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1、博士学位论文骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病的临床研究BoneMarrowStemCellinfusionandHyperbaricOxygenTherapyinType2DiabetesMellitus研究生姓名学科及专业研究方向导师吴志贤外科学(泌尿外)糖尿病细胞治疗谭建明教授南京军区福州总医院福州2011年5月，、_手鼬，爨1，l，0寿毒渗一fIIrrllllll1lli1iluf1909373独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均
2、已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：壤鑫I疑日期：2。11年5月1日学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：壤地导师签名：渺日期：2011年5月1日日期：2011年5月1日目录摘要一1一Abs
3、tract一5一缩略词一9一第一部分人骨髓间充质干细胞体外培养、扩增及鉴定一12一前言一12一翮舌一lZ一第一节BM-MSC的分离培养一14一材料与方法一14一结果一16一第二节BM-MSC的细胞特性与临床安全性研究一18一材料与方法一18一结果一22一讨论一28一第二部分骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病临床研究一33一前言一33一日U舌一33一材料与方法一36一结果一55一讨论一69一参考文献一73一综述一79一摘要一79一参考文献一85在读期间发表论文和参加科研工作情况说明一87一致谢一89骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病的临床研究骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病的临床研究摘要研究背
4、景英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)表明2型糖尿病(配DM)的治疗效果随着时间的延长越来越差，糖化血红蛋白(I-IbAlc)水平越来越高，导致糖尿病并发症难以控制，患者最终难以避免致死和致残的威胁。其中一个重要原因是患者的胰岛B细胞功能随着时间的延长逐渐下降。在胰高血糖素样肽1(GLP1)类似物出现之前，T2DM的药物治疗不能改善B细胞功能，仅为对症治疗。虽然研究提示GLP1类似物可改善B细胞功能，但是需要长期注射应用存在不方便，抑制胃肠道蠕动带来不良反应。新的保护和恢复胰岛功能的手段一直是医学界期待和研究的方向。近年来，干细胞以其促进再生等一系列神奇的功能成为研究的热点，动物实验把干细胞应用
5、到糖尿病大鼠中得到了令人欣慰的结果，干细胞可以恢复糖尿病大鼠的胰岛功能，纠正高血糖，其机制可能与促进自体胰腺干细胞再分化有关。因此人们热切的期待干细胞治疗糖尿病特别是T2DM这一具有庞大人群疾病的临床结果。本试验通过自体骨髓干细胞及高压氧(HOT)联合治疗，观察治疗糖尿病胰岛功能改善及血糖控制好转情况，从临床角度研究干细胞对T2DM胰岛损伤的恢复能力，改善血糖控制的效果及可能的不良反应。目的探索从采集的人骨髓中分离、培养间充质干细胞(MSC)的方法，建立人骨髓间充质干细胞(bonemarrowmescnchymalstemcells，BMMSC)的体外培养体系，为后续的干细胞研究提供稳定的细胞
6、模型。将体外培养的BMMSC和体外分离的骨髓单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells，BMMNC)同时移植入糖尿病患者体内，研究骨髓干细胞联合HOT治疗T2DM的有效性与安全性方法(1)采用经典的贴壁培养法培养BMMSC，在含10胎牛血清的DMEMLG第二军医大学博士学位论文培养基中进行培养，获得人BMMSC。吖啶橙碘丙啶(AO-PI)染色鉴定其活性。通过流式细胞仪分析其表面标记(CD29，CD73，CD90，CDl05，CD34，CD45)以及成骨、成脂肪等多向诱导分化等鉴定MSC特征。通过染色体分析MSCP5代遗传学改变。接种于裸鼠背部皮下，术后3天及l、3个月肉眼
7、观察成瘤情况。取三代到五代(P3P5)的BM-MSC用于后续实验。临床应用前进行细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测等检查。(2)T2DM患者80例，男48例，女性32例，进入研究前均接受胰岛素治疗，随机分为骨髓干细胞(BMSC)联合HOT治疗组(BMSC+HOT组)，骨髓干细胞治疗组(BMSC组)，HOT治疗组和常规治疗组(对照组)。BMSC+HOT组和BMSC组接受首次自体骨髓采集以培养自体BMMSC，BMMSC制备成功后拟进行输注，输注当日接受二次骨髓采集以分离BMMNC。BMSC+HOT组接受BMMSC及BMMNC胰腺动脉内输注治疗和输注前后共20次HOT治疗，BMSC组接受BM
8、MSC及BMMNC治疗，HOT组接受20次HOT治疗，以上3组均在胰岛素治疗基础上接受干预，对照组继续接受胰岛素治疗。胰腺动脉采用术前CT血管造影(CTA)及术中数字减影血管造影(DSA)分析。4组患者随访1年，每3个月随访1次，观察患者体重、血压、体重指数(B)、腹围及胰岛素用量变化，评估血糖控制情况、生活质量评分，复查HbAIc、空腹血糖、空腹C肽及其它实验室指标。所有患者均签署临床试验知情同意书。结果(1)经贴壁培养48h后可见散在细胞，形态呈成纤维样，72h后通过全量换液去除各种残留血细胞，MSC呈分散存在或几个形成细胞团，710天后，贴壁细胞数量明显增多，分布及生长均匀，排列整齐，呈
9、梭形或长多边形，形态不均一。原代培养1014天细胞可达8090融合，025胰蛋白酶常规消化，按l：2的比例传代，传代后的BMMSC形态与原代基本相似，经过3代后BMMSC基本达到形态均一。AOPI染色鉴定活性95。流式细胞术细胞表型的鉴定分析显示BMMSCCD29、CD73、CD90、CDl05高表达(9965044，985084，987O78，988037)，而CD34、CD45低表达(O77：L-017，18602l)。MSC培养至第5代，未发现染色体核型异常改变。实验裸鼠在观察期内均未见结节形成或可疑病灶产生。诱导分化实验表明BMMSC在体外骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病的临床研究具
10、有向骨、脂肪细胞分化的能力。临床应用前细菌培养、真菌培养、支原体检测、内毒素检测等均为阴性。(2)BMSC+HOT组和BMSC组在随访结束时与治疗前相比HbAIe降低(702O78VS799_+070，p正常上限2倍)HOT相关的副反应发生率及严重程度：气压伤、氧中毒(癫痫发作)、气管支气管症状、视力影响(近视、白内障)四、入组标准1男性或女性，年龄45652具有签署知情同意书的能力3无精神异常，具有依从性4临床病史符合附件2所列的T2DM诊断标准540岁以后发病6入组时病史2年，15年骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病的临床研究7基础C肽0330ngmL以8标准治疗前HbAlc75和125，
11、分组前必须经过4个月以上的标准治疗。在分组前胰岛素和二甲双胍药量稳定3个月以上9分组前HbAIe175和95。10分组前每日总胰岛素量100iu五、排除标准1BMI35kgIn22每日总胰岛素量100U3HbAlc95(分组前)4C反应蛋白3oo5分组前未控制血压：收缩压160mmHg或舒张压100mmHg6肾功不全：男性15mg叮1，女性14mgdL。1(1mgdL1=8841umolL1)7蛋白尿300mg天8心血管疾病、充血性心力衰竭和或过去6个月内发作急性冠脉综合征9严重心脏疾病916个月内发生心肌梗塞921年内检查发现心肌缺血93左室射血分数40，PT1515虽然INRI5，但需要长
12、期进行抗凝治疗(比如华法林治疗，但低剂量阿司匹林允许)16急、慢性胰腺炎17症状性消化性溃疡第二军医大学博士学位论文18顽固的高血脂空腹LDL34mmolL1(治疗或未治疗)和或空腹甘油三酯226mmolL119需长期全身应用类固醇20症状性胆囊结石21参与本研究前4周内应用任何的试验药物22入组前14天内因任何原因住院23活动性增殖性糖尿病视网膜病变或黄斑水肿24恶性肿瘤25肝功能异常，正常上限15倍26腹主动脉瘤27脑血管意外28糖尿病引起的任何急性、亚急性失代偿疾病29任何研究者认为对受试者有风险的急性或慢性感染30低蛋白血症、恶病质、终末期状态31食欲低下、厌食症32呼吸系统功能失代偿
13、33慢性鼻窦炎病史(过去1年内持续鼻窦炎超过8周)或反复发作的鼻窦炎(过去1年内持续超过4周，发作超过4次)34HOT治疗禁忌症幽闭恐怖症、气胸、自发性气胸病史、慢性阻塞性肺疾病、卡氏肺囊虫肺炎、癫痫疾病、上呼吸道感染、高热、遗传性球形红细胞增多症、视神经炎、酸中毒、增殖性视网膜病变、黄斑水肿、药物g顺铂，阿霉素，博来霉素，类固醇，乙醇，芳香烃，双硫仑，烟碱35其它干扰药物：磺脲类药物、噻唑烷二酮类药物、胰高糖素样多肽1(GLP1)类似物。36任何研究者认为干扰试验结果的情况。六、高压氧治疗(HOT)HOT治疗的要求是25ATA、100Fi02，时间l小时。HOT组将进行20次HOT治疗。BM
14、SC+HOT将在输注前进行10次治疗，输注结束后进行另外10骨髓干细胞联合高压氧治疗2型糖尿病的临床研究次治疗。HOT组和BMSC+HOT将采用同样的时间表进行HOT治疗。时间表根据BMSC输注的时间来安排。BMSC输注将安排在星期三以使HOT治疗的时间最多，效果最大化。表1HOT治疗时间安排表天数以BMSC输注为中心987-6-5-4-3-2lOl23456789随访前的17周访视起，所有受试者口服1000rag维生素C和200mg维生素，每日1次，一直到干预后3个月止。此举的目的在于使用抗氧化药物减少HOT治疗产生大量氧自由基带来的副作用。七、第2次自体骨髓采集及分离BMMNC1骨髓采集抽取过程与首次采集相似，首次抽取以10ml为宜防止骨髓凝结，之后每次可抽取达20ml，一侧抽取总量为175200ml，双侧髂后上棘均需抽取，最后骨髓总量为350-400mi。抽取之骨髓注入四联采血袋中，以振荡仪混均防止凝血。2分离BMMNC主血袋以倒置位离心，条件为1200RPM、412，时间lO15分钟，此步骤目的是使血沉棕黄层和血浆、脂肪分离。主血袋继续以倒置位悬挂，附属袋
