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1、 硕 士 学 位 论 文 硕 士 学 位 论 文 AEPS 对对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究细胞的免疫调控作用及其机制研究 作者姓名 作者姓名 王慧王慧 指导教师 指导教师 孙红祥 副教授孙红祥 副教授 学科（专业）学科（专业） 临床兽医学临床兽医学 所在学院 所在学院 动物科学学院动物科学学院 提交日期 提交日期 二一年五月二一年五月 中国中国 杭州杭州 单单 位位 代代 码：码： 10335 浙江大学硕士学位论文 AEPS对RAW264.7细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 2 - 研究生研究生 学号：学号： 20817070 AEPS 对对 RAW264.7 细胞的
2、免疫调控作用及其机制研究细胞的免疫调控作用及其机制研究 王慧王慧 指导教师： 指导教师： 孙红祥 副教授孙红祥 副教授 申请学位级别： 申请学位级别： 硕士学位硕士学位 专业学位： 专业学位： 临床兽医学临床兽医学 论文提交日期： 论文提交日期： 2010 年年 5 月月 论文答辩日期： 论文答辩日期： 2010 年年 6 月月 学位授予单位： 学位授予单位： 浙江大学浙江大学 答辩委员会主席： 答辩委员会主席： 答辩委员会成员：答辩委员会成员： 论 文 评 阅 人：论 文 评 阅 人： 论文答辩日期： 论文答辩日期： 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及
3、其机制研究 - 1 - ZHEJIANG UNIVERSITY Dissertation of master Immunoregulation of the polysaccharides from the roots of Actinidia eriantha on RAW264.7 cell and its mechanisms Master candidate: Hui Wang Supervisor: Associate Prof. Hongxiang Sun A Dissertation Submitted to Zhejiang University for Master Degr
4、ee in the Field of Clinical Veterinary Medicine Hangzhou China May, 2010 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 2 - 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学
5、位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学 有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 浙江大学浙江大学 可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 3 - 目目 录录 摘摘 要要 1 ABSTRACT.
6、 3 主要缩略词主要缩略词 5 第一部分第一部分 文献综述文献综述 7 第一章 多糖的药理活性研究进展 7 1 免疫调节活性 7 2 抗肿瘤活性 8 3 抗氧化活性 8 4 降血糖、降血脂功能 8 5 其它 9 第二章 TOLL样受体（TLR）及其信号转导的研究概况. 10 1 Toll 样受体及其配体. 10 2 TLR 信号转导途径11 第二部分第二部分 实验部分实验部分 17 第三章 AEPS 对 RAW264.7 细胞免疫调控作用的研究. 17 1 材料与仪器 18 1.1 仪器设备. 18 1.2 主要试剂. 18 1.3 供试药物. 19 1.4 实验细胞. 19 2 方法 19
7、2.1 MTT 法检测 RAW264.7 细胞的增殖 19 2.2 中性红法检测 RAW264.7 细胞的吞噬活性 19 2.3 Griess 法测定 RAW264.7 细胞培养上清中 NO 的含量 20 2.4 ELISA 检测 RAW264.7 细胞培养上清中细胞因子的水平. 20 3 实验结果 . 21 3.1 AEPS 对 RAW264.7 细胞增殖的影响. 21 3.2 AEPS 对 RAW264.7 细胞吞噬活性的影响 21 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 4 - 3.3 AEPS 对 RAW264.7 释放 NO 能力的影
8、响. 22 3.4 AEPS 对 RAW264.7 细胞分泌细胞因子水平的影响. 23 4 讨论 . 25 第四章 AEPS 对 RAW264.7 细胞免疫调控机制的研究. 26 1 材料与仪器 27 1.1 仪器设备. 27 1.2 主要试剂. 27 1.3 供试药物. 28 1.4 实验细胞. 29 2 方法 29 2.1 细胞总 RNA 的提取、逆转录和 RT-PCR 29 2.2 IB- 和 NF-B p65 的 Western 印记分析 33 3 实验结果 34 3.1 AEPS 作用不同时间对 RAW264.7 细胞炎症因子、趋化因子、TLR 受体及其 信号分子 mRNA 表达的影
9、响 35 3.2 不同浓度的 AEPS 对 RAW264.7 细胞炎症因子、趋化因子、TLR 受体及其 信号分子 mRNA 表达的影响 38 3.3 AEPS 对 RAW264.7 细胞 IB- 和 NF-B p65 蛋白表达的影响 . 42 4 讨论 44 5 总结 46 参考文献. 48 致致 谢谢 52 删除的内容删除的内容: 35 删除的内容删除的内容: 39 删除的内容删除的内容: 47 删除的内容删除的内容: 47 删除的内容删除的内容: 51 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 1 - 摘摘 要要 白藤梨为猕猴桃科植物毛花猕猴
10、桃Actinidia eriantha Benth.的干燥根，中药大辞典 记载具“清热、利湿、活血消肿、解毒”等功效。 全国中草药汇编和福建中医药 称其根能治胃癌、乳癌、食管癌和子宫体腺癌等。白藤梨多糖（Actinidia eriantha polysaccharides，AEPS）是从白藤梨中分离得到的水溶性总多糖，可显著抑制小鼠移植 性S180肉瘤和H22肝癌的生长；提高荷瘤小鼠脾细胞增殖反应、自然杀伤（NK）细胞和 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性、脾细胞分泌IL-2和IFN-能力以及血清中肿瘤抗原特异 性IgG、IgG2a和IgG2b抗体水平；增强卵清蛋白免疫小鼠的体液免疫和细胞免疫应
11、答， 诱生机体同时产生Th1型和Th2型免疫应答。同时，AEPS毒性小，无副作用，易于制备。 因此，其作为具有免疫调节作用的抗肿瘤药物和疫苗免疫佐剂开发研究具有良好前景。 巨噬细胞(Macrophage)以不同形式广泛分布于机体不同组织中，是抵抗病原微生物 感染的第一道防线之一，在天然免疫中发挥重要作用。巨噬细胞可通过直接吞噬作用清 除外来病原微生物和肿瘤细胞，或间接通过分泌细胞因子和其它一些炎症介质发挥作 用。近年来，大量体内外研究证实许多天然多糖对巨噬细胞功能具有调节作用。 基于 AEPS 具有显著的免疫佐剂活性和抗肿瘤作用， 本实验选择小鼠 RAW264.7 巨 噬细胞系为细胞模型，检测
12、其对巨噬细胞增殖、吞噬活性、释放 NO 能力以及细胞因子 产生的影响，研究了 AEPS 对巨噬细胞的免疫调控作用。并进一步采用 RT-PCR 检测对 巨噬细胞炎症因子、趋化因子、TLR 受体及其信号分子 mRNA 表达的影响，以及 western-blot 方法分析对 RAW264.7 细胞 IB- 和 NF-B p65 蛋白表达的影响，探讨了 AEPS 对巨噬细胞免疫调控作用的可能机制。 AEPS 能显著增强 RAW264.7 细胞的吞噬活性，并能浓度依赖性促进 RAW264.7 细 胞释放 NO 的能力，以及分泌细胞因子 TNF-、IL-10 和 IL-6 的水平。同时，AEPS 也 能显
13、著上调 RAW264.7 细胞炎症因子、趋化因子的基因表达，且呈时间、浓度依赖性关 系。这些结果说明：AEPS 对巨噬细胞的功能具有显著的增强作用。TLR 受体及其介导 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 2 - 的信号分子 PCR 分析结果表明：AEPS 能浓度依赖性、显著上调 TLR2、TLR9、TRIF 和 NF-B 等基因的表达水平；Western-blot 检测结果显示：AEPS 能显著提高 RAW26.7 细胞胞浆内 IB-和 NF-B p65 蛋白的表达水平。这些结果说明：AEPS 对巨噬细胞的 调控作用机制可能与其上调 TL
14、R 基因表达从而激活 NF-B 有关。本实验结果为 AEPS 的进一步开发研究提供了科学依据。 关键词：关键词：AEPS；RAW264.7 细胞；NO；细胞因子；趋化因子；TLR；PCR；Western-blot； 免疫增强；机制 浙江大学硕士学位论文 AEPS 对 RAW264.7 细胞的免疫调控作用及其机制研究 - 3 - Abstract Actinidia eriantha Benth (Actinidiaceae) is a liana plant that commonly grows in temperate climate zones. Its roots have been
15、used for gastric carcinoma, nasopharyngeal carcinoma, breast carcinoma, and hepatitis in traditional Chinese medicine. AEPS (Actinidia eriantha polysaccharides) was the water-soluble polysaccharide isolated from the roots of Actinidia eriantha, and the main active principles responsible for the antitumor and immunomodulatory effect of this drug. AEPS has been proved to not only significantly inhibit the growth of mouse transplantable tumor, but also remarkably promote splenocytes pr
