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1、BMBL分子生物学实验三分子生物学实验三1 1分子生物学实验三Contents质粒质粒DNADNA的酶切及分析的酶切及分析1.重组蛋白质表达的鉴定重组蛋白质表达的鉴定2.分子生物学课题设计分子生物学课题设计3.2 2分子生物学实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）v 常规常规PAGEPAGEv 不连续不连续PAGEPAGEv SDS-PAGESDS-PAGEv 固相固相pHpH梯度梯度IEF(IPG-IEF)IEF(IPG-IEF)v 双向电泳双向电泳3 3分子生物学实验三凝胶聚合原理凝胶聚合原理v化学聚合化学聚合 以过硫酸铵（以过硫酸铵（APAP）为催化剂，以四甲基
2、乙二）为催化剂，以四甲基乙二胺（胺（TEMEDTEMED）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基）为加速剂，使丙稀酰胺、甲基双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。双丙稀酰胺发生连锁反应形成网状的聚合物。v光聚合光聚合核黄素B1 还原型 游离基 聚合反应光照O24 4分子生物学实验三凝胶的孔径凝胶的孔径单体和双体在凝胶中的总浓度a+bV 100%T双体占总浓度的百分含量，即交联度bab 100%Ca，Acr的质量（g）b，Bis的质量（g）V，溶液的体积（ml） C6.5-0.3TT：520孔径大小5 5分子生物学实验三蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系蛋白质相对分子质量范围蛋白质相对分子质量范围(kD)
3、适用的凝胶浓度（适用的凝胶浓度（T%）1020301040152040100101510050051050025凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择6 6分子生物学实验三不连续不连续PAGE的分离效应的分离效应v 浓缩效应浓缩效应v 分子筛效应分子筛效应v 电荷效应电荷效应可分离： 1. 电荷性质与密度相近的但分子量有差别 2.分子量相近、性质一样、电荷与密度有差别 的分子 3.电荷性质、分子量大小相近，但构型不同7 7分子生物学实验三 浓缩效应1.1.缓冲液与凝胶的离子成分和缓冲液与凝胶的离子成分和pHpH值不同。值不同。ClCl- -，GlyGly- -，蛋白，蛋白质离子。快慢离子迁移快慢的质离子
4、。快慢离子迁移快慢的差别造成电场强度与电导率的差别造成电场强度与电导率的变化。低导电区和高导电区。变化。低导电区和高导电区。蛋白质样品迁移率在快慢离子蛋白质样品迁移率在快慢离子之间，压缩聚集成一条窄带。之间，压缩聚集成一条窄带。 2.2.两层凝胶的孔径不同：浓缩胶两层凝胶的孔径不同：浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶为大孔胶，分离胶为小孔胶8 8分子生物学实验三分子筛效应 移动界面到达浓缩胶和移动界面到达浓缩胶和分离胶界面时，凝胶的分离胶界面时，凝胶的pHpH变变化明显，缓冲液中甘氨酸的化明显，缓冲液中甘氨酸的解离迅速增加，直至完全解解离迅速增加，直至完全解离出离出 gly-,gly-,其分子量小
5、，迁移其分子量小，迁移超过蛋白质分子。而丧失夹超过蛋白质分子。而丧失夹击的作用；同时，凝胶的孔击的作用；同时，凝胶的孔径变小，降低了蛋白质的迁径变小，降低了蛋白质的迁移率。故蛋白质分子在均一移率。故蛋白质分子在均一的电压梯度和的电压梯度和pH pH 值中泳动，值中泳动，依其分子量的大小而分开。依其分子量的大小而分开。9 9分子生物学实验三电荷效应 蛋白质所带的净电的蛋白质所带的净电的性质和电荷量与分子性质和电荷量与分子的迁移率的关系，在的迁移率的关系，在同一电场强度中，在同一电场强度中，在单位时间内各分子迁单位时间内各分子迁移的距离的差别而到移的距离的差别而到达分离。达分离。1010分子生物学
6、实验三重组蛋白在原核生物中诱导表达的SDS-PAGE鉴定 (B菌)1111分子生物学实验三 实验原理vSDS-PAGE：消消除除电电荷荷对对蛋蛋白白质质样样品品迁迁移移率率的的影影响，电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小。响，电泳迁移率取决于蛋白质的分子量大小。vSDS是一种阴离子去垢剂，溶液中带负电荷。是一种阴离子去垢剂，溶液中带负电荷。vSDS能能断断裂裂分分子子内内和和分分子子间间氢氢键键，破破坏坏蛋蛋白白质质的的二级和三级结构，蛋白质解聚为单一多肽。二级和三级结构，蛋白质解聚为单一多肽。v蛋蛋白白质质多多肽肽与与SDS分分子子按按比比例例结结合合，形形成成带带负负电电荷荷的的SDS-蛋蛋
7、白白质质复复合合物物，形形成成仅仅保保持持原原有有分分子子大小为特征的负离子团块。大小为特征的负离子团块。1212分子生物学实验三影响因素1) 1)溶液中溶液中SDSSDS单体的浓度大于单体的浓度大于1mmol/L1mmol/L时大多数蛋白质时大多数蛋白质与与SDSSDS结合的重量比为结合的重量比为1:1.41:1.4，如果单体浓度低于如果单体浓度低于0.5 0.5 mmolmmol/L/L，两者的结合比仅为，两者的结合比仅为1: 0.41: 0.4这样就不能消除这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDSSDS的充分的充分结合，它们的重量比应该
8、为结合，它们的重量比应该为1:41:4或或1:31:32)2)样品缓冲液的离子强度。样品缓冲液的离子强度。SDSSDS电泳的样品缓冲液离子电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是强度较低，通常是1010100mmol/L100mmol/L3)3)用用SDSSDS处理样品同时用巯基乙醇或处理样品同时用巯基乙醇或DTTDTT处理，完全还处理，完全还原蛋白质内的二硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而原蛋白质内的二硫键，使很多不溶性蛋白质溶解而与与SDSSDS定量结合。定量结合。1313分子生物学实验三 实验试剂和器材 1.材料： 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,
9、200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 2. 试剂（略）1414分子生物学实验三v12分离胶的制备：分离胶的制备：15ml ddH2O 4.8 ml 30%凝胶储存液凝胶储存液 6.0 ml 分离胶缓冲液（分离胶缓冲液（pH8.8） 3.8 ml 10 SDS 150 l 10AP 150 l 10TEMED 100 l1515分子生物学实验三v浓缩胶的制备：浓缩胶的制备：5ml ddH2O 3.34ml 凝胶储存液凝胶储存液 0.83ml 浓缩胶缓冲液（浓缩胶缓冲液（pH6.8） 0.63m
10、l 10 SDS 50l 10AP 50 l 10TEMED 100 l1616分子生物学实验三 操作步骤1. 将干净玻璃板在灌胶支架上固定好将干净玻璃板在灌胶支架上固定好. .固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹 坏玻璃板坏玻璃板. .2.2.按比例在烧杯中配好分离胶按比例在烧杯中配好分离胶, ,用滴管快速加入用滴管快速加入, ,之后加之后加少许蒸馏水封胶少许蒸馏水封胶, ,静置静置303040min.40min.配制凝胶要迅速配制凝胶要迅速, , 催化剂催化剂TEMEDTEMED要在注胶前再加入要在注胶前再加入, ,否则凝胶无法注胶否则凝胶无法注
11、胶. .注胶过程最好一次性完成注胶过程最好一次性完成, ,避免凝胶避免凝胶不均匀不均匀. .1717分子生物学实验三操作步骤封水的目的是为了使分离胶上沿平直，并隔绝空气，封水的目的是为了使分离胶上沿平直，并隔绝空气，促使凝胶聚合过程；促使凝胶聚合过程；凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. .4.4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干, , 按比例配好浓缩按比例配好浓缩胶胶, ,连续平稳加入分离胶面上连续平稳加入分离胶面上, ,迅速插入样梳迅速插入样梳, ,静置静置30min.30min.样梳需平稳插入样梳需平稳插入
12、, ,梳口处不得有气泡梳口处不得有气泡, ,梳底需水平梳底需水平. .1818分子生物学实验三操作步骤5. 拔出样梳。插入电泳槽，倒入缓冲液体，用缓冲液拔出样梳。插入电泳槽，倒入缓冲液体，用缓冲液冲洗样品孔冲洗样品孔要使锯齿孔内的气泡全部排出要使锯齿孔内的气泡全部排出, ,否则会影响加样效果否则会影响加样效果. .6 6、用微量移液器距槽底三分之一处进样、用微量移液器距槽底三分之一处进样, ,加样前加样前, ,样品样品在沸水中加热在沸水中加热1010分钟。分钟。 注射器不可过低注射器不可过低, ,以防刺破胶体以防刺破胶体, ,也不可过高也不可过高, ,在样品在样品下沉时会发生扩散下沉时会发生扩
13、散. . 为避免边缘效应为避免边缘效应, ,最好选用中部的孔上样最好选用中部的孔上样. .1919分子生物学实验三操作步骤8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在电流恒定在80V80V，当进入分离胶后改为，当进入分离胶后改为150V150V，溴酚，溴酚蓝距凝胶边缘约蓝距凝胶边缘约5mm5mm时，停止电泳。时，停止电泳。 9.9.凝胶板剥离与染色：凝胶板剥离与染色：电泳结束后，取出凝胶，电泳结束后，取出凝胶，考马斯亮蓝染色，考马斯亮蓝染色，做好标记后准备蛋白印迹。做好标记后准备蛋白印迹。 剥胶时要小心剥胶时要小心, ,保持胶完好无损保
14、持胶完好无损. .2020分子生物学实验三注意事项v没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近v一定要催化充分，使之完全聚合一定要催化充分，使之完全聚合v集中处理，实验中全部的胶专门收集到一起，在集中处理，实验中全部的胶专门收集到一起，在一个特殊标明的容器中保存，统一处理。一个特殊标明的容器中保存，统一处理。v聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，聚丙烯酰胺通常认为无毒，但是也要小心操作，因为其中可能留下少量没有聚合的单体。因为其中可能留下少量没有聚合的单体。2121分子生物学实验三 重组重组DNADNA的酶切分析的酶切分析目的基因非变性目的基因非变性PAGE
15、PAGE鉴定鉴定2222分子生物学实验三1. 实验目的和要求实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶切分析学习和掌握限制性内切酶的特性、酶切分析和和DNA非变性非变性PAGE鉴定的操作方法，并理鉴定的操作方法，并理解限制性内切酶是解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，重组技术的关键工具，非变性非变性PAGE是高分辨率分离鉴定小分子双链是高分辨率分离鉴定小分子双链DNA片段的有效方法。片段的有效方法。 2323分子生物学实验三2. 相关基础知识相关基础知识 限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶(Restriction Endonuclease，RE)：是是一一类类能能识识别别双双链链DNA
16、DNA分分子子特特异异性性核核酸酸序序列列的的DNADNA水水解解酶酶。是是体体外外剪剪切切基基因因片片段段的的重重要要工工具具，所所以以常常常常与与核核酸酸聚聚合合酶酶、连连接接酶酶以以及及末末端端修修饰饰酶酶等等一一起起称称为为工工具具酶酶。RERE不不仅仅是是DNADNA重重组组中中重重要要的的工工具具，而而且且还还可可以以用用于于基基因因组组酶酶切切图谱的鉴定。图谱的鉴定。2424分子生物学实验三1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象2) 核酸限制性内切酶的类型、命名法核酸限制性内切酶的类型、命名法3) 核酸限制性内切酶的基本特性核酸限制性内切酶的基本特性4) 同裂酶和
17、同尾酶同裂酶和同尾酶5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素2525分子生物学实验三1) 寄主控制的限制与修饰现象寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 各种各种细菌都能合成一种或几种核酸内切酶，用来限细菌都能合成一种或几种核酸内切酶，用来限制外源制外源DNA存在于自身细胞内，但细胞自身的存在于自身细胞内，但细胞自身的DNA不受影响，因为细胞内还合成了一种修饰不受影响，因为细胞内还合成了一种修饰酶，能对自身的酶，能对自身的DNA进行修饰，限制性酶对修进行修饰，限制性酶对修饰过的饰过的DNA不能起作用。这种现象被
18、称为寄主不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。控制的限制与修饰现象。2626分子生物学实验三2)限制性核酸内切酶的类型及特性限制性核酸内切酶的类型及特性按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：断核酸的情况不同，分为三类： 型型 型型* 型型2727分子生物学实验三第一类（第一类（I I型）限制性内切酶型）限制性内切酶: :能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割一些核苷酸上切割DNADNA分子中的双链，但是切分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序割的核苷酸顺序没有专
19、一性没有专一性，是随机的。这类，是随机的。这类限制性内切酶在限制性内切酶在DNADNA重组技术或基因工程中用重组技术或基因工程中用处不大。处不大。2828分子生物学实验三第二类第二类(II(II型型) )限制性内切酶限制性内切酶: :能能识识别别专专一一的的核核苷苷酸酸顺顺序序，并并在在该该顺顺序序内内的的固固定定位位置置上上切切割割双双链链。由由于于这这类类RERE的的识识别别和和切切割割的的核核苷苷酸酸都都是是专专一一的的, ,因因此此, ,是是DNADNA重重组组技技术术中中最最常常用用的的工工具具酶酶之之一一。这这种种酶酶识识别别的的专专一一核核苷苷酸酸顺顺序序最最常常见见的的是是4
20、4个个或或6 6个个核核苷苷酸酸，少少数数也也有有识识别别5 5个个、7 7个个、8 8个个、9 9个个、1010核核苷苷酸酸的的。 II II型型RERE的的识识别别顺顺序序是是回回文文对对称称顺顺序序。酶的切割可有两种结果：平头末端、粘性末端。酶的切割可有两种结果：平头末端、粘性末端。2929分子生物学实验三第三类（第三类（ IIIIII型）限制性内切酶型）限制性内切酶: :也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序, ,在在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这链
21、。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNADNA片段，片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆。3030分子生物学实验三第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。Hind 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感
22、嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶EcoR I is from Escherichia coli.3）限制性核酸内切酶的命名法）限制性核酸内切酶的命名法3131分子生物学实验三同裂酶：同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基置都相同，有时其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如种则不能。例如HpaHpa和和MspMsp的识别顺序都是的识别顺序都是5GCG_G35GCG_G3，如果其中有，如果其中有5-5-
23、甲基甲基胞嘧啶，则只有胞嘧啶，则只有HpaHpa能够切割能够切割。这些有相同切点。这些有相同切点的酶称为的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 4） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：3232分子生物学实验三GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+BamHGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst3333分子生物学实验三同尾酶同尾酶有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配
24、配伍未端伍未端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A3434分子生物学实验三可以通过可以通过DNADNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位新的酶切位点点。如。如XbaXba1 1、NheNhe1 1以及以及SpeSpe1 1切割的切割的DNADNA序列不同，序列不同，但均给出相同的但均给出相同的“CTAG”CTAG”粘性末端。这些粘性末
25、端粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的的4 4核苷酸的酶切位点，即核苷酸的酶切位点，即 BfaBfa1 1的酶切位点。的酶切位点。3535分子生物学实验三5) 影响核酸限制性内切酶活性的因素影响核酸限制性内切酶活性的因素(1) DNA的纯度；的纯度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反应的温度；酶切消化反应的温度；(4) DNA的分子结构；的分子结构；(5) 溶液中离子浓度及种类；溶液中离子浓度及种类；(6) 缓冲液的缓冲液的 pH值。值。3636分子生物学实验三Hind III 1ulBa
26、mH I 1ul10X Buffer 2 ulPlasmid DNA 6-8 ulddH2O 10-8 ul*缓冲液随不同的酶而不同。缓冲液随不同的酶而不同。置于置于3737水浴酶切水浴酶切1-2hr1-2hr（7h7h）。）。质粒质粒DNADNA的酶切（自提质粒）的酶切（自提质粒）实验步骤：3737分子生物学实验三DNADNA酶切片段的酶切片段的非变性非变性PAGEPAGE鉴定鉴定v凝胶的配制：凝胶的配制：10 ml 30 凝胶储存液凝胶储存液 2.67 ml 5TBE缓冲液（缓冲液（pH8.8） 2.0 ml ddH2O 5.3 ml 10AP 70 l 10TEMED 60 l3838分
27、子生物学实验三v加样：酶切后的质粒加样：酶切后的质粒DNA溶液，加入溶液，加入1/5倍体积的倍体积的6上样缓冲上样缓冲液。上样于点样孔。液。上样于点样孔。v电泳：电泳：90-100 V v染色：染色：0.5 ug/ml EB步骤3939分子生物学实验三分子生物学课题设计分子生物学课题设计1、思考题：思考题： 核酸凝胶电泳种类选择的依据。核酸凝胶电泳种类选择的依据。2、分子医学的内容包括疾病基因的发现与克、分子医学的内容包括疾病基因的发现与克隆，生物制药、基因诊断与治疗等方面，隆，生物制药、基因诊断与治疗等方面，就你感兴趣的方面设计一实验技术线路图。就你感兴趣的方面设计一实验技术线路图。 4040
