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1、学校代码 1 0 5 4 2 密级 骨质疏松症相关表型的全基因组关联研究 单变量、双变量、通路及基因相互 作用分析 G e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d yf o r o s t e o p o r o s i sr e l a t e dp h e n o t y p e s _ I 7 n i V 撕a t e ，b i v a r i a t e ，p a t h w a ya n d g e n e g e n ei n t e r a c t i o na n a l y s e s 研究生姓名 指导教师姓名、职称 学科专业
2、研究方向 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一一年 四 月 中文摘要 骨质疏松症是一种以骨量减少、骨的微观结构退化以及骨脆性增 加为特征，最终容易造成低创伤性骨折的全身性骨骼疾病，它多发于 老年人，严重影响其生活质量并给社会带来巨大的经济负担。骨质疏 松症由遗传和环境共同决定，其中遗传占主要部分，其致病机理极为 复杂：1 ) 这是一种多基因疾病，由大量微效基因共同决定；2 ) 这些 基因间存在相互作用，组成一个复杂的网络；3 ) 骨质疏松症与许多 其它疾病如肥胖、糖尿病等共享一些遗传因子。引发该病的风险因子 很多，如骨密度、骨大小等，它们也是骨质疏松症遗传学研究中常用 的替代表型。通过连锁
3、分析和关联分析，人们已经鉴定了一些骨质疏 松症相关的遗传因子，但仍有大量因子未被鉴定。目前，最常用的鉴 定方法是单变量的全基因组关联分析( 分析某个标记与一种表型之间 的关系) ，它能在全基因组范围内鉴定疾病风险位点。然而，单变量 分析忽略了基因间的相互作用和基因多效性，因此无法检测到在疾病 发病机理中占据重要地位的基因间的相互作用、基因通路等，也很难 发现多效性基因及弱效应的遗传因子。本研究基于双变量关联分析、 基因通路分析、基因相互作用分析和拷贝数变异分析4 种方法探究骨 质疏松症的分子遗传机理。 1 、骨密度和体重指数的全基因组双变量关联研究 骨质疏松症和肥胖症是高度相关的疾病，它们间可
4、能共享一些遗 传因子，但目前很少有研究对这些遗传因子进行鉴定。全基因组双变 量关联分析是近年来发展出的一种检测一个分子标记与两种表型之 间关联关系的分析方法，它能检测到单变量分析中很难被发现的多效 性基因。本研究首先采用A f f y m e t r i x 公司的G e n o m e W i d eS N PA r r a y 6 0 对1 6 2 7 个中国汉族无血缘关系的成年人进行基因分型，然后用R 软件对体重指数和髋部骨密度进行双变量分析，最后发现有8 6 个 S N P 的尸值 _ 3 0 时诊断为肥胖，而B M I 4 0 则诊断为极度肥胖。W H O 的诊断标准主要针对的是欧美
5、人，由于亚洲人与欧美人在遗传和生活 习惯上都相差甚远，有些研究人员提出亚洲人群的肥胖判定应使用另 一套标准。因此，2 0 0 0 年国际肥胖特别工作组提出了亚洲成年人B M I 的标准，在这个标准中，B M I 在2 3 到2 4 9 之间为超重，B M I 在2 5 到2 9 9 之间为I 度肥胖，B M I 3 0 为I I 度肥胖。中国人群也有自己的 肥胖判定标准，2 0 0 0 年国际生命科学学会中国办事处组织多名学科 专家进行了“中国肥胖问题调查“ 。该调查分析了我国现有2 1 个省、 市、自治区、直辖市超过2 4 0 0 0 0 例数据，并于2 0 0 2 年提出了“中国 成人超重
6、和肥胖的B M I 界限值。在此标准中，当B M I 2 4 时视为超 重，B M I 2 8 视为肥胖。表2 1 显示了这三个B M I 标准的详细情况。 表2 - 1 三种B M I ( k g m 2 ) 分类标准 博士学位论文 肥胖症正对人类社会构成极大的危害。根据美国全国健康和营 养监测调查报告显示，在美国约有6 5 的成年人受到肥胖症的困扰 【7 0 1 。在中国，根据2 0 0 4 年卫生部开展的中国居民营养与健康调查的 数据显示，我国成年人超重比例达2 2 8 ，肥胖比例达7 1 ，两者的 总人数分别为3 亿和9 0 0 0 多万。另外，肥胖症的危害巨大，它不但 影响人体行动能
7、力，还影响身体健康，甚至能致人死亡。有研究表明， 肥胖症是多种高危疾病的风险因子，包括心脏病、高血压、I I 型糖尿 病等【7 l 】。 肥胖症是一种复杂疾病，它受遗传和环境等多方面影响。其中 遗传因素占较大的成分 7 2 - 7 4 】。在肥胖的遗传学研究中主要使用的表型 是B M I ，除此之外B F M 和全身脂肪量百分比( P e r c e n t a g eB o d yF a t ， P B F ) 也常作为研究表型，这些值均可由双能X 射线测定。研究发现， 肥胖症相关表型的遗传率很高。例如，同胞对研究发现B M I 的遗传 率为O 5 0 0 9 0 7 4 , 7 5 ，P
8、B F 为O 6 2 0 8 0 7 6 1 ，双胞胎研究发现B F M 的遗 传率为0 4 0 0 7 0 7 7 1 。通过连锁和关联分析，发现了大量的肥胖候选基 因。据最新版( 2 0 0 5 版) 的人类肥胖基因图谱显示，目前在人类遗 传学研究中已经发现了1 2 7 个肥胖相关基因，其中1 2 个基因至少在 1 0 个以上的研究中得到了验证( 表2 2 ) ；在动物模型研究中发现了 2 4 4 个肥胖相关基剐7 8 】 骨质疏松症相关表型的全基因组关联研究单变量、双变量、通路及基因相互作用分析 表2 2 至少在1 0 个研究中与肥胖相关的基因 2 1 3 双变量分析和单变量分析的对比
9、单变量分析在复杂疾病的遗传学研究中被广泛应用，但是它只能 研究一个分子标记与一种表型间的关系。因此，单变量分析检测多效 性基因的功效不高。对于有遗传共享的性状，决定它们的基因具有多 效性，所以应采用多变量分析方法进行鉴定 s 6 - 8 8 】。在此背景下，双变 量分析应运而生。最早的双变量分析是由A l m a s y 等人提出的双变量 连锁分析【8 9 】，它被广泛应用于多效性区域的鉴定。 随着分子标记技术的发展，又由于双变量连锁分析因定位的区域 过大，关联分析已经成为了遗传学研究的主流。因此需要开发新的多 变量关联分析法进行基因多效性的分析。目前关于此类算法的报道不 2 9 博士学位论文
10、 多，当前普遍使用的策略是采用广义估计方程( G E E ) 进行多变量分 析。G E E 模型是L i a n g 等人根据广义线性模型提出的一种分析纵向观 察资料的统计方法【9 们。该方法被P r e n t i c e 等人改进，并建立了第二套 广义估计方程( G E E 2 ) 【9 1 1 ，G E E 2 可以同时估计均数和关联结构。 基于G E E 2 ，2 0 0 3 年L a n g e 等人发展了基于家系的多变量关联分析法 【8 8 】。直到最近3 年，基于随机样本的多变量分析方法才被发展出来。 L i u 等人开发出了两个混杂性状( 同时包含数量和质量性状) 的双变 量分
11、析方法【9 2 】，P e i 等人开发了两个数量性状的双变量分析方法【9 3 】。 本研究主要采用P e i 等人开发的算法进行双变量分析，详细方法将在 后面方法学部分说明。 与单变量相比，双变量分析对于检测多效性基因具有更高的功 效。另外，进行同样数目分子标记的统计分析时，双变量分析的计算 量只有单变量分析的一半，大大减弱了多重检验的问题。 2 2 材料和方法 2 2 1 样本 本研究获得了各参与研究单位的科技处及伦理委员会的批准。所 有样本健康状况良好，并均签署了知情同意书。所有样本在进入研究 前都进行了问卷调查和身体指标的测量，并获取了受试者年龄、性别、 病史、家族史、初潮年龄、绝经年
12、龄、饮酒情况、运动情况以及饮食 情况等信息。 本研究采用骨质疏松症遗传研究中广泛应用的纳入和排除标准 1 n 骨质疏松症相关表型的全基因组关联研究单变量、双变量、通路及基因相互作用分析 对样本进行筛选t 9 4 ，9 5 1 。排除的样本包括：1 、具有严重的心脑血管疾 病后遗症的人；2 、糖尿病患者，但那些易控制的或者是非胰岛素依 赖的糖尿病病人可不被排除；3 、血清肌酸酐大于1 9 m g d l 的慢性肾 脏病人；4 、慢性肝病或者酒精中毒者；5 、显著的慢性肺病患者；6 、 接受过6 个月以上类皮质甾酮疗法的人；7 、进行过6 个月以上抗惊 厥疗法的人；8 、患有代谢性疾病或者遗传骨疾
13、病的人，如过高甲状 旁腺功能减退、帕哲病、骨软化或者成骨不全等；9 、风湿性关节炎 或者胶原病患者；1 0 、近年来患肠胃疾病较频繁的人，如，消化器官 溃疡、吸收障碍、慢性溃疡性结肠炎、局限性肠炎或者其他慢性腹泻 疾病患者等；1 1 、患有可能影响骨量的内分泌器官疾病的患者；1 2 、 甲状腺功能亢进症患者；1 3 、患有任何可能引起非基因性骨量减少的 神经或者骨骼肌疾病的患者；1 4 、所有接受过可能引起非基因性骨量 丢失治疗的人。简单的说，此标准主要是为了排除具有可能影响脂肪 或者骨代谢的慢性疾病或者状态的样本，避免假阳性结果。 本研究的样本分为两组，一组是进行初始分析的中国人群样本， 另
14、一组是进行验证分析的美国白人样本。中国样本中包含1 6 2 7 个无 血缘关系的汉族成年人( 8 0 2 个男性和8 2 5 个女性) 。所有样本来源 于湖南长沙和陕西西安的城区及其周边地区。美国白人样本包含2 2 8 6 个高加索裔无血缘关系的成年人，包括5 5 8 个男性和1 7 2 8 个女性。 所有样本来源于美国中部密苏里州堪萨斯城和内布拉斯加州奥马哈 城城区及其周边地区。 博士学位论文 2 2 2 表型及其测量 本研究选用髋部骨密度作为骨质疏松症的研究表型。髋部是骨质 疏松性骨折发生得较多的部位，而髋部骨密度则是骨质疏松症研究中 使用最多的表型。本研究中的髋部骨密度是股骨颈、转子和转
15、子间区 域骨密度的联合值。在中国人群中使用的骨密度仪是H o l o g i c4 5 0 0 W ( H o l o g i cI n c ，W a l t h a m ，M A ) ，髋部骨密度测量时的变异系数是 1 1 8 。在美国人群中使用的骨密度仪是H o l o g i c4 5 0 0 W ( H o l o g i cI n c ， B e d f o r d ，M A ) ，变异系数为1 9 4 。 本研究选用B M I 作为肥胖症的研究表型。首先用矫正后的体重 秤和测距仪测量受试者穿轻薄衣服并脱掉鞋子后的体重和身高，然后 采用体重( k g ) 除以身高( m ) 的平方进
16、行B M I 的计算。 2 2 3D N A 提取 完成表型测定后，研究人员抽取了每位受试者1 0 m l 的外周静脉 血。本研究采用标准的D N A 提取试剂盒进行D N A 提取，提取后采 用B e c k m a n 公司D U 5 3 0 核酸蛋白分析仪( B e c k m a nI n c ，F u l l e r t o n ， C A U K ) 进行浓度和纯度的测量。纯度值为2 6 0 n m 处吸光值与2 8 0 n m 处吸光值之比，当比值1 8 时表示D N A 样本纯净，比值 O 0 5 ( 表2 4 ) 。 因此，本研究择了尸值最显著的5 个S N P 作为后续研究对象。这5 个S N P 分别是r s 3 7 7 0 4 6 ( P - - 4 5 2 x 1 0 6 ) ，r s 2 1 6 6 8 5 6 ( P = - 5 4 9 x 1 0 6 ) ， r s 4 5 8 2 6 7 7 ( P = 9
