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1、,2015暑期分子细胞生物学实验技术培训班,理论 原代细胞培养技术与应用,主讲人：许澎,定义和分类,重要性,常规方法,注意事项,示例,第一章,第二章,第三章,第四章,第五章,原代培养 （primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。,细胞系 （cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖,细胞株 （cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。,相关概念,如何界定原代培养和传代培养,原
2、代细胞vs细胞系,原代细胞的重要性,原代细胞的重要性-研究应用,原代细胞的重要性-临床应用,细胞治疗,原代细胞的重要性-干细胞应用,原代细胞的重要性-肿瘤免疫细胞治疗,CarT免疫治疗，主要应用在B细胞淋巴瘤治疗中,原代细胞培养的分类,从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等，选择用于组织培养的起始材料，称之为外植体。 用一定的化学药剂，最常用的有次氯酸钠，升汞和酒精等对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。严格控制无菌条件，这是获得培养成功的重要一步。 外植体块在培养基上形成疏松的愈伤组织，由愈伤组织分化出芽并可诱导形成根的小植株。,1）植物细胞和组织培养技术,2）
3、动物细胞和组织培养技术,动物细胞的生长与培养,动物细胞的特点 进化程度高 结构、形态、成分复杂 细胞间连接形式多样 生长相对缓慢 功能全面,体外培养细胞的分型,（一）贴附型 成纤维细胞型 上皮型细胞 游走细胞型 多形型细胞 （二）悬浮型 （三）半贴壁型,（一）贴附型： 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞 贴附:是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式 结果: 基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须贴附于一固相表面才能生存和生长。 培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于贴附型细胞 贴附(锚定或
4、锚着)依赖型(性)细胞：唯有贴附于固相表面才能生存的细胞,1、成纤维细胞型： 名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如： 真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮 形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,2、上皮型细胞： 名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内
5、的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,（二）悬浮型： 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 来源：自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团,常用分离方法,常用分离方法,
6、血液细胞 梯度密度离心法 免疫磁珠法 流式细胞分选法 机体组织 组织块直接培养法（机械法） 酶消化法 胰酶 胶原蛋白酶I、IV等,梯度密度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。 常用的试剂：淋巴细胞分离液、Ficoll-Paque等,免疫磁珠法,流式细胞分选法,血液细胞分离步骤,组织细胞分离步骤,细胞的培养和冻存,细胞生长曲线,细胞培养密度,冷冻保存要点,（1）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟-1 到 -3速度降温，一直到-80以下，然后直接放入液氮中长期保存 （2）冻存细胞必
7、须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。 （3）细胞浓度控制在：11061107/ml。 （4）使用高浓度血清（30%） （5）使用合适的细胞冷冻保护剂（DMSO、甘油） 细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（5-10%，培养基（60%），血清（30%）。,冷冻保存细胞的解冻与复苏,（1）快速解冻 （2）解冻操作过程动作要轻 特别注意： 解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入37水浴中。切不可直接用手，以免冻伤 冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染,无血清培养基,无血清培养基的应用,免疫细胞治疗 干细胞治疗 CHO细胞体
8、系 特殊细胞培养：神经干细胞等,典型原代细胞分离示例,小鼠胚胎神经干细胞的分离示例,小鼠骨髓间充质干细胞分离示例,人脐带内皮祖细胞的分离示例,酶消化法,总结,无菌操作 环境、器材、实验操作 培养基 有血清培养基 无血清培养基 特殊培养基 分离方法 细胞鉴定 形态、存活率、功能 冻存复苏,Yrgene Primary cell solution,Cryopreserved at early passage Cells are frozen at P1 through P5 Early passage material ensures higher viability and optimal pl
9、ating efficiency Performance tested Media, kit supplements and reagents are tested for optimal reliability Growth and morphology are assessed to ensure all components work synergistically Quality controlled to ensure safety, purity and functionality Sterility test-bacteria, yeast, fungi and mycoplasma Viral test-HIV, HBV,HCV Viability and growth Staining-cell specific marker expression,Thank You !,
