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1、聚合物/*双水相分离乳清分离蛋白中乳 摘要：建立了基于聚（乙二醇ran*）单丁基醚（聚合物）与*、氯化钠的双水相体系对乳清分离蛋白（WPI）中的乳白蛋白（LA）和乳球蛋白（LG）进行分离，并对其分离条件进行了优化。系统地研究了双水相体系pH值、聚合物与KH2PO4溶液体积比、NaCl添加量和WPI浓度对LA和LG的分离效果的影响， 采用液相色谱法对LA和LG的分离效果进行评价。结果表明，聚合物/KH2PO4双水相体系pH=4.0， 40%（m/m）聚合物与15.5%（m/m）KH2PO4的体积比为4 mL4 mL，NaCl添加量为0.40 g/10 mL， WPI浓度为1 mg/mL时，LA和
2、LG分离效果最好，上相中LA的萃取率为98.2%，下相中LG的萃取率为96.6%。 中国论文网 http:/ ：双水相； 乳清分离蛋白； 聚（乙二醇ran*）单丁基醚； 分离 1 引 言 乳清分离蛋白（WPI）是蛋白质混合物，在乳清分离蛋白中，乳白蛋白（LA）和乳球蛋白（LG）的含量占总WPI含量的80%以上1，并被广泛应用于食品、医药、精细化工等领域，因此具有很高的商业价值2，3。现已发现LA具有多种生理功能，人LA可以被转化成一种可以诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质，牛LA也可以被转化成这种对肿瘤细胞有相似活性的物质。在LA中发现有血管紧张素转移酶（ACE）抑制活性，含有ACE抑制肽的水解产物已经
3、用于高血压患者的血压控制。LG具有优异的热与冷凝胶特性以及良好的氨基酸谱。然而，儿童对LG有过敏效应，因此在水解或脱除这种蛋白质后再应用于婴儿或低敏人群4。 近年来，双水相体系（ATPS）常应用于分离乳蛋白中各种单体蛋白质。2011年，Jara等5采用乳清分离蛋白浓缩物（WPC）/羟丙*纤维素作为双水相体系， 分离WPC中的LA和LG，结果表明，分子量低的蛋白质LA和LG均被保留在上相，分配比例高达90%，但两种蛋白未能分开。Alcntara等4，6利用响应面分析法优化WPI在PEG/*双水相和PEG/NaPA双水相体系中的分配情况，实验结果表明，PEG相只含有LA，但盐相中除含有LG外，还含
4、有部分LA。Sivakumar等7利用PEG1000/柠檬酸钠双水相体系分离乳清蛋白中的LA和LG，在最适条件下，LA在上相分配系数为16.67，LG在下相分配系数为0.27。Kalaivani等8利用PEG1000/柠檬酸钠双水相体系分离乳清蛋白中的LA和LG，通过响应面协同节线长度、pH值、体积比和乳清蛋白浓度等变量的相互作用，优化出最佳提取条件，使上相中LA的提取率为89%，纯化率为96%，下相中LG的提取率为96%，纯化率为76%，但此体系对LA的提取率偏低。 聚（乙二醇ran*）单丁基醚（聚合物）是一种水溶性聚合物， 可与合适的盐溶液混合， 构成双水相体系。 Chen等9利用Poly
5、 （ethylene glycolranpropylene glycol）（EOPOL31）/*双水相体系结合高效液相色谱法成功分离、富集和测定了牛奶、鸡蛋和虾产品中的环丙沙星（CIP），CIP的萃取率最高可达97.7%。Dembczyski等10利用*共聚物（EO50PO50）/*双水相体系分离溶菌酶，并利用响应面模型计算分配系数K和上相中酶的产率，实验结果与响应面模型计算结果一致。本研究采用聚（乙二醇ran*）单丁基醚（分子量3900）与*形成双水相体系， 分离WPI中LA和LG， 通过液相色谱监测，系统地研究了双水相体系的pH值、WPI浓度、NaCl添加量和聚合物与*体积比对分离效果的影
6、响，优化出最佳提取条件。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1260半制备液相色谱仪， 配紫外可见检测器 和ChemStation工作站（美国Agilent公司）； SC3610型低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；A150011型涡流混匀器（南京佳俊生物有限公司）；FE201EL20型pH计，AL04电子分析天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）。 WPI（上海诺申食品贸易有限公司，蛋白质含量88%4.5%）；LA和LG标准品（美国Sigma公司）；聚（乙二醇ran*）单丁基醚（Poly（ethylene glycolranpropylene glycol） monobutyl e
7、ther， Mn3900，美国Sigma公司）；乙腈、*（色谱纯，美国Dikma公司）；其它试剂均为分析纯。 2.2 相图测定 以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，LA在 0.12.5 mg/mL、LG在 0.25.0 mg/mL浓度范围内线性关系良好，LA和LG线性方程分别为y=1414.2x-129.86（R2=0.9998）和y=473.47x+16.008（R2=0.9989）。 将WPI进行液相色谱分析所得到的LA和LG的含量分别为19%和73%，与市售WPI中LA和LG标注含量基本一致。 3.3 双水相组成对LA和LG分离的影响 3.3.1 pH值对LA和LG分离的影响 分
8、别考察了加入2 mL 10 mg/mL WPI溶液，0.40 g/10 mL NaCl固体，40%（m/m）聚合物溶液与15.5%（m/m）*溶液体积比为53的双水相系统对LA和LG分离的影响，结果如表2所示，双水相体系上下相的液相色谱图见图3和图4。 WPI浓度不影响聚合物/KH2PO4双水相体系对LA和LG分离，但从表3可见，随着WPI浓度增大，LA萃取率反而下降，WPI浓度大于3 mg/mL时，双水相分界层会有白色沉淀析出，下相体积变大，导致相比变小，同时LG萃取率变大。当WPI浓度较低时，相比基本相等。而LA是疏水性蛋白，LG是亲水性蛋白16，富含聚合物相比富含盐相具有更大的疏水性，聚
9、合物相中可用于相互作用和溶解的自由水很少，所以加入高浓度WPI的双水相中间层会出现LA沉淀，导致萃取率显著降低。1 mg/mL WPI对聚合物/KH2PO4双水相体系分离LA和LG较为有利。 3.3.3 NaCl添加量对LA和LG分离的影响 在聚合物/K2HPO4（53， V/V）双水相体系中分别加入0.30 g/10 mL、0.35 g/10 mL、0.40 g/10 mL NaCl，考察体系对1 mg/mL WPI的萃取效果，如表4。 聚合物/KH2PO4的体积比分别为5 mL3 mL和4 mL4 mL时，双水相体系能将WPI中LA和LG分离，但体积比为5 mL3 mL的双水相体系上下相中
10、LA和LG萃取率比较低，体积比为3 mL5 mL的双水相体系上相中还有部分LG。从表5可见，聚合物与KH2PO4体积比为44时的双水相体系对LA和LG的萃取率更高一些，分离效果也更好。这是因为随着聚合物含量的增加，界面张力增大，同时聚合物相体积增大，相比增大，从而促进其与疏水性蛋白质的相互作用18。综合考虑，选取聚合物和*的体积比为4 mL4 mL， 即相比为1.0时， 为WPI中LA和LG的最佳条件。 4 结 论 考察了聚合物（聚（乙二醇ran*）单丁基醚）/*双水相体系分离WPI中LA和LG的条件。研究结果表明，在加入40%（m/m）聚合物溶液与15.5%（m/m）KH2PO4溶液体积比为
11、4 mL4 mL，加入WPI浓度为1 mg/mL及NaCl固体添加量为0.40 g/10 mL时，构成的双水相系统对LA和LG分离效果最佳，LA和LG萃取率分别为98.23%和96.56%。LA和LG分别进入上下相，有利于后续的进一步分离纯化。与传统的PEG/盐形成的双水相7，8萃取LA和LG相比，聚合物/KH2PO4双水相分离效果更好，单一变量变化图更直观可见，萃取率更高，聚合物在室温下稳定，萃取过程中无有害物质生成，且聚合物相在较低温度与水溶液形成分层，利用工业化回收进行二次使用，达到了绿色环保的效果。 References 1 Boutin C， Giroux H J， Paquin P
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