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1、GB 4789.382012 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数,参考标准,本标准采用的定义是大肠埃希氏菌，方法主要参考的是美国FDA Bacteriological Analytical Manual（2002）中的Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria。,VRBAMUG平板计数法,MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。经实验发现，在MUG浓度从0 g/mL到200 g/mL的范围内，大肠埃希氏菌生长繁殖率没有区别。 MUG方法有大约4%的假阴性，特别是倍受关心的O157:H
2、7菌株为阴性，令人感到遗憾，但经典的常规方法也同样存在这样的问题。,VRBAMUG平板计数法,常规方法不能检出不产气菌株和乳糖迟缓发酵菌株，而且由于O157:H7菌株不能耐受44的培养温度而同样不能检出O157:H7菌株，普通变形杆菌等某些杂菌的存在对大肠埃希氏菌发酵乳糖的产气能力具有抑制作用，但对分解MUG产生荧光的能力没有抑制作用。,VRBAMUG平板计数法,研究还证实，大肠埃希氏菌荧光反应比产气反应出现得更早，并且不受食品的影响，仅发现对牡蛎直接进行的检验不适合用MUG方法，因为牡蛎具有内源性葡萄糖苷酸酶。,VRBAMUG平板计数法,本标准采用的VRBA-MUG平板计数方法，正是以上述理
3、论为依据，参照FDA方法而确立的，检验时间为18 h24 h，并能准确测出样品中大肠埃希氏菌的CFU数值，操作简便，但对于对染菌量低（如10 CFU/g）的样品不如MPN法适用。,1 范围,本标准规定了食品中大肠埃希氏菌（Escherichia coli）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠埃希氏菌的计数，其中大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）不适用于贝类产品。,2 术语和定义,2.1 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 大肠杆菌广泛存在于人和温血动物的肠道中，能够在44.5发酵乳糖产酸产气，IMViC（靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为或的革兰氏阴性杆菌。以此作为粪便污
4、染指标来评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性。,卫生学意义,大肠埃希氏菌的某些菌株对人有致病性。相对于大肠菌群和粪大肠菌群，大肠埃希氏菌与粪便污染的相关性最好，应用也最悠久。自1892年被提议作为粪便污染的指示菌以来，已被应用了100多年。,3 设备和材料,除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：361。 3.2 冰箱：25。 3.3 恒温水浴箱：44.50.2 。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。,3 设备和材料,3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移
5、液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11 菌落计数器。 3.12 紫外灯：波长360nm366nm，功率6 W。,4 培养基和试剂,4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤。 4.2 EC肉汤（E.coli broth）。 4.3 蛋白胨水。 4.4 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红(MR)和V-P试验用 。 4.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基。 4.6 磷酸盐缓冲液。,4 培养基和试剂,4.7 伊红美蓝（EMB）琼脂。 4.8 营养琼脂斜面。 4.9 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）。 4.10 VR
6、BA-MUG。 4.11 革兰氏染色液。 4.12 Kovacs 靛基质试剂。 4.13 无菌1 mol/L NaOH。 4.14 无菌1 mol/L HCl。,大肠埃希氏菌计数,大肠埃希氏菌MPN计数（第一法） 大肠埃希氏菌平板计数法（第二法）,大肠埃希氏菌计数：第一法,大肠埃希氏菌计数：第一法,5.2 操作步骤,5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品，放入盛有225mL磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8 000 r/min10 000 r/min均质1min2 min，制成1:10 样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225
7、mL磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。,5.2.1 样品的稀释,5.2.1.3 样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1 mol/LNaOH或1 mol/L HCl调节。 5.2.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。,5.2.1 样品的稀释,5.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样
8、品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。,5.2.2 初发酵试验,每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 1培养24 h2 h，观察小倒管内是否有气泡产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养48 h2 h。产气者进行复发酵试验。如所有LST肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果。,5.2.3 复发酵试验,用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养
9、物1环，移种于已提前预温至45 的EC肉汤管中，放入带盖的44.5 0.2 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面，培养24 h2h。 检查小倒管内是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48 h2 h。记录在24 h和48 h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。,EC肉汤,EC肉汤主要成分： 乳糖、胆盐、胰蛋 白胨。 大肠埃希氏菌因分 解乳糖而产气，使 小倒管中可见气泡。,5.2.4 伊红美蓝平板分离培养,轻轻振摇各产气管，用接种环取培养物分别划线接种于EMB平板，36 1培养18 h24 h。观察平板上有无具
10、黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。,EMB琼脂,主要成分：乳糖、营养物质。指示剂系统：伊红和美蓝。 原理：大肠菌群分解乳糖产酸，使伊红与美蓝结合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可产生金属光泽。黑色程度与光泽产生情况与伊红、美蓝二者的比例有关。 不发酵乳糖产酸的细菌，在碱性环境中不能使伊红、美蓝结合，因而形成无色的菌落。 部分大肠菌群的菌株在EMB上可形成红色或粉红色的菌落。（应注意非典型的菌落）。,EMB琼脂上大肠埃希氏菌 典型菌与可疑菌落,典型菌落：具黑色中心有光泽或无光泽的菌落。 非典型的可疑菌落：粉红色，无黑心。,5.2.5 营养琼脂斜面或平板培养,从每个平板上挑5个典型菌落，如无典
11、型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面或平板上36 1 ，培养18 h24 h。取培养物进行革兰氏染色和生化试验,生化鉴定,取培养物进行靛基质试验、MRVP试验和柠檬酸盐利用试验。大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌的生化鉴别见表1。 表1大肠埃希氏菌与非大肠埃希氏菌得生化鉴别,生化鉴定,注1：如出现表1以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。 注2：生化试验也可以选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统等方法，按照产品说明书进行操作,5.3大肠埃希氏菌MPN计数的报告,大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无胞杆菌，发酵乳糖、产酸、产气，IMViC
12、生化试验为或。只要有1个菌落鉴定为大肠埃希氏菌，其所代表的LST肉汤管即为大肠埃希氏菌阳性。依据LST肉汤阳性管数查MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌MPN值。,检样量的选择,注1：本表采用3个稀释度0.1 g(mL)、0.01g(mL)和0.001 g(mL)，每个稀释度接种3 管。 注2：表内所列检样量如改用1 g（mL）、0.1g(mL)和0.01 g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01 g(mL)、0.001 g(mL)、0.0001 g(mL)时，则表内数字应相应增高10倍，其余类推。,大肠埃希氏菌平板计数法 （第二法）,制订依据,美国食品药品管
13、理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，2002，Chapter 4：Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria,基本原理,4-甲基伞形酮-D-葡萄糖苷，英文缩写MUG。是一种不产生荧光的底物。由于96%的大肠埃希氏菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基伞形酮游离出来，在366 nm紫外光下产生蓝色荧光。观察到蓝色荧光即可认为是大肠埃希氏菌阳性。MUG对大肠埃希氏菌的生长繁殖既没有抑制作用也没有促进作用，对菌落形态也没有影响。,大肠埃希氏菌平板计数法程序,检
14、样25g(mL)+225mL稀释液 均质10倍系列稀释 选择23个适宜稀释度的样液，接种VRBA-MUG平板 361 1824h 紫外光照射，计数发荧光菌落 报告结果,6.2 操作步骤,6.2.1 样品的稀释，按5.2.1进行。 6.2.2 平板计数 6.2.2.1 选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照。,6.2 操作步骤,6.2.2.2 将10 mL15 mL冷至450.5的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样品匀液充分混匀。 6.2.2.2 待琼脂凝固后，再加3m
15、L4 mL VRBA-MUG覆盖平板表层。凝固后翻转平板，36 1 培养18 h24 h。,6.3平板菌落数的选择,数在10 CFU100 CFU之间的平板，暗室360nm366nm 波长紫外灯照射下，计数平板上发浅蓝色荧光的菌落。,6.2 操作步骤,检验时用已知MUG阳性菌株（如大肠埃希氏菌ATCC25922）和产气肠杆菌（如 ATCC 13048）做阳性和阴性对照。,6.4 大肠埃希氏菌平板计数的报告,两个平板上发荧光菌落数的平均数乘以稀释倍数，报告每g（mL）样品中大肠埃希氏菌数，以CFU/g (mL)表示。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。,质量控制,人员培训 标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC 25922， 产气肠杆菌ATCC 13048 消耗性材料技术性验收,大肠埃希氏菌在VRBA上,大肠埃希氏菌在EMB上,大肠埃希氏菌在EMB上,谢 谢！,
