细胞生物学 第十三章

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1、第十三章 细胞衰老与凋亡 细胞衰老 (cellular aging或cell senescence) 细胞凋亡(Apoptosis) 第一节 细胞衰老 (cellular aging或cell senescence) Hayflick界限(Hayflick Limitation） 细胞在体内条件下的衰老 衰老细胞结构的变化 细胞衰老的分子机理 一、一、HayflickHayflick界限界限(Hayflick Limitation(Hayflick Limitation） 概念：关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。 细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的 ，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不

2、是无限的，而是有一 定的界限，这就是 Hayflick界限 癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或 形态已经不同于原先的细胞 细胞的增殖能力与供体年龄有关 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系 二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境 是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老 细胞来源人胚肺成纤 维细胞 中年人成 纤维细胞 老年人成 纤维细胞 可增殖 代数 40-60 20 2-4 不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数 二、细胞在体内条件下的衰老二、细胞在体内条件下的衰老 在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在 个体发育的早期也会发生

3、; 正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随 着有机体年龄的增高而下降？它们 会不会衰老？ 衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要 是G1期明显延长; 衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; 骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞 增殖速度也趋缓慢. 三、衰老细胞结构的变化三、衰老细胞结构的变化 细胞核的变化 内质网的变化: 衰老动物内质网成分弥散性地分散于核 周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了 线粒体的变化: 通常，细胞中线粒体的数量随龄减少， 而其体积则随龄增大 致密体的生成: 由溶酶体或线粒体转化而来 膜系统的变化 细胞核的变化 体外培养的二倍体细胞，细胞核

4、 随着细胞分裂次数的增加不断增大 细胞核的核膜内折（invagination）、 染色质固缩化 膜系统的变化 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小 衰老细胞间间隙连接减少; 细胞膜P面颗粒的在年老细胞中明显减少 ，E面颗粒相对增加。 四、细胞衰老的分子机理四、细胞衰老的分子机理 氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS- O2-， OH- ， H2O2 ），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的 “有丝分裂钟”学说（Harley,1990）每次细胞分裂后，端粒缩短 rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环（ER

5、C）的积累，导致细胞衰老。 沉默信息调节蛋白复合物（Sir complex）与衰老：Sir complex 存在于异染 色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。核仁的沉默化与寿命延长有关 SGS1基因和WRN基因与衰老： SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶; 酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突变 引发早老症. 发育程序与衰老: 线虫幼虫遇不良环境后，进入一个特殊长期的持续 幼虫的阶段 线粒体DNA与衰老:mtDNA突变积累与细胞衰老有关. 第二节 细胞凋亡(Apoptosis) 细胞凋亡的概念及其生物学意义 细胞凋亡的形态学和生物化学特征 细胞

6、凋亡的分子调控机理 一、细胞凋亡的概念及其生物学意义 概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的 过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death, PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。 生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行， 自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非 常关键的作用： 蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡， 脊椎动物的神经系统的发育， 发育过程中手和足的成形过程。 二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征 细胞凋亡与坏死(necrosis) 细胞凋亡的形态学特征 细胞凋亡的生化特征 诱导细胞凋亡的因子 细胞凋亡的检测 细

7、胞凋亡与坏死细胞凋亡与坏死(necrosis)(necrosis) 细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质 片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体 （apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬 。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细 胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎 症反应。 细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括 膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外， 导致炎症反应 细胞凋亡的细胞凋亡的形态学特征形态学特征 凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间 接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核 糖体逐

8、渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质 膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着 核膜分布 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。 细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋 亡小体 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化 细胞凋亡的生化特征细胞凋亡的生化特征 细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp特征性的DNA ladders梯状条带 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG （tissue Transglutaminase）积累并达 到较高水平 诱导细胞凋亡的因子诱导细胞凋亡的因子 物理性因子，包括射线（紫

9、外线， 射线等）， 较温和的温度刺激（如热激，冷激）等 化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等 细胞凋亡的检测细胞凋亡的检测 形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察 DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带 TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法 彗星电泳法（comet assay） 单个细胞悬浮裂解电泳荧光染色 调亡细胞中形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度较快，使细胞核呈 现出一种彗星式的图案；而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆 球形。 流式细胞分析 根据凋亡细胞DN

10、A断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。 三、细胞凋亡的分子调控机理 线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进 细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制 细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是ICE(Interleukin- 1-converting enzyme)，即Caspase1 Caspase家族与凋亡 Bcl-2家族 细胞调亡的信号传导 Caspase家族与凋亡 Caspase家族 Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)， 裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽 键

11、，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase Caspase活化 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激 活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂 解活化或自身活化 胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径 凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体 相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又 募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使

12、 细胞凋亡 下游Caspases活化后，作用底物： 裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体； 裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder; 裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于 细胞吞噬； 导致膜脂PS(磷脂酰丝氨酸 )重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。 Bcl-2家族 Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同 源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相 结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域 ；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守 的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3 Bcl-2Bcl-2、线粒体

13、与线粒体与细胞凋亡细胞凋亡 当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另 一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端 片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源 物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋亡 细胞凋亡在小鼠足趾形成中的作用 （a）开始时足趾是相连在一起的；（b）经编 程死亡足趾分开。 a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡

14、细胞(扫描电镜) c 凋亡细胞(透射电镜) caspase 超家族成员及其相应底物 BCL-2家族成员 坏死细胞 凋亡细胞 细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图 1细胞色素c诱导0 h 2细胞色素c诱导1 h 3细胞色素c诱导2 h 4细胞色素c诱导3 h 5细胞色素c诱导4 h 6阴性对照 7Marker （ 自赵允、翟中和） l细细胞外信号 l如果细细胞外的信号促进进程序性细细胞 死亡，则则属于死亡的正控制。若细细 胞外信号抑制细细胞的程序性死亡， 则则是死亡的负负控制，将这这种信号称 为为存活因子(survival factors)。目 前对对存活因子是如何作用的，基本 不了解。 l促进

15、进程序性细细胞死亡的例子很多， 也研究得较为较为 清楚。左图显图显 示了 细细胞外信号肿肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor,TNF）激发发 细细胞的程序性死亡的过过程。 受体介导导的程序性细细胞死亡途径 l肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）激发细胞的程序 性死亡的过程就是细胞外信号对程序性死亡的正控作用。 lTNF是一种能够杀死肿瘤的因子，它是由免疫系统的细胞合成的 。TNF的受体TNFR1是介导细胞程序性死亡的死亡受体(death receptor)家族的成员，是由三个亚基装配而成的膜蛋白。受体 的每一个亚基都含有一段由7080个氨基酸残基组成的跨膜死亡 结构域(death domain)。 lTNF与受体结合，引起受体死亡结构域构型