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1、南方医科大学2 0 0 7 级硕士学位论文 骨髓源神经干细胞联合基质胶修复大鼠脑损伤及动态 M E M R I 成像大鼠视皮层实验研究 T r a n s p l a n t a t i o no fB M S C D N S C sw i t hM a t r i g e lf o rt r e a t m e n to f b r a i ni n ju r yi nr a t sa n dd y n a m i cM E M R I i m a g i n g r a tv i s u a lc o r t e x 课题来源：国家自然科学基金( U 0 6 3 2 0 0 8 ，3 0
2、7 7 2 2 3 2 ，3 0 8 0 1 1 8 4 ，3 0 5 0 0 5 2 6 ) ，广 东省和广州市科技计划项目( N o 2 0 0 8 A 0 3 0 2 0 1 0 1 9 ，2 0 0 7 0 5 0 6 7 0 0 5 2 0 6 ， N o 0 9 8 5 2 1 2 0 11 2 2 0 0 8 A 1 E 4 0 11 6 ) 专业名称神经外科学 学位申请人张鹏 指导教师徐如祥教授 答辩委员会主席陈善成教授 答辩委员会成员陈系古教授 林志俊教授 王海军教授 张旺明副教授 论文评阅人陈善成教授 牟永告教授 张旺明副教授 2 0 1 0 年3 月2 8 日广州 硕士学
3、位论文 l I I II I II I I II III I II IIIl Y 17 6 9 9 3 3 骨髓源神经干细胞联合基质胶修复大鼠脑 损伤及动态M E I 崃I 成像大鼠视皮层实验研究 硕士研究生：张鹏 指导教师：徐如祥教授 摘要 研究背景 随着社会的不断发展，交通设施更为发达，机动车辆增多，施工工地和工 厂多，所导致的交通事故和工伤相应增加，创伤伤员逐年增多。在这些创伤中， 颅脑损伤( T r a u m a t i cb r a i ni n j u r y ，T B I ) 的发生率较高，并且是创伤致死原因中的 首要因素，在存活病例中，其致残率也较高，给患者带来极大的痛苦，也
4、给社 会和患者家人带来负担。尽管在颅脑损伤的院前救护、影像学技术、危重症急 救和康复锻炼等临床技术方面已经有了显著的进步，但治疗的目的仅在于尽可 能保存残留的神经功能，降低致死致残率，而对于已经发生的神经损害尚无有 效的治疗手段。如何促进颅脑损伤后神经再生和神经功能恢复是当前研究的热 点及难点。T B I 后修复面临的主要问题是：原发性和继发性的神经元的缺失，以 及受损部位周围的局部微环境存在一些不利于轴突再生的因素，主要有髓鞘相 关轴突生长抑制因子( N o g o - A 、M A G 、O m g p 等) 、炎症反应、细胞外基质( E C M ) 改变、胶质瘢痕的形成等，因此治疗脑损伤
5、的策略之一在于补充缺失的神经元， 改善损伤局部的微环境。虽然大量的实验已经表明，无论是在成年还是未成年 的动物中枢神经系统( c e n t r a ln e r v es y s t e m ，C N S ) 内都有神经干细胞( n e u r a ls t e m c e l l s ，N S C s ) 的存在，这类细胞群能自我更新，并且具有分化成神经元和神经胶 质细胞的能力，在一定条件下可以进行增殖、迁移和分化，在一定的程度上参 中文摘要 与修复缺损的神经功能，但是在成体中枢神经损伤后此类细胞再生能力有限， 远远不能完成神经功能再生修复的功能，特别是大面积受损的中枢神经组织， 仅靠自身
6、的神经干细胞修复是无法实现的。随着干细胞研究的不断进步，已经 有大量的研究通过自体或者异体移植不同的干细胞( 包括不同来源的成体间充 质干细胞和胚胎干细胞等) 而取得了一些令人振奋的效果，所以干细胞移植治 疗颅脑创伤后中枢神经功能缺损为我们带来了新的希望。在种子细胞来源方面， 骨髓基质细胞( B o n em a r r o ws t r o m a lc e l l s ，B M S C s ) 来源丰富易获取，有研究表明 成人骨髓基质细胞在体外可快速有效地诱导分化成为成人骨髓源性神经干细胞 ( h u m a na d u l tb o n em a r r o w d e r i v e
7、 dn e u r a ls t e mc e l l s ，M D N S C s ) ，而且成人骨髓源性 神经干细胞具有和自身脑源性的神经干细胞相似的生物学特征，如果应用于患 者自身移植，避免了可能的免疫排斥反应，并且没有伦理争议。除了要解决种 子细胞的问题外，还要改善损伤局部的微环境，使其适于神经组织的修复，同 时移植入外源性细胞替代失去功能或死亡的细胞，并与宿主细胞形成具有功能 的整合，改善神经功能缺陷。组织工程支架材料的发展为解决这一问题带来了 希望，支架材料类似于细胞外基质的结构和功能，提供种子细胞粘附的支架， 在代替细胞外基质方面起着重要的作用，目前研究的神经组织工程支架材料主
8、要有：天然生物材料、合成材料、化学修饰材料、复合材料、生物衍生材料及 纳米材料等。鉴于以上因素，本实验选用骨髓基质细胞诱导得到的神经干细胞 作为种子细胞与作为支架材料的基质胶( B DB i o s c i e n c e s ，M a t r i g e l ) 联合移植来 观察对脑损伤的修复作用。 种子细胞来源的不断丰富和组织工程支架材料的不断改进，推动干细胞移 植疗法的发展，但是在应用干细胞疗法之前我们有很多问题需要解决，其中如 何通过非侵入性的方法对干细胞在体内的迁移分化和功能情况等进行监测和评 估就是其中之一，因为移植细胞和宿主细胞之间的相互作用和功能联系的机制 还不甚清楚，而这些是
9、我们把干细胞移植疗法应用于临床之前需要解决的问题， 一种有效的非侵入性的评估干细胞移植疗法的方法对于我们制定临床策略和评 I I 硕士学位论文 价预后同样重要。在现有的多种方法中，神经影像学用于活体示踪是目前研究 最热门的方法之一，主要包括磁共振成像( m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ，M R I ) 技术， 核医学技术，荧光和生物发光技术等。通过纵向长期评价，而不需要处死动物， 活体示踪能够更好的研究移植后细胞的迁移和移植细胞发挥作用的机制，这些 不仅对于发展干细胞疗法有促进作用而且对于将来的临床应用有更大的实用价 值。 目前国内外
10、的研究多是从结构上活体示踪移植干细胞的存活和迁移，如 S P I O ( S u p e r p a r a m a g n e t i ci r o no x i d e ，S P I O ) 的应用等，但这些标记物结合影像学 活体示踪无法从功能上追踪移植细胞在宿主神经组织内的功能状态，所以我们需 要从功能上评估和示踪移植干细胞与宿主组织的功能整合。在功能成像研究方面， 以往采用的F D GP E T ( F f l u o r o - d e o x y - D - g l u c o s eP E T ) 及B O L DM R I ( b l o o do x y g e n a t
11、i o n l e v e ld e p e n d e n tM R I ) 方法只可提供区域脑组织活动的间接指标信息脑局部糖代谢 变化，尚难以直接反映神经功能活动变化，特别是尚无法在细胞水平上直接反映移 植干细胞的功能活动。由此本实验组考虑应用活性诱导锰离子增强磁共振技术进行 神经干细胞移植后功能恢复评估的前期研究。 锰离子增强磁共振成像( m a n g a n e s e e n h a n c e dM ，M E M R I ) 技术，是一 种功能磁共振成像技术。1 9 9 7 年，L i nY Ja n dK o r e t s k y A P 首次应用该技术进行 大鼠电刺激前肢后
12、脑功能成像，并阐述了M E M R I 功能成像的原理：利用神经细 胞发生电活动时电压依赖性钙离子通道开放，而锰离子作为钙离子的类似物、 可以通过开放的电压依赖性钙离子通道进入细胞，加之锰离子是一种顺磁性物 质，从而可以起到标记发生电活动的神经细胞的作用，使这些激活的区域获得 磁共振增强效果，这基于其可以通过开放的电压依赖性钙离子通道进入神经细 胞及在局部用药时可以沿神经束顺行传递这两方面特性，而且锰离子在神经功 能活动发生时迅速进入激活的神经元后，在细胞内的清除期较长，锰离子可以 在激活的神经元中持续增加聚集，这种锰离子显像时程累积效应将有助于从数 以千万计的移植细胞中捕捉到更细微、更瞬时的
13、神经元电活动，其既往应用主 I I I 较低水平。经重复测量方差分析，结果显示组间差异显著( F = 3 4 5 2 6 1 ，仁O 0 0 0 ) ， 治疗组比不治疗组m N S S 评分要低，治疗方法与时间之间有交互作用 I V 硕士学位论文 ( F = 2 0 1 9 3 ，= 0 0 0 0 ) ，提示不同治疗方法随时间的增加评分变化趋势不同。进 一步分析单独效应，结果显示除1 天外各时间点内各组间比较均有显著性差异 ( 尸均 O 0 5 ) 。 结论：B M S C D - N S C s 联合M a t r i g e l 移植组比单纯B M S C D - N S C s 移植组
14、能更 好的促进脑损伤的修复。 第二部分：动态锰离子增强磁共振功能成像大鼠视觉皮层 目的：虽然我们的前期研究表明，B M S C D N S C s 联合M a t r i g e l 移植组比单 纯B M S C D - N S C s 移植组能更好的促进神经功能恢复，但其在活体的功能情况 仍不明了，本课题组拟采用动态M E M R I 功能成像来研究B M S C D N S C s 移植后 在体内的功能情况，我们首先进行了一些成像方法上的初步研究，本部分用动 态锰离子增强磁共振技术行大鼠视觉皮层功能成像，为神经系统功能研究提供 方法学上的参考。 方法：成年雄性W i s t a r 大鼠6
15、 只，右颈外动脉插管后于连续的4 个时段分 别进行不同的处理，第一时段( 5 m i n ) 成像前不给予药物处理，无视觉刺激； 第二时段( 1 0 m i n ) 成像前经右颈内动脉应用甘露醇开放血脑屏障和注射氯化锰， 无视觉刺激；第三时段( 1 5 m i n ) 成像前仅给与氯化锰注射，给予视觉刺激；第 四时段( 5 m i n ) 成像前注射氯化锰与谷氨酸混合液，无视觉刺激；每一时段处 理后立即进行大鼠头颅磁共振成像，应用S P M 软件进行图像的配准和平滑处理， 应用M a t l a b 软件得出图像的配色图及等高线图；选取视觉皮层进行兴趣区 ( R e g i o n so f
16、i n t e r e s t ，R O I ) 分析，观察不同处理后磁共振中脑内特异性增强区域 并比较大鼠视觉皮层的信号强度，数据资料统计分析用S P S S l 3 0 软件进行，应 用配对f 检验比较第二阶段和第三阶段的差异。 结果：磁共振图像分析显示第一、二时段大鼠脑内未发现特异性增强区域， 第三时段大鼠右侧视觉皮层特异性增强，第四时段大鼠右侧脑内多个核团特异 性增强；R 0 1 分析显示第三时段处理后的视觉皮层信号强度( 1 8 9 7 + 0 1 7 2 ) 明 V 中文摘要 显强于第二时段( 1 5 4 9 + 0 1 6 3 ) ，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。 结论：本研究所采用的动态锰离子增强磁共振成像技术可用于分析大鼠视 觉皮层功能活动，也为研究神经系统功能提供了新的方法。 T r a n M a t r 硕士学位论文 s p l a n t a t i o no fB M S C - - D N S C sw i t h i g e lf o rt r e a t m e n
