《骨髓来源的肥大细胞bmmc表面fcεri表达调控及其生物学活性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓来源的肥大细胞bmmc表面fcεri表达调控及其生物学活性的研究（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：玉立塑日期： z 卅0 咿切 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医
2、科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： 目录 伽f I f J 川J | f f I f f 删 Y 17 6 9 6 8 1 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要9 二、英文缩略语1 8 三、论文 论文一 前言19 刖舌ly 材料与方法2 0 结果2 2 讨论2 4 结论2
3、5 论文二 前言2 6 刖舌Z O 材料与方法2 7 结果3 0 讨论3 4 结论3 5 论文三 前言3 6副吾j O 材料与方法3 7 结果4 0 讨论4 3 结论4 5 四、本研究创新性的自我评价4 6 五、参考文献4 7 六、附录 综j 苤5 1 在学期间科研成绩。6 1 致谢6 2 个人简历6 3 中文论著摘要 骨髓来源的肥大细胞( B M M C ) 表面F c e R I 表达 调控及其生物学活性的研究 实验目的 肥大细胞主要存在于粘膜和结缔组织中，借助于其表面表达的I g E 的高亲合 力受体F c e R I 与抗变应原的特异性抗体I g E 的交联，形成I g E F c e
4、 R I 复合物，进而 引发I 型变态反应。肥大细胞胞浆中存在大量颗粒，其内储存组胺等生物介质， 活化的肥大细胞也可新合成细胞因子如T N F 0 【、I L 6 和I L 1 3 等生物介质。正是 借助于这些生物活性介质，肥大细胞在变态反应性疾病过程中发挥其生物学作用。 因此，肥大细胞表面受体F c e R I 表达以及其生物学功能调控机制的解析将为变态 反应的防治奠定理论基础。 F c e R I 由a ，p 和丫链三部分构成，其中a 链是I g E 特异性结合的亚基，p - 和 丫链参与信号的转导。我们的前期试验结果显示转录因子E l f - 1 在体外可以结合到 F c e R Ia
5、链启动子的顺式元件周围的核苷酸序列。E l f - 1 是E t s 转录因子家族成员之 一，通过结合细胞核内的D N A 序列，调节各种基因表达的诱导。E l f - 1 最初是从 人类T 细胞库克隆出来的一细胞型特异性转录因子，主要增强H I V - 2 启动子的转 录。然而之后的研究发现，E l f - 1 在各种造血干细胞和免疫相关细胞中也可以呈现 高表达，并且调控多种基因的表达，如T 细胞中I L 2 、G M C S F 、I L 5 、I L 一2 R A 和C D 4 ；B 细胞中免疫球蛋白重链、b l k 、l y n 和C D l D l ；巨核细胞I L 3 和肥大细 胞
6、的干细胞白血病基因( S C L ) 。最近报道显示在人类嗜碱性粒细胞系K U S l 2 中， E l f - 1 还可抑制F c e R I 丫链的表达。而在F c e R IG t 链启动子上具有结合位点的E l f - 1 是否能够影响小鼠肥大细胞F c e R I 的基因表达，目前尚不可知。 除转录因子外，基因表达调控还与染色体上组蛋白乙酰化的状态有关。这种 状态受控于两种关键的调节因子，即组蛋白乙酰化酶( H A T ) 和组蛋白去乙酰化 酶( 玎) A C ) 。曲古菌素A ( T S A ) ，是一种强效的H D A C 抑制剂( H D A C i ) ，属于 羟肟酸类。研究
7、显示T S A 作为一种有效的抗癌制剂，能够抑制肿瘤细胞的生长， 或者诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。另外，T S A 和另一种H D A C i ，S A H A ，还可通 过调节各种基因的表达而参与了免疫性疾病，如，系统性红斑狼疮( S L E ) 、移植 物抗宿主病、类风湿性关节炎等。尤其在变态反应的小鼠模型中，T S A 还显示了 其潜在治疗效应。然而，T S A 是否能够影响变态反应的重要效应细胞肥大细 胞表面F c e R I 的表达及其功能，目前尚未见相关报道。 为此，本研究拟利用E l f ls i R N A 转染技术和体外T S A 刺激等方式，探讨转 录因子E l f - 1
8、和组蛋白去乙酰化酶抑制剂T S A 对小鼠骨髓来源的肥大细胞 ( B 燃) 表面F c s R I 基因表达及其生物学功能的调控作用机制。进而，为肥大 细胞相关的变态反应的研究提供新的实验依据。 实验方法 一、小鼠B M M C 的制备 B A L B c 小鼠，雌性，6 8 周龄。钝性分离小鼠双侧股骨，用l m l 注射器吸取 少量R P M I 1 6 4 0 培养液冲洗骨髓内细胞至无菌平皿中。收集液体至1 0 m l 离心管 中，l O O O r p m ，4 “ C 离心5 m i n ，弃上清。用1 0 m l B M M C 培养液重悬细胞，移至1 0 c m 无菌培养皿，3 7
9、 培养。常规换液，培养4 周待用。 二、E 睢1s i R N A 和E l f - 1 表达质粒体外转染 按照M o u s eM a c r o p h a g eN u c l e o f e c t o r 试剂盒说明操作，选择Y - 0 01 程序，分 别将2 0 山E l f ls i R N A 、C o n t r o ls i R N A 和F I T C 标记的寡核苷酸经电转至小鼠 l x l 0 6 B M M C 中，3 7 “ ( 2 分别培养2 4 h ( 待试剂盒转染效率、E l f - 1m R N A 表达和F c s R I 口、p 、7 链m R N A
10、表达检测) 和4 8 h ( 待E l f l 蛋白表达检测) 。同法将1 p g p G V - B 2 - a N N 0 6 或p G L 3 - B a s i c 分别与2 5 n gp R L C M V ( 内参) 和2 0 t ME l f - 1 s i R N A C o n t r o ls i R N A 共同电转染至l x l 0 6 B M M C 中；另将5 l a g p G V - B 2 - 0 【_ N N 0 6 或p G L 3 一B a s i c 分别与2 5 n gp R L C M V ( 内参) 和1 0 p gp C R 3 1 - E 1
11、 f 1 或对照p C R 3 1 经B i o R a dG e n eP u l s e rI I 电转染至B M M C 中，3 7 孵育2 4 h 后，收集B M M C ( 待 F c s R I 链启动子荧光素酶活性的分析) 。 三、E l f - 1 表达鉴定 2 收集2 4 hE l f o l 及C o n t r o ls i R N A 核转染的B M M C ，按照R N e a s y M i c r o 试剂 盒的说明，提取细胞总R N A ，利用H i 曲C a p a c i t ye D N A R e v e r s eT r a n s c r i p t
12、 i o n 试剂 盒反转录合成e D N A 第一链，利用T a q M a nU n i v e r s a lP C R M a s t e rM i x 和7 5 0 0 R e a l t i m eP C R 仪进行R e a l t i m eP C R ，分析靶基因E l f - 1m R N A 表达。E l f o l 引物为 ( M m 0 0 4 6 8 2 1 7m 1 ) 。另收集4 8 hE l f - 1 及C o n t r o ls i R N A 转染的B M M C ，裂解细胞 后，经7 5 S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转膜1 5 h 后，用a n
13、 t i E l f lA b 和a n t i a c t i n A b 作为第一抗体4 “ C 过夜孵育。洗膜后用A l e x aF l u o r6 8 0g o a ta n t i - r a b b i tI g G 和I R D y e8 0 0g o a ta n t i m o u s eI g G 分别作为抗E l f - 1 和a c t i n 的第二抗体进行孵育1 h ，洗 膜后用O d y s s e yi n f r a r e di m a g i n gs y s t e m 检测E l f - 1 蛋白的表达。 四、B M M CF c 砒仅链启动子活性检测 收集转染后的B M M C ，按照D u a l l u c i f e r a s ea s s a y 试剂盒说明，经M i c r oL u m a t P l u s 分
