H 4 6 0 细胞裸鼠移 植瘤的生长。C T X 阳性对
6、照组及A M A D 实验组( 5 0 、1 0 0 、及2 0 0m g k g ) 的抑 瘤率分别为7 4 3 、2 0 7 、4 1 3 及5 0 7 。整个实验中未出现裸小鼠死亡及 体重减轻。说明大黄素A M A D 具有良好的开发前景，值得进一步研究。本论文 选用H E R 2 n e u 过表达的人类乳腺癌细胞株M D A M B 4 5 3 及人类肺腺癌细胞株 C a l u - 3 为研究对象，重点深入研究了A M A D 诱导H E R 2 n e u 过表达肿瘤细胞凋 亡，抑制其生长以及促进H E R 2 n e u 蛋白降解的分子机制，为H E R 2 n e u 过表达
7、 肿瘤的治疗提供新的实验依据。 二、方法 以H E R 2 n e u 过表达的人类乳腺癌细胞株M D A M B - 4 5 3 及人类肺腺癌细胞 株C a l u 一3 为研究对象，M T T 法检测大黄素叠氮甲基蒽醌衍生物A M A D 对这两 种细胞的细胞毒作用；H o e c h s t 3 3 2 5 8 染色并在荧光显微镜下观察A M A D 作用后 细胞凋亡的形态学改变；A n n e x i nV P I 双染法分析细胞凋亡率；D N A 琼脂糖凝 胶电泳检测A M A D 能否与D N A 发生嵌合作用：以D i O C 6 为探针，流式细胞仪 中山人学博f j 学位论文大
8、黄素叠氮甲基蒽醌衍生物A M A D 抗肿瘤作用及机制研究 检测线粒体膜电位( A q m ) ；以D C F H D A 为探针，流式细胞仪测定细胞内活性 氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，R O S ) 水平；W e s t e r nB l o t 方法研究细胞凋亡及牛存 通路相关蛋白的变化。R T P C R 检测H e r - 2 n e u 转录水平的变化：蛋白T u r n o v e r 实验检测H E R 2 n e u 蛋白的稳定性；荧光显微镜观察H E R 2 n e u 蛋白在细胞中定 位的变化：免疫沉淀检测H E
9、R 2 n e u 蛋白的泛素化改变及与其分子伴侣G r p 9 4 结 合情况。R N A 干扰技术用于沉默H e r - 2 n e u 的表达。 三、结果 ( 一) 、A M A D 诱导M D A M B 4 5 3 和C a l u - 3 细胞发生凋亡及机制研究 1 M T T 法体外筛选A M A D 对H E R 2 n e u 过表达肿瘤细胞的细胞毒作用 大黄素A M A D 对H E R 2 n e u 过表达的人类乳腺癌M D A M B 4 5 3 和人类肺 腺癌C a l u 一3 细胞表现出强的细胞毒作用，I C 5 0 值分别为9 0 6 0 9 5um o l
10、L 和0 8 3 0 2 1um o l L ，而对鼠正常成纤维母细胞N I H 3 T 3 的I C 5 0 值大于 1 0 0um o l L 。以上数据提示这种新的大黄素衍生物可能具有潜在的抗H E R 2 n e u 高表达肿瘤的作用，因此本论文将重点探讨大黄素A M A D 对这两种细胞的作用机 制，为H E R 2 n e u 过表达肿瘤的治疗提供实验依据。 2 A M A D 诱导M D A M B 一4 5 3 和C a l u - 3 细胞发生凋亡 为了证实A M A D 足否能诱导M D A M B - 4 5 3 和C a l u - 3 细胞凋亡，我们采用 多种研究方法
11、检测A M A D 对细胞的凋亡作用。2 3 0 、4 6 0 、9 2 0l x m o l L 和0 7 5 、 1 5 0 、3 O Ol lm o l L 的A M A D 分别作用于M D A M B 一4 5 3 和C a l u 一3 细胞4 8h 后， H o e c h s t3 3 2 5 8 染色在荧光显微镜下可见对照组细胞呈均匀弥散浅蓝色荧光，凋 亡细胞可见浓染致密的颗粒状荧光，并有典型的凋亡小体形成。A n n e x i nV P I 双 染结果显示A M A D 浓度依赖性地诱导这两种肿瘤细胞凋亡，而即使l0 0g m o l L A M A D 也不能诱导鼠正常
12、纤维母细胞N I H 3 T 3 发生凋亡。W e s t e r nB l o t 检测进一 步检测到凋亡经典指标C a s p a s e 一3 及P A R P 的裂解活化。以上结果均证实A M A D 能诱导M D A M B 4 5 3 和C a l u - 3 细胞发生凋亡。 r f l 山人学博二l ：学位论文 人黄素叠氮甲基葸醌衍生物A M A D 抗肿瘤作用及机制研究 3 A M A D 诱导M D A M B 一4 5 3 和C a l u - 3 细胞发生凋亡的机制研究 3 1A M A D 与D N A 之间无嵌合作用 大黄素A M A D 同属葸醌类化合物，为了考察A
13、 M A D 是否与D N A 发牛嵌合 从而诱导细胞凋亡，我们设计了D N A 嵌合实验。结果表明，在A M A D 与D N A 的反应体系中，A M A D 作用不同时间、不同浓度下的D N A 荧光强度与对照相 比无改变，而在己知的D N A 嵌合剂表阿霉素( E p i r u b i c i n ，E D R ) 作用下，D N A 荧 光强度与对照相比呈浓度和时问依赖性降低。结果提示E D R 能够与D N A 发牛 嵌合反应，而A M A D 与D N A 未发生嵌合反应，A M A D 不是通过与D N A 发生 嵌合来诱导细胞凋亡的。 3 2A M A D 诱导的凋亡是通过
14、R O S 非依赖性的线粒体凋亡通路 A M A D 诱导的凋亡是否与线粒体凋亡途径有关呢? 我们对线粒体膜电位 ( A L F m ) 的检测。结果表明，A M A D 能诱导A V m 改变；同时A M A D 还诱导细胞 内活性氧( R O S ) 水平的下降，并且加入抗氧化剂一还原型谷胱甘肽( r e d u c e d g l u t a t h i o n eh o r m o n e ，G S H ) 也不能对抗A M A D 诱导的细胞凋亡，提示A M A D 诱 导的这两种细胞凋亡是R O S 非依赖性的。W e s t e r nB l o t 检测结果表明A M A D
15、诱 导的凋亡过程包括细胞色素C ( C y t o c ) 由线粒体释放至胞浆，C a s p a s e 一9 活化裂 解。以上结果提示，A M A D 可能通过引起细胞线粒体膜电位( A q J m ) 改变进一步 导致C y t o c 从线粒体释放入胞浆，进而C a s p a s e 一9 、C a s p a s e 一3 及P A R P 依次裂解 活化从而诱导线粒体途径的凋亡。 3 3 A _ M A D 还可通过死亡受体途径诱导M D A M B 4 5 3 及C a l u - 3 细胞凋亡 为了探讨A M A D 诱导的凋亡是否与死亡受体途径有关，我们用W e s t e
16、 r nB l o t 方法检测了死亡受体途径的肩动C a s p a s e 即C a s p a s e 8 ，结果发现在两种细胞均 出现了C a s p a s e 8 的裂解；还出现了卜游分子B i d 的裂解活化，这表明A M A D 还 可通过死亡受体途径诱导凋亡。 3 4A M A D 诱导M D A M B 一4 5 3 及C a l u 一3 细胞凋亡的线粒体途径依赖于死亡受 体途径 有文献研究表明，B i d 的裂解形式t B i d 可启动线粒体凋亡途径；本研究中， A M A D 诱导的凋亡既有线粒体途径的参与又有夕E 亡受体途径的参与，并且还观 察到B i d 的裂解。为了考察A M A D 诱导的线粒体凋亡途径是否依赖于死亡受体 一T V 中山人学博- t 学位论文大黄素叠氮甲基蒽醌衍生物A M A D 抗肿瘤作用及机制研究 途径，我们进行了C a s
