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1、东胜创新生物科技有限公司东胜创新生物科技有限公司 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术简介技术简介 应用工程师 张晓辉 东胜创新东胜创新 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 OUTLINEOUTLINE 实时荧光定量PCR原理 荧光定量PCR仪简介 实时荧光定量PCR在科研上的应用 实时荧光定量PCR实验设计实例 东胜创新东胜创新 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 OUTLINEOUTLINE 实时荧光定量PCR的原理： 什么是实时荧光定量PCR 荧光化学 双通道与内标 基因分型（SNP）检测 东胜创新东胜创新 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR
2、原理原理 常规PCR技术： PCR后借助电泳对扩增反应的终产 物进行定量及定性分析 DNA Engine S1 S2 M 常规常规PCRPCR 东胜创新东胜创新 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 常规常规PCRPCR 常规PCRPCR结合结合电泳分析方法的缺点 只能对终产物进行分析,无法对起始模板准确定量 必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析,费时费事 无法对扩增反应实时检测 EB有毒 东胜创新东胜创新 Opticon 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应 中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值 和标准曲线实现对
3、起始模板的定量分析 定量定量PCRPCR 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR三个关键词： 实时，荧光，定量 如何实时检测？ 借助荧光物质示踪扩增产物量的变化 定量定量PCRPCR 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 在PCR反应加入能示踪扩增产物的荧光化学物质， 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信 号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光 强度信号，得到一条荧光扩增曲线图，从而通过荧 光强度变化实时监测产物量的变化 荧光曲线荧光曲线 东胜创新东胜创新 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 引入两个概念： 荧光阈值、C
4、t值 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理 东胜创新东胜创新 荧光阈值荧光阈值 在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧 光强度标准(即PCR扩增产物量的标准) Threshold line C(t) value 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 定量原理 CtCt值的概念值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物( 荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次 数 Threshold line C(t) value 东胜创新东胜创新 qLog浓度与循环数呈线性 关系 q初始 模板量越多, 扩增 产物
5、达到某一值（域值 ）时所需要的循环数越 少 确定初始模板的浓度 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 定量原理定量原理 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 东胜创新东胜创新 定量原理定量原理 实时荧光定量PCR原理 在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =N (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N. 方程式(1)两边同时取对
6、数得: log N=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达 到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 东胜创新东胜创新 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作 出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上 计算出该样品的起始浓度。 如何定量如何定量 荧光强度-循环数曲线 初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线 . 未知 104 103 106 105 102 10 实时荧光定量PCR原理 东胜创新东胜创新 Determine C(t) value fo
7、r unknownDetermine C(t) value for unknown Interpolate quantity of unknown Interpolate quantity of unknown using the standard curveusing the standard curve unknown 104 103 Unknown contains 3108 copies 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 阈值的选择阈值的选择 荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一 个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置 上，但一般
8、我们将荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 为什么要用为什么要用CtCt值定量值定量 实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念， 在指数扩增的开始阶段进行检测，此时 样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct 值具有极好的重复性。 东胜创新东胜创新 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次 扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性 Ct值的重现性 东胜创新东胜创新 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 与传统与传统PCRPCR的比较的比
9、较 Absolute quantification is possibleAbsolute quantification is possible SensitiveSensitive Detects lower copies of targetDetects lower copies of target Detects small fold differencesDetects small fold differences Samples with a broad range of Samples with a broad range of concentrations are analyze
10、d without concentrations are analyzed without normalizing concentrationnormalizing concentration Cost effective and time efficientCost effective and time efficient Flexible assay designFlexible assay design 东胜创新东胜创新 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理 OUTLINEOUTLINE 实时荧光定量PCR的原理： 什么是实时荧光定量PCR 荧光化学 双通道与内标 基因分型（SN
11、P）检测 东胜创新东胜创新 实时荧光定量PCR原理 示踪扩增产物量变化的荧光物质及 其工作原理 东胜创新东胜创新 qqSYBR Green 1SYBR Green 1 qqMoleculaMolecula r r Beacons Beacons qq TaqManTaqMan 荧光化学荧光化学 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 东胜创新东胜创新 SYBR Green ISYBR Green I SYBR Green 1SYBR Green 1 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 东胜创新东胜创新 SYBR Green I SYBR
12、Green I 工作原理工作原理 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 qSYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 qSYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧 光。 G T T T G G C C C CC C C A A A G G G A C T T G A T A G C A T C G T A A 东胜创新东胜创新 Bound SYBR Green I Unbound SYBR Green I PCR SYBR Green I fluorescence SYBR Green I fluorescence increases up
13、on binding increases upon binding dsDNAdsDNA Post-amplification melting Post-amplification melting curve analysiscurve analysis MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理 东胜创新东胜创新 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 东胜创新东胜创新 SYBR Green I SYBR
14、Green I 优点优点 q使用方便 - 不必设计 复杂的荧光探针 q没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 q便宜 q灵敏 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 东胜创新东胜创新 SYBR Green I SYBR Green I 缺点缺点 q与非特异性产物结合 MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 东胜创新东胜创新 Graph fluorescence intensity vs. temperatureGraph fluorescence intensity vs. temperature Decreasing fluorescenc
15、e recordedDecreasing fluorescence recorded Due to increasing temperatureDue to increasing temperature Due to Due to denaturationdenaturation and release of SGI and release of SGI Tm is the point of inflection on the melting curveTm is the point of inflection on the melting curve Temperature increases Fluorescence decreases Tm MJRMJR系列实时荧光定量系列实时荧光定量PCRPCR仪之仪之 SYBR Green I SYBR Green I 融解曲线分析融解曲线分析 东胜创新东胜创新 Plot the negative of the rate of ch
