《蛋白质的复性》PPT课件

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1、蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性蛋白质的复性为什么要进行蛋白质的复性？为什么要进行蛋白质的复性？外源基因导入等宿主细胞并表达蛋白质产物（外源基因导入等宿主细胞并表达蛋白质产物（ r-r-r-r-干扰素，白细胞介素干扰素，白细胞介素干扰素，白细胞介素干扰素，白细胞介素-2-2-2-2，人生长激素等，人生长激素等，人生长激素等，人生长激素等）时，相）时，相当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质的活性。当多的产物形成了包涵体，而没有蛋白质的活性。所以要进行蛋白质的复性。所以要进行蛋白质的复性。1.什么是包涵体？什么是包涵体？2.为什么选择原核表达系统（特别是为什么选择原核表达系统（特别是 ）？）？

2、蛋白质复性蛋白质复性包含体（包含体（包含体（包含体（inclusion body,IBinclusion body,IB）是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌细胞）是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌细胞）是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌细胞）是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌细胞中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在

3、显微镜下观察时为高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。高折射区，与细胞质中的其他成分有明显的区别。蛋白质复性蛋白质复性 包含体形成的原因包含体形成的原因 包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚；包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚；包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚；包涵体的形成比较复杂，有些机理还不清楚； (1)(1)表达量过高：表达量过高：表达量过高：表达量过高：包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速包含体的形成与细胞内蛋白质的生成速包含体的形成与细胞内蛋白质的

4、生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体； (2)(2)包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，包含体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、如培养基成分、温度、如培养基成分

5、、温度、如培养基成分、温度、pHpH值、离子强度、氧化还值、离子强度、氧化还值、离子强度、氧化还值、离子强度、氧化还原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有关。原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有关。原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有关。原电势及蛋白质转运系统的功能等因素有关。 (3)(3)大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响大肠杆菌的生长过程在受到某些因素的影响时，其本身蛋白质的表达也可出现异常，造成蛋时，其本身蛋白质的表达也可出现异常，造成蛋时，其本身蛋白质的表达也可出现异常，造成蛋时，其本身蛋白质的表达也可出现异

6、常，造成蛋白质的聚集从而形成包含体。白质的聚集从而形成包含体。白质的聚集从而形成包含体。白质的聚集从而形成包含体。蛋白质复性蛋白质复性包含体形成的原因包含体形成的原因包含体形成的原因包含体形成的原因（4 4）重组蛋白的氨基酸组成）重组蛋白的氨基酸组成）重组蛋白的氨基酸组成）重组蛋白的氨基酸组成（5 5）重组蛋白时大肠杆菌的异源蛋白，缺乏一些）重组蛋白时大肠杆菌的异源蛋白，缺乏一些）重组蛋白时大肠杆菌的异源蛋白，缺乏一些）重组蛋白时大肠杆菌的异源蛋白，缺乏一些蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助因子。蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助因子。蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助因子。蛋白折叠过程中所需要的酶和辅助

7、因子。（6 6）在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子间的离）在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子间的离）在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子间的离）在细菌表达蛋白过程中，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。的形成。的形成。的形成。蛋白质复性蛋白质复性 包含体的形成的优势包含体的形成的优势包含体的形成的优势包含体的形成的优势 形成包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保形成包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保形成包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保形成

8、包含体对克隆基因的表达产物蛋白质具有保护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解护作用，大肠杆菌可产生蛋白质水解酶，可降解不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些不稳定的多肽，许多可溶性的重组蛋白质对这些酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制，酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制，酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制，酶敏感，使得利用细菌作为表达宿主时受到限制，然而隔离在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降然而隔离

9、在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降然而隔离在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降然而隔离在包含体内的蛋白质可免受蛋白酶的降解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活解作用；此外对宿主菌有毒性的重组蛋白以无活性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害性聚集体的形式存在也可以降低对宿主菌的毒害作用。作用。作用。作用。优势优势优势优势: : 包含体可避免被水解酶水解包含体可避免被水解酶水解包含体可避免被水解酶水解包含体可避免被水解酶水解蛋

10、白质复性蛋白质复性包含体的理化特性包含体的理化特性包含体的理化特性包含体的理化特性大部分包含体不能渗透出细胞，需要人工进行细大部分包含体不能渗透出细胞，需要人工进行细大部分包含体不能渗透出细胞，需要人工进行细大部分包含体不能渗透出细胞，需要人工进行细胞破碎来进行释放产物。胞破碎来进行释放产物。胞破碎来进行释放产物。胞破碎来进行释放产物。大部分包含体在细胞内凝聚成没有活性的颗粒固大部分包含体在细胞内凝聚成没有活性的颗粒固大部分包含体在细胞内凝聚成没有活性的颗粒固大部分包含体在细胞内凝聚成没有活性的颗粒固体（体（体（体（r-r-r-r-干扰素，白细胞介素干扰素，白细胞介素干扰素，白细胞介素干扰素，

11、白细胞介素-2-2-2-2，人生长激素），人生长激素），人生长激素），人生长激素）特点：包含体组成基本上由蛋白质构成，其中大部特点：包含体组成基本上由蛋白质构成，其中大部特点：包含体组成基本上由蛋白质构成，其中大部特点：包含体组成基本上由蛋白质构成，其中大部分（占分（占分（占分（占50%50%50%50%以上）是基因工程产品，产物一级结构以上）是基因工程产品，产物一级结构以上）是基因工程产品，产物一级结构以上）是基因工程产品，产物一级结构是正确的，但立体结构是错误的，没有生物学活性是正确的，但立体结构是错误的，没有生物学活性是正确的，但立体结构是错误的，没有生物学活性是正确的，但立体结构是错误

12、的，没有生物学活性。蛋白质复性蛋白质复性 基基基基因因因因表表表表达达达达系系系系统统统统一一一一般般般般分分分分为为为为真真真真核核核核表表表表达达达达系系系系统统统统和和和和原原原原核核核核表表表表达达达达系系系系统统统统。由由由由于于于于真真真真核核核核表表表表达达达达系系系系统统统统如如如如酵酵酵酵母母母母、昆昆昆昆虫虫虫虫细细细细胞胞胞胞、哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞等等等等产产产产生生生生的的的的重重重重组组组组蛋蛋蛋蛋白白白白价价价价格格格格高高高高、产产产产量量量量低低低低，而而而而且且且且操操操操作作作作复复复复杂杂杂杂、产产产产品品品品周周周周期期期期长

13、长长长，而而而而原原原原核核核核表表表表达达达达系系系系统统统统培培培培养养养养成成成成本本本本低低低低、生生生生长长长长快快快快、表表表表达达达达量量量量高高高高、基基基基因因因因操操操操作作作作方方方方便便便便，因因因因此此此此，目目目目前前前前它它它它们们们们仍仍仍仍是是是是基基基基因因因因工工工工程程程程的的的的主主主主要要要要表表表表达达达达系系系系统统统统，特别是大肠杆菌。特别是大肠杆菌。特别是大肠杆菌。特别是大肠杆菌。大肠杆菌的重组菌 有多种可选择的质粒；有多种可选择的质粒； 重组遗传背景清楚，基因表达易于控制；重组遗传背景清楚，基因表达易于控制； 蛋白表达量高（可达总蛋白蛋白表

14、达量高（可达总蛋白5050）；）； 但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在但原核表达系统也有一个问题，很多外源蛋白在细胞内表细胞内表细胞内表细胞内表达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若能解决达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若能解决达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若能解决达时往往以不溶的，无活性的包含体形式存在。若能解决包含体问题，原核表达系统就可得到更广泛的应用。包含体问题，原核表达系统就可得到更广泛的应用。包含体问题，原核表达系统就可得到更广泛的应用。包含体问题，原核表达系统就

15、可得到更广泛的应用。蛋白质复性蛋白质复性现就包含体形成的预防、分离、溶解、复现就包含体形成的预防、分离、溶解、复性作一综述。性作一综述。1.预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法2.包含体的分离、溶解包含体的分离、溶解3.包含体的复性包含体的复性蛋白质复性蛋白质复性预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法1.1. 形成形成形成形成分子伴侣分子伴侣分子伴侣分子伴侣 ? 分子伴侣是什么 参参与与协协助助新新生生肽肽链链体体内内折折叠叠的的一一类类蛋蛋白白质质，包包括括：核核质质素素，热热休休克克蛋蛋白白6060家家族族（Hsp60Hsp60），热热休休克克

16、蛋蛋白白7070家家族族（Hsp70Hsp70），热热休休克克蛋蛋白白9090家家族族（Hsp90Hsp90）和其他种类的分子伴侣）和其他种类的分子伴侣 ? 分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用 使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力；使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力； 在在肽肽链链折折叠叠过过程程中中通通过过与与折折叠叠中中间间体体上上暴暴露露的的疏疏水水区区域域结结合合而而防防止止肽肽链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径? 应用分子伴侣的策略 可可采采用用表表达达外外源源基基因因的的同同时时，共共表表

17、达达分分子子伴伴侣侣的的策策略略。例例如如，GroESGroES和和GroELGroEL可可显显著著提提高高D-D-核核酮酮糖糖-1-1，5-5-二二磷磷酸酸加加氧氧酶酶/ /羧羧化化酶酶（rubiscorubisco）的的折折叠叠、组组装装效效率率，从从而而提提高高可可溶溶性性重重组组蛋蛋白白的的产产量量；也也能能提提高高可可溶溶性性乙乙酰酰辅辅酶酶A A脱脱氢酶的产量和组装效率；对可溶性氢酶的产量和组装效率；对可溶性-葡萄糖苷酶的表达也有提高葡萄糖苷酶的表达也有提高蛋白质复性蛋白质复性预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法 2. 2. 通过改变、优

18、化培养条件增加表达产物的可溶性通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性. . 为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养条件的优化方面进行了多方面的探索。条件的优化方面进行了多方面的探索。条件的优化方面进行了多方面的探索。条件的优化方面进行了多方面的探索。（I I）通过降低培养温度可以使人干扰素）通过降低培养温度可以使人干扰素）通过降低培养温度可以使人干扰素）通过降低培养温度可以使人干扰素 2

19、 2和干扰素和干扰素和干扰素和干扰素 的可溶性组分提高。这些蛋白在的可溶性组分提高。这些蛋白在的可溶性组分提高。这些蛋白在的可溶性组分提高。这些蛋白在3737下表达时以包下表达时以包下表达时以包下表达时以包含体形式存在，当将培养温度降到含体形式存在，当将培养温度降到含体形式存在，当将培养温度降到含体形式存在，当将培养温度降到23302330时时时时, ,其可其可其可其可溶性组分可达溶性组分可达溶性组分可达溶性组分可达30%90%30%90%。蛋白质复性蛋白质复性预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法 2. 2. 通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶

20、性通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性通过改变、优化培养条件增加表达产物的可溶性. .为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养条件的为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养条件的为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养条件的为了使外源蛋白在细胞中可溶性，人们在培养条件的优化方面进行了多方面的探索。优化方面进行了多方面的探索。优化方面进行了多方面的探索。优化方面进行了多方面的探索。（II II）利用丰富培养基）利用丰富培养基）利用丰富培养基）利用丰富培养基, ,可使可使可使可使T4T4噬菌体的脱氧胞苷酸噬菌体的脱氧胞苷酸噬菌体的脱氧胞苷酸噬菌体的脱

21、氧胞苷酸脱氨酶的基因进行可溶性表达，表达量占细胞可脱氨酶的基因进行可溶性表达，表达量占细胞可脱氨酶的基因进行可溶性表达，表达量占细胞可脱氨酶的基因进行可溶性表达，表达量占细胞可溶性蛋白总量的溶性蛋白总量的溶性蛋白总量的溶性蛋白总量的20%20%，而在最低培养基中，此酶，而在最低培养基中，此酶，而在最低培养基中，此酶，而在最低培养基中，此酶以包含体形式表达。以包含体形式表达。以包含体形式表达。以包含体形式表达。（IIIIII）改变培养基的渗透压、降低）改变培养基的渗透压、降低）改变培养基的渗透压、降低）改变培养基的渗透压、降低pHpH值等方法也可值等方法也可值等方法也可值等方法也可以达到减少包含

22、体的目的。通过优化发酵条件改以达到减少包含体的目的。通过优化发酵条件改以达到减少包含体的目的。通过优化发酵条件改以达到减少包含体的目的。通过优化发酵条件改善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对善基因表达产物的方法虽然可行，然而也需要对具体问题进行具体分析、实验。具体问题进行具体分析、实验。具体问题进行具体分析、实验。具体问题进行具体分析、实验。蛋白质复性蛋白质复性预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法预防包含体形成的方法 3 3通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基酸通过基因突变技术，

23、在蛋白分子中产生氨基酸通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基酸通过基因突变技术，在蛋白分子中产生氨基酸取代，来增加重组蛋白的可溶性取代，来增加重组蛋白的可溶性取代，来增加重组蛋白的可溶性取代，来增加重组蛋白的可溶性。 此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性此方法的前提是氨基酸的取代不能使蛋白的活性受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷受到影响。通过氨基酸取代，改变蛋白质表面荷电性质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含电性

24、质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含电性质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含电性质，减少蛋白分子之间聚集，从而防止包含体的形成。体的形成。体的形成。体的形成。 如如如如上上上上所所所所述述述述，多多多多种种种种因因因因素素素素影影影影响响响响外外外外源源源源基基基基因因因因的的的的可可可可溶溶溶溶性性性性表表表表达达达达。对对对对于于于于如如如如何何何何获获获获得得得得天天天天然然然然构构构构象象象象和和和和活活活活性性性性的的的的可可可可溶溶溶溶蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的技技技技术术术术方方方方法法法法，目目目目前前前前均均均均无无无无统统统统一一一一的的的的模模模模式式式式，只只

25、只只能能能能通通通通过过过过具具具具体体体体实实实实验来确定。验来确定。验来确定。验来确定。 蛋白质复性蛋白质复性蛋白质复性的主要步骤：蛋白质复性的主要步骤：破碎细胞破碎细胞破碎细胞破碎细胞 分离出包含体分离出包含体分离出包含体分离出包含体 溶解包含体溶解包含体溶解包含体溶解包含体目标构建的构型复原目标构建的构型复原目标构建的构型复原目标构建的构型复原 对复性蛋白进行纯化获对复性蛋白进行纯化获对复性蛋白进行纯化获对复性蛋白进行纯化获得高纯度的蛋白。得高纯度的蛋白。得高纯度的蛋白。得高纯度的蛋白。包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其包含体颗

26、粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其包含体颗粒内并不一定多是表达产物，也可能含有其他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等他杂物，核酸，脂类，杂蛋白等. .蛋白质复性蛋白质复性主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：主要蛋白质复性的基本步骤和联合实验如下：（1 1）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法）机械破碎（高压匀浆，高速珠磨法） 离心法提取出包含体离心法提取出包含体离心法提取出包含体离心法提取出包含体 加变

27、性剂溶加变性剂溶加变性剂溶加变性剂溶解解解解 除变性剂复性。除变性剂复性。除变性剂复性。除变性剂复性。（2 2 2 2）机械破碎）机械破碎）机械破碎）机械破碎 膜分离可溶性蛋白膜分离可溶性蛋白膜分离可溶性蛋白膜分离可溶性蛋白 变性溶解包含体变性溶解包含体变性溶解包含体变性溶解包含体 除变性剂复性。除变性剂复性。除变性剂复性。除变性剂复性。（3 3 3 3） 化学破碎（加变性剂）化学破碎（加变性剂）化学破碎（加变性剂）化学破碎（加变性剂） 离心除细胞离心除细胞离心除细胞离心除细胞碎片碎片碎片碎片 出除变性剂复性。出除变性剂复性。出除变性剂复性。出除变性剂复性。蛋白质复性蛋白质复性 路线路线1的特

28、点：的特点： 方法（方法（方法（方法（1 1）：利用了包含体与细胞破碎片的密度）：利用了包含体与细胞破碎片的密度）：利用了包含体与细胞破碎片的密度）：利用了包含体与细胞破碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性性蛋白质分开，获得包含体，再对包含体溶解后，复白质分开，获得包含体，再对包含体溶解后，复白质分开，获得包含体，再对包含体溶解后，复白质分开，获得包含体，再对包含体溶解后，复性，摆脱大量的杂蛋白，核酸，热原，内毒素等性，摆脱大量的杂蛋白，核酸，热原，内毒素等

29、性，摆脱大量的杂蛋白，核酸，热原，内毒素等性，摆脱大量的杂蛋白，核酸，热原，内毒素等杂质。杂质。杂质。杂质。 优点：分离步骤简单；优点：分离步骤简单；优点：分离步骤简单；优点：分离步骤简单； 缺点：经几次离心后，才能除去大部分细胞碎片，缺点：经几次离心后，才能除去大部分细胞碎片，缺点：经几次离心后，才能除去大部分细胞碎片，缺点：经几次离心后，才能除去大部分细胞碎片，加工时间长。加工时间长。加工时间长。加工时间长。蛋白质复性蛋白质复性蛋白质复性蛋白质复性 路线路线路线路线2 2的特点：的特点：的特点：的特点： 方法（方法（方法（方法（2 2 2 2）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可）：应用膜分离

30、技术，用微孔膜除去可）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可）：应用膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点：溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点：溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点：溶性蛋白质，但载留细胞碎片和包含体。优点：可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污可进行封闭式操作，不污染环境，也不受环境污染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致染，耗能少。缺点：膜的堵塞和浓度极化常导致可溶性蛋

31、白质的滞留，这项技术问题较多。可溶性蛋白质的滞留，这项技术问题较多。可溶性蛋白质的滞留，这项技术问题较多。可溶性蛋白质的滞留，这项技术问题较多。 蛋白质复性蛋白质复性 路线路线路线路线3 3的特点：的特点：的特点：的特点： 方法（方法（方法（方法（3 3 3 3）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解）：所用试剂即可以破菌，又可以溶解包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时包含体。将两道工序合为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合实验室操作。间，

32、比前两者更适合实验室操作。间，比前两者更适合实验室操作。间，比前两者更适合实验室操作。 缺点：混有杂质，不易分离。缺点：混有杂质，不易分离。缺点：混有杂质，不易分离。缺点：混有杂质，不易分离。蛋白质复性蛋白质复性包含体复性的方法包含体复性的方法 包包含含体体蛋蛋白白质质的的复复性性是是指指使使包包含含体体内内的的变变性性蛋蛋白白质质恢恢复复其其天天然然三三维维空空间间结结构构从从而而具具有有生生物物学学活活性性的的过过程程.一一般般分分为为以以下下几几种方法种方法: 1. 通通过过变变性性-复复性性的的方方法法获获得得正正确确构构象象和和生生物物活活性性的的重重组组蛋蛋白白.这这是是一一种种较

33、较通通用用的的方法方法.蛋白质复性蛋白质复性包含体复性的方法包含体复性的方法 将将通通过过细细胞胞破破碎碎,离离心心分分离离,多多步步清清洗洗得得到到的的”纯纯净净”包包含含体体,在在强强变变性性剂剂(58mol/L尿尿素素或或58mol/L的的盐盐酸酸胍胍)中中变变性性增增溶溶,再再将将变变性性蛋蛋白白质质稀稀释释到到适适当当的的复复性性缓缓冲冲液液中中,或或通通过过对对复复性性缓缓冲冲液液透透洗洗浓浓缩缩,最最终终得得到到重重折折叠叠的的重重组组蛋蛋白白.在在溶溶液液中中变变性性-复复性性方方法法的的关关键键是是优优化化折折叠叠液液和和操操作作步步骤骤,特特别别是是对对分分子子内内含含多多

34、个个二二硫硫键键的的蛋蛋白白质质更更是是如如此此.在在此此过过程程中中,影响复性蛋白产率的因素有影响复性蛋白产率的因素有:蛋白质复性蛋白质复性包含体复性的方法包含体复性的方法包含体复性的方法包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素： (1) (1) 复复复复性性性性蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的浓浓浓浓度度度度, ,为为为为防防防防止止止止蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子间间间间发发发发生生生生聚聚聚聚集集集集, ,复复复复性性性性蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的浓浓浓浓度度度度要要要要尽尽尽尽量量量量稀稀稀稀, ,一一一一般般

35、般般控控控控制制制制在在在在25-75 25-75 ug/mLug/mL为好为好为好为好. . (2) (2) 复复复复性性性性缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液要要要要保保保保持持持持适适适适当当当当的的的的氧氧氧氧化化化化还还还还原原原原条条条条件件件件. .一一一一般般般般GSSGGSSG（氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽）和和和和GSHGSH之比为之比为之比为之比为1 1为好为好为好为好. . (3) (3) 复性缓冲液的复性缓冲液的复性缓冲液的复性缓冲液的pHpH要通过实验来确定最适值要通过实验来确定最适值要通过实验来确定最适值要通过实验来确定最适值. . (4) (4

36、) 复复复复性性性性溶溶溶溶液液液液中中中中要要要要加加加加入入入入适适适适当当当当的的的的labilizing labilizing 试试试试剂剂剂剂, ,如如如如L L精氨酸精氨酸精氨酸精氨酸, ,可提高复性产率可提高复性产率可提高复性产率可提高复性产率. . 蛋白质复性蛋白质复性包含体复性的方法包含体复性的方法包含体复性的方法包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素： (5) (5) 复性温度也是一个影响因素复性温度也是一个影响因素复性温度也是一个影响因素复性温度也是一个影响因素, ,一般在低温下一般在低温下一般在低

37、温下一般在低温下(4-(4-1010) )进行进行进行进行. . (6) (6) 为为为为防防防防止止止止聚聚聚聚集集集集发发发发生生生生, ,复复复复性性性性时时时时, ,可可可可采采采采取取取取分分分分步步步步加加加加入入入入变变变变性蛋白的操作方法性蛋白的操作方法性蛋白的操作方法性蛋白的操作方法. . 在在在在溶溶溶溶液液液液中中中中变变变变性性性性- -复复复复性性性性方方方方法法法法受受受受各各各各种种种种因因因因素素素素的的的的影影影影响响响响, ,且且且且对对对对不不不不同同同同蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质所所所所需需需需的的的的最最最最适适适适条条条条件件件件可可可可能能能能又又又

38、又不不不不相相相相同同同同, ,因因因因此此此此对对对对于于于于一一一一个个个个特特特特定定定定重重重重组组组组蛋蛋蛋蛋白白白白的的的的复复复复性性性性要要要要通通通通过过过过实实实实验验验验找找找找出出出出最最最最适条件适条件适条件适条件. .蛋白质复性蛋白质复性包含体复性的方法包含体复性的方法包含体复性的方法包含体复性的方法 影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：影响复性蛋白产率的因素：（7 7）复性辅助因子）复性辅助因子）复性辅助因子）复性辅助因子 变性剂、糖、氨基酸、表面活性剂变性剂、糖、氨基酸、表面活性剂变性剂、糖、氨基酸、表面活性剂变性剂、糖、氨基

39、酸、表面活性剂（8 8）稀释倍数）稀释倍数）稀释倍数）稀释倍数蛋白质复性复性的影响因素 浓度 增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行 温度 蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（40） 蛋白质的聚集将十分严重蛋白质的聚集将十分严重 pH值 通常复性在弱碱性条件下（通常复性在弱碱性条件下（pH8）进行，但要注意避免）进行，但要注意避免 与蛋白的与蛋白的pI值相近值相近 折叠促进剂 L-Arg, PEG, 去污剂去污剂, 尿素和盐酸胍尿素和盐酸胍蛋白质复性蛋白质复性 复性操作方法：复性操作方法： 2. 2.稀释和透析复性稀释和透析

40、复性稀释法：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降稀释法：将溶液稀释，导致变性剂的浓度降低，蛋白质开始复性。低，蛋白质开始复性。透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性透析法：利用透析或电渗析超滤除去变性剂，使蛋白质开始复性。剂，使蛋白质开始复性。缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。缺点：透析时间长，易形成蛋白质沉淀。蛋白质复性蛋白质复性 蛋白质复性存在问题：蛋白质复性存在问题： 蛋白质复性是十分复杂过程，其中目标产蛋白质复性是十分复杂过程，其中目标产品的复性率非常低，一般不超过品的复性率非常低，一般不超过20%20%，其原，其原因在于当变性剂稳定后，蛋白质分子可能因在于当变性剂稳定后，蛋白质分子可能重新

41、聚合成二聚体，三聚体或多聚体，甚重新聚合成二聚体，三聚体或多聚体，甚至形成沉淀物。至形成沉淀物。 现有提高蛋白质复性收率有：反胶束法复现有提高蛋白质复性收率有：反胶束法复性，单克隆抗体协助复性及保护复性等。性，单克隆抗体协助复性及保护复性等。蛋白质复性蛋白质复性红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与 蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度对复性的影响蛋白质复性蛋白质复性 红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度红血球碳酐复性中盐酸胍浓度与蛋白质浓度对复性的影响对复性的影响图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。图中有复性区、多聚体区和絮凝沉淀区。降低盐酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使降低盐

42、酸胍浓度或增加蛋白质浓度都易使系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性系统进入多聚体区和絮凝区。要减少复性的损失，就必须使操作处于复性界限之上。的损失，就必须使操作处于复性界限之上。蛋白质复性蛋白质复性 复性操作方法：复性操作方法： 3.色谱复性色谱复性（1）凝胶过滤色谱为代表的非吸附型色谱。）凝胶过滤色谱为代表的非吸附型色谱。（2）吸附型色谱复性，其中常用的金属螯合）吸附型色谱复性，其中常用的金属螯合色谱复性，亲合色谱复性，离子交换色谱色谱复性，亲合色谱复性，离子交换色谱复性。复性。色谱法复性色谱复性方法原理复性蛋白凝胶色谱凝胶色谱（SEC）蛋白质蛋白质Stokes半径的半径的差异和凝胶排阻作用

43、差异和凝胶排阻作用溶菌酶，牛碳酸酐酶，溶菌酶，牛碳酸酐酶，E.coli宿主整合因子，宿主整合因子，rhETS-1，RNase A，t-PA，Heterodimeric platelet- derived growth factor疏水色谱（疏水色谱（ HIC ）蛋白质与介质的疏水蛋白质与介质的疏水性相互结合性相互结合rhIFN-，rhIFN-，重组人粒细胞集落刺激因子重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF离子交换色谱离子交换色谱（IEC）蛋白质与介质间存在蛋白质与介质间存在电荷作用力电荷作用力Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，重组白细胞分泌抑

44、制因子重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白，抗原疫苗蛋白亲和色谱亲和色谱（AFC）蛋白与配体的特异性蛋白与配体的特异性亲和吸附亲和吸附重组人朊病毒重组人朊病毒rhPrion，牛碳酸酐酶，牛碳酸酐酶，IgG蛋白质复性蛋白质复性 复性操作方法：复性操作方法： 4.凝胶过滤色谱复性凝胶过滤色谱复性 通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加通过分子筛效应将变性蛋白质与变性剂加以分离以分离,从而使变性蛋白质进入复性溶液进从而使变性蛋白质进入复性溶液进行复性行复性.举例举例举例举例: : 核糖核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶蛋白质复性蛋白质复性 包含体的复性包含体的复性包含体的复性包含体的复性

45、4. 4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性. . 一一一一般般般般的的的的做做做做法法法法是是是是将将将将1-10mg1-10mg的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质溶溶溶溶入入入入1-2mL1-2mL的的的的变变变变性性性性缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中, ,使使使使蛋蛋蛋蛋白白白白充充充充分分分分变变变变性性性性( (一一一一般般般般在在在在室室室室温温温温下下下下数数数数小小小小时时时时 或或或或 过过过过 夜夜夜夜 ), ),然然然然 后后后后 在在在在 superdex75

46、superdex75 HR10/30HR10/30或或或或sephacryI sephacryI S S系系系系列列列列柱柱柱柱上上上上进进进进行行行行蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子重重重重折折折折叠叠叠叠, ,从从从从凝凝凝凝胶胶胶胶过过过过滤滤滤滤柱柱柱柱上上上上洗洗洗洗脱脱脱脱下下下下来来来来的的的的样样样样品品品品经经经经超超超超滤滤滤滤浓浓浓浓缩缩缩缩回回回回收收收收. .利利利利用用用用此此此此法法法法成成成成功功功功地地地地使使使使分分分分子子子子内内内内有有有有9 9个个个个半半半半胱胱胱胱氨氨氨氨酸酸酸酸, ,分分分分子子子子量量量量为为为为50000Da50000

47、Da的的的的重重重重组组组组人人人人ETS-1ETS-1蛋蛋蛋蛋白白白白有有有有效效效效地地地地复复复复性性性性, ,其其其其构构构构象和天然构象相同象和天然构象相同象和天然构象相同象和天然构象相同. .蛋白质复性蛋白质复性 包含体的复性包含体的复性包含体的复性包含体的复性 4. 4.利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性利用凝胶过滤层洗，对重组蛋白进行复性. . 此此此此方方方方法法法法的的的的另另另另一一一一特特特特点点点点是是是是, ,由由由由多多多多亚亚亚亚基基基基组组组组成成成成的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白, ,变变变

48、变性性性性的的的的亚亚亚亚基基基基可可可可以以以以在在在在凝凝凝凝胶胶胶胶柱柱柱柱上上上上缔缔缔缔合合合合, ,正正正正确确确确重重重重折折折折叠叠叠叠. .对对对对于于于于在在在在凝凝凝凝胶胶胶胶柱柱柱柱上上上上进进进进行行行行重重重重折折折折叠叠叠叠的的的的机机机机理理理理尚尚尚尚不不不不十十十十分分分分清清清清楚楚楚楚, ,一一一一种种种种可可可可能能能能的的的的解解解解释释释释是是是是在在在在凝凝凝凝胶胶胶胶过过过过滤滤滤滤柱柱柱柱上上上上所所所所进进进进行行行行的的的的重重重重折折折折叠叠叠叠或或或或分分分分子子子子亚亚亚亚基基基基之之之之间间间间的的的的缔缔缔缔合合合合, ,是是是

49、是在在在在不不不不可可可可逆逆逆逆条条条条件件件件下下下下进进进进行行行行的的的的, ,因因因因而而而而克克克克服服服服了了了了在在在在溶溶溶溶液液液液中中中中常常常常规规规规重重重重折折折折叠叠叠叠过过过过程程程程中中中中所所所所遇遇遇遇到到到到的的的的主主主主要要要要问问问问题题题题-分分分分子子子子折折折折叠叠叠叠和和和和分分分分子子子子间间间间聚聚聚聚集集集集的的的的动动动动力力力力学学学学竞竞竞竞争争争争. .由由由由于于于于在在在在层层层层洗洗洗洗柱柱柱柱上上上上重重重重折折折折叠叠叠叠成成成成天天天天然然然然构构构构象象象象的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子的的的的

50、不不不不同同同同流流流流速速速速特特特特性性性性, ,它它它它们们们们不不不不断断断断地地地地从从从从平平平平衡衡衡衡中中中中被移走被移走被移走被移走, ,因此有力于变性蛋白质分子的重折叠因此有力于变性蛋白质分子的重折叠因此有力于变性蛋白质分子的重折叠因此有力于变性蛋白质分子的重折叠. .蛋白质复性蛋白质复性复性操作方法：复性操作方法： 5.亲合色谱复性亲合色谱复性利用抗原抗体利用抗原抗体, 酶与底物相互作用帮助蛋白酶与底物相互作用帮助蛋白质复性也是很有效的一种手段。将抗原或抗质复性也是很有效的一种手段。将抗原或抗体，酶或底物之一固定化在凝胶上，使复性体，酶或底物之一固定化在凝胶上，使复性在亲

51、和柱中进行。在亲和柱中进行。各种重组蛋白质复性方法的比较各种重组蛋白质复性方法的比较复性方法复性率蛋白浓度过程集成性成本传统方法(稀释、透析、超滤)蛋白浓度低时高蛋白浓度高时低低无低改进后传统方法（温度跳跃、分批进料、连续进料）较高较高无较低新方法抗体法高高无高分子伴侣法高高无高人造分子伴侣法高高无较低反向微团法高低无较低双水相法不明不明将包涵体的溶解与蛋白的复性过程集成较低色谱法高高将蛋白的复性与纯化过程集成较低蛋白质复性蛋白质复性复性效果的检测与评价复性效果的检测与评价1.凝胶电泳凝胶电泳2.光谱学方法光谱学方法3.色谱学方法色谱学方法4.黏度与浊度黏度与浊度5.免疫学方法免疫学方法6.生物学活性及比活性测定生物学活性及比活性测定