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1、荧光原位杂交 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发 展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记 而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料. 荧光原位杂交 FISH的原理 FISH的操作及应用 FISH的展望 FISH的原理 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针, 按照碱基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸 进行特异性结合,形成可被检测的杂交
2、双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排 列,因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特 定的基因在染色体上定位。 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究 、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产 前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 。 荧光原位杂交 原有的放射性同位素原位杂交技术存在着较多缺点,诸如每 次检验均 需重新标记探针,已标记的探针表现出明显的 不稳定性,需要较和时间的曝光时间和对环境的污染等。 在观察结果时,需要较多的分裂进行统计学分析。此外, 由于放射性银粒和染色体聚集的不同平面,可能引起计数 上的误 差等。 与之比FISH的优点 操
3、作操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用二年 方法敏感,能迅速得到结果 在同一标本上,可同时检测几种不同探针. 不仅可用于分裂期细胞染色体数量或结构变化的研究, 而且还可用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究. 缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA 探针时效率明显下降。 荧光原位杂交 FISH技术包括下列几个步骤: 1)探针的制备和标记 2)探针及标本变性 3)杂交 4)洗脱 5)杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针) 6)封片 7)荧光显微镜观察FISH结果 荧光原位杂交 探针的制备和标记 探针是一段带有荧光色素或(半)抗原的核苷酸序列。 其长度介于15至数千个
4、核苷酸之间,但以250650个核 苷酸杂交效果最好 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 间接标记是采用生物素标记DNA探针,杂交之后用藕联 有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测,同时还可以 利用亲和素-生物素-荧光素复合物,将荧光信号进行放 大,从而可以检测500bp的片段。 直接标记是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架 共价结合,或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三 磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单,但由于不能 进行信号放大,因此灵敏度不如间接标记的方法。 荧光原位杂交 单拷贝探针: (1)种类:YAC, BAC, Cosmid,Plasmid, cDNA片段 (2)应
5、用 (a)定位DNA片段及嵌合体克隆验证; (b)确定染色体微小缺失与重复; (c)染色体断裂点分析。 (d)间期细胞染色体数目异常诊断。 荧光原位杂交 单拷贝探针 DNA片段的染色体定位 荧光原位杂交 单拷贝探针 FISH检测微小缺失 荧光原位杂交 单拷贝探针 FISH检测微小缺失 荧光原位杂交 染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1) 荧光原位杂交 简单重复序列探针 简单重复序列探针(simple repetitive probes) 异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes) 其靶序列为卫星DNA或卫星III DNA(alpha s
6、atellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和 异染色质区域,重复数百次至数千次。 特点:信号强 应用:(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断 荧光原位杂交 简单重复序列探针 荧光原位杂交 染色体的着丝粒异染色质区域 简单重复序列探针 间期细胞遗传学的意义: 细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一, 经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细 胞并不进行分裂,很难通过培养获得中期染色体分裂相, 间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能,而 且快速。 荧光原位杂交 染色体涂染探针 染色体涂染探针(
7、chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针 探针来源: (1)含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体 细胞杂种组织融合的产物; (2)荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA,并以载体克隆 /PCR扩增; (3)显微切割得到染色体或染色体片段,PCR扩增; 应用 (1)染色体数目和结构异常分析; (2)不同物种间的同源性比较; (3)白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。 荧光原位杂交 染色体涂染探针 人类染色体结构分析 荧光原位杂交 染色体涂染
8、探针:染色体结构异常分析 荧光原位杂交 多色复合染色体 FISH探针 多色FISH(muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex FISH, M-FISH probes) 两种以上不同的非同位素标记,不同的荧 光检测系统,通过不同的滤光片组合或极 少数几种非同位素标记探针后,按照不同 的比例混合,可以显示多种颜色。 荧光原位杂交 多色复合染色体FISH探针 荧光原位杂交 探针针及标标本的变变性 1)探针变性 将探针在75oC恒温水浴中温育5min,立即置0oC,5 10min,使双链DNA探针变性。 2)标本变性 将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤
9、片2 3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退 色后再烤片)。 取出玻片标本,将其浸在7075oC的体积分数70 甲酰胺/2SSC的变性液中变性23min。 立即按顺序将标本经体积分数70、体积分数90 和体积分数100冰乙醇系列脱水,每次5min,然 后空气干燥。 荧光原位杂交 杂交 将已变性或预退火的DNA探针10L 滴于已 变性并脱水的玻片标本上,盖上1818盖玻 片,用Parafilm封片,置于潮湿暗盒中37oC 杂交过夜(约1517h)。 由于杂交液较少,而且杂交温度较高,持续 时间又长,因此为了保持标本的湿润状态, 此过程在湿盒中进行。 荧光原位杂交 洗脱 此步骤有助于除
10、去非特异性结合的探针,从而降低本底。 (1) 杂交次日,将标本从37oC温箱中取出,用刀片轻轻将盖玻 片揭掉。 (2) 将已杂交的玻片标本放置于已预热4250oC的体积分数50 甲酰胺/2SSC中洗涤3次,每次5min。 (3) 在已预热4250oC的1SSC中洗涤3次,每次5min。 (4) 在室温下,将玻片标本于2SSC中轻洗一下。 (5) 取出玻片,自然干燥。 (6) 取200L复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴 加在玻片标本上,盖上盖玻片。 荧光原位杂交 (1) 在玻片的杂交部位加150L封闭液I,用保鲜膜覆盖, 37oC温育20min。 (2) 去掉
11、保鲜膜,再加150L avidin-FITC于标本上,用保鲜 膜覆盖, 37oC继续温育40min。 (3) 取出标本,将其放入已预热4250oC的洗脱液中洗涤3次 ,每次5min。 (4) 在玻片标本的杂交部位加150L封闭液II,覆盖保鲜膜, 37oC温育20min。 (5) 去掉保鲜膜,加150L antiavidin于标本上,覆盖新的保 鲜膜,37oC温育40min。 (6) 取出标本,将其放入已预热4250oC的新洗脱液中,洗 涤3次,每次5min。 (7) 重复步骤(1)、(2)、(3),再于2SSC中室温清洗一 下。 (8) 取出玻片,自然干燥。 (9) 取200L PI/ant
12、ifade染液滴加在玻片标本上,盖上盖玻 片。 杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针 ) 荧光原位杂交 可采用不同类型的封片液。如果封片液中 不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作 用),为防止盖片与载片之间的溶液挥发 ,可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的 玻片标本可以在-20-70oC的冰箱中的暗 盒中保持数月之久。 封片 荧光原位杂交 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视 野,然后打开荧光激发光源。 FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红 色, 经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧 光。 荧光显微镜观察FISH结果 荧光原位杂交 所用不同荧光材料的激发光和发射光波长
13、及滤光 镜选择 荧光原位杂交 FISH技术的应用 FISH技术的应用 1)基因(或DNA片段)的染色体定 位; 2)染色体数目与结构异常的检测; 3)间期细胞遗传学(绒毛/羊水/精 子/卵裂球/其它间期细胞研究与 诊断); 4)肿瘤遗传学研究 荧光原位杂交 FISH的展望 荧光原位杂交技术已越来越广泛的应用在细胞遗传学、 育种学、医学等多个领域,尤其在检测遗传物质的突变和染色 体上基因定位等方面显示了极大的优势。随着分子生物学的发展, 新探针的不断出现特别是全探针及染色体原位抑制杂交技术的出现,计 算机辅助的共焦显微系统和数字成像系统的发展,FISH技术的应用会加深加 快人类在肿瘤学、产前诊断
14、、哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域的 认识。 FISH的展望 FISH技术和RFLP(Restrict Fragment Lenth Polymorphysim)结合,可以更精确地描 述原必于染色体长短臂等结构改变和染色体梳型 或复制片段的性质。 FISH和细胞免疫化这技术结合,可以同时用多种颜色 反应检测不同的核苷酸链和蛋白质,这样可以在单个细胞内 同时找到基因的位点,转录和翻译和产物,有助于对核甙酸 结构与功能以及基因表达产物之间关系的研究。 在基因图谱绘制中,FISH和Linkage mapping结合起来, 即使对具有高度多形态的基因位点也能较精确地定下来。 Thank you!Thank you!