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1、聚合物/*双水相分离乳清分离蛋白中乳 摘要:建立了基于聚(乙二醇ran*)单丁基醚(聚合物)与*、氯化钠的双水相体系对乳清分离蛋白(WPI)中的乳白蛋白(LA)和乳球蛋白(LG)进行分离,并对其分离条件进行了优化。系统地研究了双水相体系pH值、聚合物与KH2PO4溶液体积比、NaCl添加量和WPI浓度对LA和LG的分离效果的影响, 采用液相色谱法对LA和LG的分离效果进行评价。结果表明,聚合物/KH2PO4双水相体系pH=4.0, 40%(m/m)聚合物与15.5%(m/m)KH2PO4的体积比为4 mL4 mL,NaCl添加量为0.40 g/10 mL, WPI浓度为1 mg/mL时,LA和
2、LG分离效果最好,上相中LA的萃取率为98.2%,下相中LG的萃取率为96.6%。 中国论文网 http:/ :双水相; 乳清分离蛋白; 聚(乙二醇ran*)单丁基醚; 分离 1 引 言 乳清分离蛋白(WPI)是蛋白质混合物,在乳清分离蛋白中,乳白蛋白(LA)和乳球蛋白(LG)的含量占总WPI含量的80%以上1,并被广泛应用于食品、医药、精细化工等领域,因此具有很高的商业价值2,3。现已发现LA具有多种生理功能,人LA可以被转化成一种可以诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质,牛LA也可以被转化成这种对肿瘤细胞有相似活性的物质。在LA中发现有血管紧张素转移酶(ACE)抑制活性,含有ACE抑制肽的水解产物已经
3、用于高血压患者的血压控制。LG具有优异的热与冷凝胶特性以及良好的氨基酸谱。然而,儿童对LG有过敏效应,因此在水解或脱除这种蛋白质后再应用于婴儿或低敏人群4。 近年来,双水相体系(ATPS)常应用于分离乳蛋白中各种单体蛋白质。2011年,Jara等5采用乳清分离蛋白浓缩物(WPC)/羟丙*纤维素作为双水相体系, 分离WPC中的LA和LG,结果表明,分子量低的蛋白质LA和LG均被保留在上相,分配比例高达90%,但两种蛋白未能分开。Alcntara等4,6利用响应面分析法优化WPI在PEG/*双水相和PEG/NaPA双水相体系中的分配情况,实验结果表明,PEG相只含有LA,但盐相中除含有LG外,还含
4、有部分LA。Sivakumar等7利用PEG1000/柠檬酸钠双水相体系分离乳清蛋白中的LA和LG,在最适条件下,LA在上相分配系数为16.67,LG在下相分配系数为0.27。Kalaivani等8利用PEG1000/柠檬酸钠双水相体系分离乳清蛋白中的LA和LG,通过响应面协同节线长度、pH值、体积比和乳清蛋白浓度等变量的相互作用,优化出最佳提取条件,使上相中LA的提取率为89%,纯化率为96%,下相中LG的提取率为96%,纯化率为76%,但此体系对LA的提取率偏低。 聚(乙二醇ran*)单丁基醚(聚合物)是一种水溶性聚合物, 可与合适的盐溶液混合, 构成双水相体系。 Chen等9利用Poly
5、 (ethylene glycolranpropylene glycol)(EOPOL31)/*双水相体系结合高效液相色谱法成功分离、富集和测定了牛奶、鸡蛋和虾产品中的环丙沙星(CIP),CIP的萃取率最高可达97.7%。Dembczyski等10利用*共聚物(EO50PO50)/*双水相体系分离溶菌酶,并利用响应面模型计算分配系数K和上相中酶的产率,实验结果与响应面模型计算结果一致。本研究采用聚(乙二醇ran*)单丁基醚(分子量3900)与*形成双水相体系, 分离WPI中LA和LG, 通过液相色谱监测,系统地研究了双水相体系的pH值、WPI浓度、NaCl添加量和聚合物与*体积比对分离效果的影
6、响,优化出最佳提取条件。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1260半制备液相色谱仪, 配紫外可见检测器 和ChemStation工作站(美国Agilent公司); SC3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);A150011型涡流混匀器(南京佳俊生物有限公司);FE201EL20型pH计,AL04电子分析天平(梅特勒托利多仪器(上海)有限公司)。 WPI(上海诺申食品贸易有限公司,蛋白质含量88%4.5%);LA和LG标准品(美国Sigma公司);聚(乙二醇ran*)单丁基醚(Poly(ethylene glycolranpropylene glycol) monobutyl e
7、ther, Mn3900,美国Sigma公司);乙腈、*(色谱纯,美国Dikma公司);其它试剂均为分析纯。 2.2 相图测定 以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,LA在 0.12.5 mg/mL、LG在 0.25.0 mg/mL浓度范围内线性关系良好,LA和LG线性方程分别为y=1414.2x-129.86(R2=0.9998)和y=473.47x+16.008(R2=0.9989)。 将WPI进行液相色谱分析所得到的LA和LG的含量分别为19%和73%,与市售WPI中LA和LG标注含量基本一致。 3.3 双水相组成对LA和LG分离的影响 3.3.1 pH值对LA和LG分离的影响 分
8、别考察了加入2 mL 10 mg/mL WPI溶液,0.40 g/10 mL NaCl固体,40%(m/m)聚合物溶液与15.5%(m/m)*溶液体积比为53的双水相系统对LA和LG分离的影响,结果如表2所示,双水相体系上下相的液相色谱图见图3和图4。 WPI浓度不影响聚合物/KH2PO4双水相体系对LA和LG分离,但从表3可见,随着WPI浓度增大,LA萃取率反而下降,WPI浓度大于3 mg/mL时,双水相分界层会有白色沉淀析出,下相体积变大,导致相比变小,同时LG萃取率变大。当WPI浓度较低时,相比基本相等。而LA是疏水性蛋白,LG是亲水性蛋白16,富含聚合物相比富含盐相具有更大的疏水性,聚
9、合物相中可用于相互作用和溶解的自由水很少,所以加入高浓度WPI的双水相中间层会出现LA沉淀,导致萃取率显著降低。1 mg/mL WPI对聚合物/KH2PO4双水相体系分离LA和LG较为有利。 3.3.3 NaCl添加量对LA和LG分离的影响 在聚合物/K2HPO4(53, V/V)双水相体系中分别加入0.30 g/10 mL、0.35 g/10 mL、0.40 g/10 mL NaCl,考察体系对1 mg/mL WPI的萃取效果,如表4。 聚合物/KH2PO4的体积比分别为5 mL3 mL和4 mL4 mL时,双水相体系能将WPI中LA和LG分离,但体积比为5 mL3 mL的双水相体系上下相中
10、LA和LG萃取率比较低,体积比为3 mL5 mL的双水相体系上相中还有部分LG。从表5可见,聚合物与KH2PO4体积比为44时的双水相体系对LA和LG的萃取率更高一些,分离效果也更好。这是因为随着聚合物含量的增加,界面张力增大,同时聚合物相体积增大,相比增大,从而促进其与疏水性蛋白质的相互作用18。综合考虑,选取聚合物和*的体积比为4 mL4 mL, 即相比为1.0时, 为WPI中LA和LG的最佳条件。 4 结 论 考察了聚合物(聚(乙二醇ran*)单丁基醚)/*双水相体系分离WPI中LA和LG的条件。研究结果表明,在加入40%(m/m)聚合物溶液与15.5%(m/m)KH2PO4溶液体积比为
11、4 mL4 mL,加入WPI浓度为1 mg/mL及NaCl固体添加量为0.40 g/10 mL时,构成的双水相系统对LA和LG分离效果最佳,LA和LG萃取率分别为98.23%和96.56%。LA和LG分别进入上下相,有利于后续的进一步分离纯化。与传统的PEG/盐形成的双水相7,8萃取LA和LG相比,聚合物/KH2PO4双水相分离效果更好,单一变量变化图更直观可见,萃取率更高,聚合物在室温下稳定,萃取过程中无有害物质生成,且聚合物相在较低温度与水溶液形成分层,利用工业化回收进行二次使用,达到了绿色环保的效果。 References 1 Boutin C, Giroux H J, Paquin P
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