脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮

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1、 安徽大学生命科学学院安徽大学生命科学学院 硕士学位论文硕士学位论文 论文题目：脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮论文题目：脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 The Breeding of denitrification strains and treatment ammonia nitrogen in wastewater 姓姓 名： 名： 周明辉周明辉 学科专业： 学科专业： 环境科学环境科学 研究方向： 研究方向： 环境生物技术环境生物技术 指导教师： 指导教师： 荚荣教授荚荣教授 完成时间： 完成时间： 2009 年年 4 月月 中文摘要 中文摘要 I 中文摘要中文摘要 氨氮是导致水

2、体污染的一类重要污染物， 可引起水体的富营养化等众多环境 污染问题。生物脱氮是目前污水脱氮处理中最常用也是最有效的方法，而选取具 有脱氮功能的菌株是生物脱氮的基础。 本实验从化肥厂的污泥中分离出五株具有 脱氮功能的菌株，选取其中脱氮效果较好的两株菌，对其进行形态观察、生物学 特性研究并确定其分类地位，分别命名为菌株 M0、M1；研究菌株 M0、M1 最适生 长条件，并优化其生长培养基；通过对菌株 M0、M1 脱氮能力和脱氮性能稳定的 比较，选取菌株 M0 作进一步脱氮试验，同时确定适合菌株 M0 脱氮的最佳人工模 拟氨氮废水的组分；为了提高菌株 M0 的脱氮效果，本实验对其进行诱变并得到 一株

3、高性能脱氮菌株 3MC31；对脱氮菌株 3MC31进行固定化，进一步提高菌株 3MC31 的脱氮效果，以更好地处理实际废水中的氨氮。 具体研究内容与结果如下： (1) 脱氮菌株的分离筛选 对化肥厂的污泥进行梯度稀释混合培养于含有氯化铵作为唯一氮源的分离培 养基，在培养基表面形成五种不同颜色的好氧菌株，颜色分别为白色、粉红色、 黄绿色、黄褐色以及灰白色菌株。分别对这五株细菌进行扩大培养，离心收集菌 体，等量投入人工模拟的氮氮废水，利用氨氮滴定法测定五株菌的脱氮率，分别 为白色菌10%、粉红色菌25%、黄绿菌23%、黄褐色菌15%、灰白色菌11%，选取粉 红色和黄绿色菌作为优势脱氮菌株，并依次命名

4、为菌株M0、M1。 （2）脱氮菌株M0、M1生物学特性研究及其菌种鉴定 菌株M0经过24-72h划线培养后， 在生长培养基表面形成众多直径1.0mm左右 呈粉红色的单菌落， 菌落呈圆形， 中间微突起， 表面光滑湿润无皱褶， 边缘整齐； 经过电镜观察发现，单个细胞形状为卵圆形或球形，细胞大小为0.6-1.0um 1.5-2.0um；对菌株M0色素进分析，其细胞内含有类胡萝卜素；菌株M0可利用多 种的有机和无机碳氮源，生长因子能刺激菌株生长，无机盐溶液能加深菌落的颜 色。 菌株M1经过24-72h划线培养后， 在生长培养基表面形成众多直径2.0mm左右 呈黄绿色的单菌落， 菌落呈圆形， 中间微突起

5、， 表面光滑湿润无皱褶， 边缘整齐； 经电镜观察发现，单个细胞形状为卵圆形，细胞大小为0.6-1.0um1.5-2.0um； 脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 II 对菌株M1色素进行分析，其细胞内含有叶绿素和类胡萝卜素；菌株M1可利用多种 的有机和无机碳氮源，生长因子能刺激菌株生长。 根据对菌株M0、M1的形态、生理生化特性以及碳氮源试验的研究结果，参 照伯杰细菌鉴定手册(第八版)，初步推测菌株MO为微球菌属的玫瑰色微球菌 (Micrococcus roseus)，菌株M1为红假单胞菌属的绿硫红假单胞菌 （Rhodopseudomonas sulfovi

6、ridi）。 （3）脱氮菌株M0、M1最适生长条件以及生长培养基的优化 将菌株M0、M1接种于生长培养基，在不同的pH、温度、盐度、摇床转速、光 照强度下培养，测定不同时间培养液的OD值，以确定最适生长条件。菌株M0的最 适生长条件为：pH7.5、温度30、盐度0.5%、摇床转速120r/m、光照对菌株MO 的生长没有明显的影响，在此条件下，培养72h生物量最高；菌株M1的最适生长 条件为： pH7.0、温度30、盐度1.5%、摇床转速130r/m、光照对菌株MO的生长 没有明显的影响，在此条件下，培养48h生物量最大。根据菌株MO、M1利用碳氮 源的情况，选取合适的碳氮化合物，利用均匀设计法

7、分别对其培养基进行组分优 化以得到最优培养基。结果得到菌株M0最优培养基为（g.L -1）：乙酸钠 6.0、氯 化氨 2.4、碳酸氢钠 0.1、硫酸镁 0.1、维生素溶液 12mL、微量元素 1mL，菌 株MO在此培养基培养72h后，0D值达到2.753；菌株M1最优培养基为（g.L -1）：乙 酸钠 4.0、氯化氨 0.2、碳酸氢钠 1.2、硫酸镁 1.2、维生素溶液 9mL、微量元 素 12mL，菌株M1在此培养基培养72h后，0D值达到5.7947。 （4）菌株M0、M1连续性脱氮试验以及人工模拟废水组分优化 通过对菌株M0、M1连续培养和脱氮性能比较，选取菌株M0作为最终的脱氮菌 株。

8、依据消耗最少的碳源，且不影响菌株生长的原则，做废水组分优化实验（一 般以1转速温度菌量pH，脱氮条件的最佳组合为 A3B2C4D3E1，即在 pH 为 7 的 100 mL 人工模拟氨氮废水中投入 0.8 g 湿菌体， 转速为 160 r/min， 温度 40 ， 脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 54 振荡培养 24h 后，脱氮率达到 74%。由方差分析可知，转速和时间对于脱氮的影 响是显著的，而其它因素的影响都不显著。 6.5 讨论6.5 讨论 本实验利用紫外线（UV）、硫酸二乙酯（DES）和氯化锂（LiCl）为诱变剂， 对出发菌株进行单因子和复合诱变

9、处理， 从实验结果看， 可以得到以下几个结论。 首先从诱变剂的效果看，UV 的诱变效果明显优于 DES，UV 诱变得到最高脱氮率 为 44.1%，而 DES 仅为 16.4%；其次从诱变方式看，复合诱变的效果要优于单因 子诱变，UV 和 DES 诱变的最高脱氮率分别为 44.1%和 16.4%，而 UV+DES 诱变最 高脱氮率为 53.4%，说明在诱变育种过程中，复合方式诱变效果远比单因子好； 再次从存活率看，随着诱变轮数的增加，整体存活率逐渐变大，说明菌株对诱变 剂产生了耐受性，而且诱变效果最好的菌株一般出现在高存活率情况下，即在高 存活率下容易出现正突变株；最后从诱变轮数看，基本上诱变效

10、果较好的菌株均 出现在二三轮， 再增加诱变轮数脱氮率不会增加反而减小， 且容易出现负突变株。 在UV+ DES+LiCl诱变中采用均匀设计法，优化UV和DES的诱变剂量，从而能 够减少实验次数和节省实验资源，同时达到了较好的诱变效果，得到了脱氮性能 优越的菌株3Mc31。均匀设计可以用较少的测试次数较全面地反映被测因素的情况 93，它在微生物培养基优化方面应用广泛94，应用于菌种选育的研究报道不多。 突变株筛选采用纳氏试剂法作为筛选性能优越的脱氮菌株的初筛方法， 该方 法有灵敏度高、操作简便以及较为直观的优点。配制的纳氏试剂中含有大量的显 色基团HgI4 2- ，HgI 4 2-与氨氮废水中的

11、氨根离子反应生成了一种棕黄色的络合 物 95。 脱氮菌株在菌体生长过程中会同化吸收周围的氨根离子合成自身的物质， 因此在菌落周围就没有氨根离子，不产生棕黄色的络合物，形成透明圈。透明圈 越大， 表明该菌株的脱氮能力越强。 但是纳氏试剂对菌体的生长具有一定的影响， 在此环境下，对菌体的培养时间不易过长，24h为宜。 实验采用诱变育种提高脱氮菌株的脱氮能力,选择紫外线、硫酸二乙酯和氯 化锂作为诱变剂，实验结果得出，复合诱变的脱氮效果明显优于单因子诱变，通 过UV+ DES+LiCl诱变，得到一株脱氮率为53.4%的诱变菌株3Mc31。由于玫瑰色微 球菌对氨氮的去除主要是通过同化吸收来完成的，诱变菌

12、株3Mc31脱氮性能的提高 可能是由于同化氮素的能力增强，3Mc31菌落的颜色由出发菌株的粉红色变成红 第六章第六章 菌株菌株 M0 诱变育种诱变育种 55 色，表明其合成类胡萝卜素的能力增强，而脱氮机理的研究有待进一步深入。 6.6 结论 6.6 结论 （1) 对脱氮菌株玫瑰色微球菌进行诱变育种， 通过比较发现， UV+ DES+LiCl 复合诱变要比UV+LiCl和DES+LiCl单因子诱变效果好，并利用纳氏试剂法初筛和 氨氮滴定法复筛，得到诱变菌株3Mc31，脱氮率达到53.4%，比出发菌株的脱氮率 提高了36.8%。 （2) 通过正交设计试验，得到诱变菌株3Mc31的最优脱氮条件，即在

13、pH为7.0 的100mL人工模拟氨氮废水中投入0.8g湿菌体，转速为160r/min，温度40，振 荡培养24h后，脱氮率达到74%。 脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 脱氮菌株的选育及其处理废水中的氨氮 56 第七章第七章 突变株3M突变株3Mc31 c31固定化以及处理废水中的氨氮 固定化以及处理废水中的氨氮 7.1 前言前言 固定化微生物技术, 是将微生物通过一定的技术手段(如利用载体材料、包 埋物质或合理控制水力条件等) 使微生物固着生长的一种十分有前途的废水生 物处理技术。 该技术有利于提高生物反应器内微生物的数量, 利于反应后的固液 分离, 利于去除氮、 高浓度有机物及难以生物

14、降解物质, 提高系统的处理能力和 适应性, 高效低耗、运行管理简单 96。固定化微生物技术克服了生物细胞太小， 与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化 和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景 97。叶正芳、倪晋仁 98通过曝气生物滤池与SBR工艺对比试验, 对污水处理中固定化微生物与游离性 微生物的性能进行了比较, 认为固定化微生物比游离微生物具有更强的抗冲击 能力, 在较宽的温度和pH值变化范围内, 固定化微生物活性均优于游离微生物。 在固定化微生物载体内部空间具有氧扩散能力，由外而内形成好氧区、缺氧区和 厌氧区，实现了好氧条件下同时可发生硝化和

15、反硝化反应，增强了脱氮效果 99-102 。固定化方法主要有吸附法、包埋法和交联法三种，固定化材料有很多种， 其中无机材料有如砂石、矿渣、陶瓷、沸石、无烟煤和活性炭等,它们具有价格 低廉、机械强度高、化学性质稳定的特点，最常用的有机材料有琼脂、海藻酸钠 （CA）、聚乙烯醇( PVA)和软性纤维等。前3者主要用作包埋剂，通过包埋的方 法固定光合细菌，软性纤维用作吸附材料，以吸附的方法固定微生物，而用于交 联法中的交联剂主要有戊二醛和一六已二胺，但由于其本身具有毒性且价格昂 贵，一般不常用。在3种包埋材料中, 海藻酸钠最易包埋成球, PVA、琼脂次之 103-105 ，但是，包埋球的强度和稳定性以

16、PVA最好，海藻酸钠次之，琼脂较差106， 从整体来看，海藻酸钠成本较低，成球操作容易，包埋球生物活性较高，是实验 室最常用的包埋材料。 本实验采用软性纤维球、 聚乙烯醇 （PVA） 、 海藻酸钠 （CA） 以及交联剂材料，运用不同的固定方法来对玫瑰色微球菌进行固定，同时利用不 同的优化方法，以确定哪种固定方法能有效提高该菌的脱氮效果。 7.2 材料 7.2 材料 7.2.1 培养基 7.2.1 培养基 第七章第七章 突变株突变株 3MC31 固定化以及处理废水中的氨氮固定化以及处理废水中的氨氮 57 同5.2.2 7.2.2 试剂及药品 同5.2.2 7.2.2 试剂及药品 活性碳或软性纤维，聚乙烯醇（PVA） ，海藻酸钠（CA） ，戊二醛，一六已 二胺，氯化钙，硼酸，酚二磺酸，对氨基苯磺酞