《基因转化方法与转基因植株鉴定.》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基因转化方法与转基因植株鉴定.（55页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、基因转化方法与转基因 植株鉴定 目的(外源)基因的导入 n(1)农杆菌介导的遗传转化 n(2)DNA理化转移方法 n 电融合法(电激法) n 基因枪法 n 微注射 n 超声波处理法 n(3)种质系统转化法 n 主要包括花粉管通道法、胚囊及子房注射法 和生殖细胞浸泡法。 一、一、农杆菌介导的农杆菌介导的 基因导入基因导入( (植物细胞植物细胞) ) Transferring genes Transferring genes into plant cells by into plant cells by cointegration using cointegration using T-DNAT-
2、DNA，Ti Ti plasmidsplasmids，and and agrobacteriumagrobacterium 基因导入方法基因导入方法: : 1 农杆菌感受态细胞的制备 n（1）挑取农杆菌（EHA105）单菌落接种于2.0 ml YEB 培养液中，28培养过夜。 n（2）取400l 菌液置于50ml YEB 液体培养基中，28 ，220 rpm，培养5-6 hr，培养置OD600 n达到0.3 0.5 。 n（3）菌液倒入5.0ml 的离心管中，4，40005000 rpm 离心3 min。 n（4）菌体悬浮于2ml 0.15M NaCl，10000 rpm 离心3 min。 n
3、（5）用1ml预冷的20mM CaCl2 轻轻悬浮，置于4， 24 hr内现用。 2 表达载体向农杆菌的转化 n（1）取200l农杆菌感受态细胞，加入1020l 质粒DNA，冰浴30min。 n（2）液氮中速冻35min，37水浴5min。 n（3）加入1mlYEB培养液，28，150rpm，培 养4hr。 n（4）10,000rpm 离心30sec，去上清。 n（5）再加入200lYEB 培养液悬浮细胞，涂布 于YEB 平板（含适量抗生素），28培养2d。 3 阳性克隆的鉴定 n挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB 液体培养液（含有100g/ml Kan 和 125g/ml Rif）中，28
4、C振荡培养过夜； 小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板 进行PCR扩增鉴定。 4、遗传转化(叶盘法) n（1）无菌苗的获得（试验材料） （2）预培养 n取预出真叶的无菌子叶，剪去叶尖及叶 柄部，置于无抗生素的MS固体培养基上 ，28预培养2d。 （3）用于转化番茄的农杆菌菌液的准备 n挑取农杆菌单菌落接种于YEB液体培养 基（100mg/L Kan和25mg/L Rif）中， 28振荡培养至OD600 约0.60.8， 5000rpm离心集菌5min，用MS重新悬浮 菌体，并将菌液稀释10倍。 （4）侵染、共培养 n将经过预培养的叶片放置于稀释10倍的 菌液中，侵染5min，期间不断摇动。取
5、 出外植体，用滤纸吸干多余菌液，置于 无抗生素的培养基上共培养（28暗培 养2d）。 （5）抗性芽筛选 n经共培养2d的叶片转入含抗生素的培养 基上，三周左右长出不定芽和愈伤组织 ，每23周继代培养一次。 转 化 1 天转 化 2 周 烟草抗性愈伤的筛选 筛选培养基： MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ 200mg/L Kan+ 250 mg/L Cef 转 化 6 周 转化烟草抗性芽筛选 筛选培养基： MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+ 200mg/L Kan+ 250 mg/L Cef （6）生根培养 n待抗性芽长到3cm，移入生根培养基， 23周后可观
6、察到幼根长出。 转化植株生根筛选 生根培养基： MS基本培养基+200mg/L Kan+ 250 mg/L Cef （7）移栽 n将生根良好的植株从三角瓶中小心取出 ，避免损害根茎，用水冲去多余的琼脂 ，移入用水浸透的灭菌土中（蛭石：营 养土=1：3）。 激素适宜浓度的筛选 叶盘法转化番茄体系的优化 叶盘法转化番茄体系的优化 农杆菌适宜稀释浓度的筛选 1、菌液原液：侵染后不久外植体失绿，变灰暗，并且逐渐萎蔫。 2、稀释10倍：外植体有较多的愈伤及不定芽的分化。 3、稀释20倍：外植体有愈伤及不定芽的分化，但不如10好。 农杆菌适宜侵染时间的筛选 侵染时间分别为5min、10min和20min：
7、 随着农杆菌侵染时间的延长，番茄子叶外植体受到的伤害 也逐渐加大，以至不能正常分化出不定芽。根据结果认为 5min是较适宜的侵染时间。 叶盘法转化番茄体系的优化 乙酰丁香酮对转化率的影响 在侵染的菌液和筛选培养基中均加入了200M的乙酰 丁香酮，根据观察结果，加入乙酰丁香酮的外植体与 对照相比其分化情况没有明显差异，表明加入乙酰丁 香酮与否不能有效提高番茄突变体Chloronerva的转化 率。 适宜Kan浓度的筛选 以Kan浓度(mg/L)50、75、100为筛选梯度 Kan浓度为75和100mg/L的培养基上，多数外植体开始变 白，而在Kan浓度为50mg/L的培养基上，大部分外植体 还保
8、持绿色，不定芽的分化较好。 叶盘法转化番茄体系的优化 适合于番茄突变体Chloronerva的遗传转化体系 （1）预培养条件：培养基为MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，培养 时间2d。 （2）共培养条件：培养基为MS+ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L，28 黑暗培养2d。 （3）筛选培养条件：培养基MS+ ZT2.0mg/L+IAA0.2mg/L+ Kan 50mg/L +Cef 250mg/L。 （4）生根培养条件：生根培养基采用：1/2MS+Kan25mg/L +Cef 250mg/L。 转化番茄抗性芽筛选 抗性芽由平皿转入瓶中培养 筛选培养基：MS+ ZT2.0mg
9、/L+IAA0.2mg/L+ Kan 50mg/L +Cef 250mg/L A Chloronerva B 35S:MxNas1 筛选植株生根培养 生根培养基：1/2MS+Kan25mg/L +Cef 250mg/L A 突变体Chloronerva B 转化植株 转化植株生根后转入土培 转基因番茄互补突变体Chloronerva表型 转化小金海棠 转基因烟草表型分析 转基因烟草表型分析 MxIRT1 转化拟南芥 基因导入方法基因导入方法: : 二、基因枪法二、基因枪法(Biolistic-(Biolistic- bombardment)(bombardment)(植物细胞植物细胞) ) n
10、基因枪（particle gun）又称微弹轰击法（ microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。最早是由Cornell大学研制的火药基因枪。 1990年，美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS-1000系 统。 n基因枪的组成部分有：点火装置、发射装置、挡板、 样品室、真空系统组成。基因枪转化的基本步骤如下 ： DNA微弹的制备 DNA-微弹载体的制备 靶外植体准备 DNA微弹轰击 轰击后外植体的培养 基因导入方法基因导入方法: : 三、电击法三、电击法 (Gene (Gene transfer by transfer
11、 by electroporation)electroporation) 四、花粉管通道法 n花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然 的花粉管通道（ 又叫花粉管引导组织），经珠 心通道，将外源DNA 携带入胚囊，转化受精 卵或其前后的生殖细胞（ 精子、卵子），由于 它们仍处于未形成细胞壁的类似“ 原生质体”状 态，并且正在进行活跃的DNA 复制、分离和 重组，所以很容易将外源DNA 片段整合到受 体基因组中，以达到遗传转化之目的。 n该方法可用于任何开花植物，将供体总 DNA的片断，在受体自花授粉后一定时 期涂抹于柱头上，使能沿着花粉管通道 进入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞 。实际应用时一
12、般切除柱头进行涂抹， 这样可减少DNA 进入胚囊的距离，提高 转化率，但会影响结实率。 转基因植物的鉴定 转基因植物的鉴定 1.遗传鉴定 2.表达鉴定 3.表型分析鉴定 利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交 直接鉴定DNA分子是否整合 到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交） n检测拷贝数 一、Southern blot检测 Southern blot 制作探针： - 根据试剂盒的要求确定DNA用量， 一般不超过100ng. - 反应结束后对探针最好用层析柱进 行纯化 -不同的植物用于Southern杂交的 DNA量不同，一般每泳道
13、的拟南芥DNA的 用量为10-25ug. -一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶 量，DNA的浓度不要过高。注意不同的酶 要求的反应温度不一样。 -酶切后取少量样品检测酶切是否完全 ，如果不完全，可加酶后继续酶切。 DNA酶切 根据酶切后的目的片断大小，一般采用 0.7或0.8%的agarose。但当酶切后 目的片断较小时，要适当提高胶的浓 度。记住电泳时两边的泳道要加标准 分子标记。 电泳是电压不要过高， 一般为1v/cm 。最好电泳完毕后进行染色。 电泳完毕要用比例尺对胶进行照相。 DNA凝胶电泳 对胶的后处理： 1.如果片断较大（15kb)，凝胶需在0.2M HCl 中处理10分钟 2.
14、用水漂洗凝胶，加入1.5M NaCl, 0.5M NaOH, 处理45分钟，并轻轻摇动。 3.用水漂洗凝胶，与1M Tis-HCl,(pH7.4),1.5M NaCl,轻轻摇动，中和15分钟， 一般用尼龙莫 一般实验室多采用毛细管法 转膜缓冲液一般为10X的SSC或SSPE, 转膜时间一般为48hr。用UV确认转膜是否完全。 固定： UV 0.4M NaOH, 80oC烘烤1.5-2小时 转膜 Upward capillary transfer 5-8cm 400g 二、 Northern blot 从植物中提取RNA 方法1. 热酚法 试剂： 提取缓冲液：100mM LiCl 1%SDS 1
15、00mMTris-HCl (p8.0) 10mMEDTA TE缓冲液饱和酚 氯仿 4MLiCl 乙醇 75%乙醇 300mM醋酸钠（pH5.2) 0.05%DEPC H2O (1LH2O中加入0.5ml DEPC, 摇动混合4小时 以上，120oC, 灭菌30分钟） 20XMOPS: 0.4M MOPS 0.1M CH3COONa 0.02M EDTA pH 7.0 -500ml 20XMOPS 中，加大约 5.5克KOH后，慢慢调至pH7.0. 120oC, 灭菌45分钟. 37%甲醛 甲酰胺（-20oC保存） 30%过氧化氢 试 剂 10mg/ml EtBr 10XDye: 50% Glycerol, 1mMEDTA, 0.4%溴酚兰， 0.4%二甲苯青FF, 用DEPC处理水调制 20XSSPE or 20XSSC, -电泳槽用5%过氧化氢处理2个小时以上， DEPC处理水清洗2次。 -灭菌、RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理 水及1.2克琼脂糖，微波炉加热溶解，60oC水 浴上放置15分钟，加入5ml20 xMOPS及15ml 甲醛溶液，灌胶。与通风橱中进行。 变性凝胶制备 -RNA加样缓冲液： 35ul 37%甲醛 100ul 甲酰胺 5ul 20XMOPS 20ul 1
