柠檬酸产生菌详解

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1、微生物发酵工程部分 柠檬酸产生菌的分离、发酵、分 析、提取及检测（好氧发酵部分） 酒精及酒类方面的综合实验 （厌氧发酵部分） 生物技术专业系统实验二生物技术专业系统实验二 生物技术专业系统实验二 （微生物发酵工程部分） 云南大学生命科学学院 生物技术系 张理珉 微生物发酵工程 u实验一 柠檬酸产生菌的分离及初筛 u实验二 柠檬酸产生菌的复筛 u实验三 应用正交实验法优选柠檬酸产生菌 u 的最佳发酵培养基 u实验四 柠檬酸产生菌的发酵 u实验五 柠檬酸的提取 u实验六 柠檬酸发酵产物及提取产品的检 u 测、鉴定 u微生物发酵工程是一门利用微生物科学和工程学 的原理去研究微生物在生物反应器中工艺特

2、点和 生长规律的学科。主要研究微生物细胞中复杂的 生物化学反应，控制生物合成或降解、大规模地 生产预期的产物，达到特殊的目的。其应用范围 广泛，包括医药、食品、粮食、饲料、农业、林 业、化工、化纤、冶金、能源、环保等方面。 u微生物发酵工程实验是在学习了有机化学、微生 物学相关知识、微生物发酵工程中的工艺设备后 ，并具备一定的实验动手能力基础上，通过微生 物发酵工程实验课程的教学，使学生了解并掌握 微生物发酵工程中所涉及的发酵工艺、设备、分 析等几方面的知识及实验技能。 柠檬酸产生菌的分离、发酵、 分析、提取及检测（好氧发酵部分 ） 柠檬酸生产介绍 u 柠檬酸又名枸橼酸，它是存在于柠檬等水果

3、中的一种有机酸。学名为3-羟基3-羧基戊二酸。 u 柠檬酸具有令人愉快的酸味，它入口爽快， 无后酸味，安全无毒，是发酵法生产的最重要有 机酸。它在水中的溶解度极高，能被生物体直接 吸收代谢。它的许多特殊优点使它在各个工业部 门得到了广泛的应用。柠檬酸的盐类和衍生物也 各具优点，用途广泛，在国民经济中占有重要地 位。 u 本实验通以柠檬酸产生菌黑曲霉为代表，学 习工业微生物的分离、初筛、复筛、正交实验、 发酵罐发酵、产物提取及鉴定等实验，使学生较 全面系统地掌握微生物发酵工程的基本实验方法 和技能。 实验的总体路线 u土壤 稀释分离 变色圈平板 挑菌 纯化 摇瓶初筛 产 物鉴定 复筛 正交 实验

4、 重复实验 发酵罐发酵 产物提取 产品鉴定 实验一 柠檬酸产生菌的分离及初筛 u实验目的： 1、了解黑曲霉菌在工业生产中的不同作用； 2、复习掌握从土壤中分离工业用微生物的原理 及方法； u3、掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。 实验目的： 1、了解黑曲霉菌在工业生产中的不同作用； 2、复习掌握从土壤中分离工业用微生物的原 理及方法； 3、掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。 实验原理： u1、新菌株的分离大致可分为采样、增殖（ 富集）培养，分离鉴定、性能测定等步骤 。 u2、柠檬酸可由曲霉菌发酵糖类而生成，其 中尤以黑曲霉产酸能力最强。目前工业生 产中多以黑曲霉为柠檬酸产生菌。 u3、黑曲霉耐

5、酸性较强，在pH值1.6时仍能 良好生长。利用其产酸高、耐酸强的生理特 征，使用pH1.6的酸性营养滤纸分离该菌， 简单易行，再加上用变色圈法进行初筛，使 产柠檬酸的菌株更易被选出。 u4、黑曲霉产生的柠檬酸,可利用Deniges氏 液鉴别；其产酸量可用0.1N氢氧化钠滴定。 u1、土壤采样 u2、准备稀释分离用的器材 u3、将平皿、吸管包好后干热灭菌 u4、配制察氏培养基 u5、做成固体斜面 柠檬酸产生菌的分离实验步骤 : u6、配成蓝色的察氏-多民培养基 u7、湿热灭菌 u8、摆斜面、倒平板 u9、稀释土样 u10、涂布均匀 u11、倒置培养。 变色圈反应 u1、配制初筛发酵培养基并灭菌

6、u2、观察菌落 u3、挑选菌落变色圈，测量变色圈与菌落直径 之比，取比值较大者 u4、将选好的菌株编号，接入斜面。同时采用 倒置接种法在培养皿上点植接种 u5、培养斜面和平皿 u6、摇瓶发酵 u7、柠檬酸鉴定 u8、产酸量的测定。 柠檬酸产生菌的初筛实验步骤 : u1.简述从土壤中筛选产目的产物微 生物菌种的过程。 u2.土壤采样时应注意的哪些问题？ u3.黑曲霉柠檬酸产生菌菌株的富集 应考虑利用哪些特点来进行富集？ 思考题 实验二 柠檬酸产生菌 的复筛 实验目的： u1.掌握以初筛的菌株为基础进行选 优的复筛方法； u2.掌握摇瓶发酵的方法。 u初筛选出的菌株必须进行摇瓶发酵 复筛，复筛不是

7、初筛简单的重复。 u复筛的主要目的： 考查菌株生产能力的自然波动范 围； 复筛的菌种经过斜面传代，在摇 瓶复筛中考查菌种的传代稳定性； 选出稳定、高产的菌株。 实验原理： u1. 将各菌种的孢子接种蔗糖培养 基中，同时作对照实验 u2.将实验组和对照组摇瓶振荡发酵 培养 u3.发酵结束后，测定并计算出空白 对照和各菌种的平均产酸率 u4.选取产酸率高且稳定的菌株 实验步骤 u1.为什么在平板初筛中有些菌落透 明圈或显色圈很大，但摇瓶发酵试 验结果产酸甚低？ u2.复筛中应该注意那些事项。 思考题 实验三 应用正交实验 法优选柠檬酸产生菌的 最佳发酵培养基 实验目的 u1.掌握利用正交实验优选最

8、佳 发酵培养基的方法； u2.掌握极差法分析正交试验结 果的方法。 u正交设计是利用一套规格化的表格正交表，科 学合理地安排试验。这种设计的特点是在试验的 全部处理组合中，仅挑选部分有代表性的水平组 合进行试验。通过这部分试验了解全面试验情况 ，找到较优的水平组合。 u正交表是正交设计的基本工具。在正交设计中， 安排试验，分析结果，均在正交表上进行。 实验原理 u正交试验法：是利用正交表挑选出一部分 有代表性的试验，所以减少了试验次数， 另外用其进行整体设计，可以同时做一批 试验以缩短试验周期，用该法通过极差分 析、方差分析，还能告诉我们那些因素是 试验指标的主、次因素，因素间有交互作 用及交

9、互作用的大小，分析出试验的误差 大小，对所做试验的误差大小等有个数量 的概念。 u1.确定试验因素和水平数 根据试验的目的确定 试验要研究的因素。为提高柠檬酸产生菌的产酸 率， 据资料查阅或经验，常用的柠檬酸发酵培 养基为：蔗糖15%，NH4NO30.2%，KH2PO4 0.1%，MgSO47H2O 0.25%。将其定为基础 发酵培养基，并以它确定了四个因素，每个因素 各三个水平，如下表所示 u2.选用合适的正交表 根据试验因素和水平数的 多少以及是否需要估计互作来选择合适的正交表 。如下表所示： 实验步骤 因素水平表 因素 水平 蔗糖（ %） NH4NO3 （%） KH2PO4 （%） Mg

10、SO47H2O （%） ABCD 1100.10.050.1 2150.20.10.25 3200.3020.5 L9(34)的正交表 列号 实验号 A（蔗糖） 1因素 B（ NH4NO3 ） 2因素 C（ KH2PO4 ） 3因素 D（MgSO4） 4因素 产酸率 （%） 11（10%）1（0.1%）1（0.05%）1（0.1%）X1 , X1 21 （10%）2（0.2%）2 （0.1%）2（0.25%）X2 , X2 31 （10%）3（0.3%）3 （0.3%）3（0.5%）X3 , X3 42 （15%）1（0.1%）2 （0.1%）3 （0.5%）X4 , X4 52 （15%）2

11、 （0.2%）3 （0.3%）1 （0.1%）X5 , X5 62 （15%）3 （0.3%）1 （0.05%）2 （0.25%）X6 , X6 73 （20%）1（0.1%）3 （0.3%）2 （0.25%）X7 , X7 83 （20%）2 （0.2%）1 （0.05%）3 （0.5%）X8 , X8 93 （20%）3 （0.3%）2 （0.1%）1 （0.1%）X9, X9 u3.根据正交表的培养基配方配制不同 的培养基 u4.正交实验结果测定 u5.发酵结束后，测定每组培养基的平 均产酸量,并填入正交表中，以便分析 使用。 正交试验结果分析:极差法（直观分析法） u（1）计算各因素同

12、一水平之和 u蔗糖因素的三个水平之和分别为A1、A2、 A3 u NH4NO3因素的三个水平之和分别为B1、B2、 B3 u KH2PO4因素的三个水平之和分别为C1、C2、C3 u MgSO4 因素的三个水平之和分别为D1、D2、D3 u（2）计算各因素同一水平的平均值 如： u a1 = A1/3 a2 = A2/3 a3 = A3/3 u 其它因素同样计算 u（3）计算极差R值，决定因素的主次顺序。R值 是各因素同一水平的平均值中最大值减最小值之 极差。如： u A因素 Ra = a中最大a中最小 u B因素 Rb = b中最大b中最小 u C因素 Rc = c中最大c中最小 u D因素

13、 Rd = d中最大d中最小 u比较Ra、Rb、Rc、Rd的大小，确定并排列主 、次要因素。 u为直观起见，用各因素的水平作横坐标，指标的 平均产酸量为纵坐标，画出因素各水平与指标的 关系图。 u平均产酸量(g/100ml) u A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 u（4）选出最优组合： u结合试验正交表中的结果产酸量高者为该次正交 试验的最佳组合，根据上述计算结果可得该次正 交试验的最优组合。 u1.正交试验法的意义。 u2.如何确定试验因素和水平数？ u3.如何利用极差法来分析实验数据？ u4.最优组合与最佳组合为什么有时会 不一致？ 思考题： 实验四

14、柠檬酸产生 菌的发酵 实验目的 u1.了解机械通风发酵罐的结构及工作原理 ； u2.掌握在通风发酵罐上菌株的发酵实验； u3.熟练费林试剂测糖的操作方法，掌握发 酵曲线的绘制。 u经过菌株的复筛和正交实验得到是最 佳培养基配方，在机械通风发酵罐内 给予微生物较好的生长环境，通过控 制温度、pH值、罐压、通风量、搅拌 转速等因素，使其产生更多的目的产 物。 u在机械通风发酵罐上得到的发酵工艺 更接近工业生产的要求。 实验原理 u1、种子培养基的配制及种子培养 u2、发酵培养基的配制、灭菌、冷却、接种 u根据正交实验得到的最佳配方与最优配方，经过 多次比较后，确定发酵培养基的配方，作为上发 酵罐实

15、验用的发酵培养基。灭菌、冷却、接种。 u3、通风发酵 u发酵过程中通风量的控制： u罐压的控制： u搅拌转速的控制： u在培养过程中如出现剧烈起泡，自动流加植物油 作为消泡剂 。 实验步骤 u4、接种后，分别在不同的时间取样，用 费林试剂法测定残糖，用0.1N氢氧化钠滴 定法测定发酵液中柠檬酸的量，用精密pH 试纸或pH 计测定发酵液的pH 值。 u5、根据发酵时间、糖含量、产酸量、 pH 的数据，绘制出pH值、产酸量、耗糖量变 化曲线与发酵时间的关系图。 u1.实验室如何完成发酵罐的接种操作 ？ u2.工业生产中“压差法”接种的操作过 程 u3.在取样时应如何操作才能保证无菌 ？ u4.如何

16、确定发酵是否结束？ 思考题： 附：还原糖及淀粉含量测 定 实验目的 u1.学习、掌握利用费林试剂测定还 原糖的方法； u2.测定溶液中的还原糖浓度及原料 中淀粉的含量。 u费林甲、乙两液混合后，硫酸铜与NaOH作用生 成Cu(OH)2，Cu(OH) 2又立即与酒石酸钾钠作 用形成可溶性的铜络合物 。 u在碱性溶液中，葡萄糖（还原糖）能很快把这种 络合物中的铜还原成一价铜，生成Cu2O，而黄 血盐存在又可以使Cu2O转变成可溶络盐，不致 沉淀析出 。 u当加入弱于Cu2+的弱氧化剂次甲基蓝作为指示 剂时，在滴定中Cu2+完全还原后，微过量的葡 萄糖也能将次甲基蓝还原，使之蓝色消失，即达 到反应终点 。 实验原理费林法 实验步骤： u（一）还原糖测定实验 u（二）淀粉含量的测定 （