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1、专题专题1基因工程基因工程基因工程基因工程又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNA重组技术重组技术。是在生物体外，通过对是在生物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪剪切切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行改造和重新组，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出在受体细胞内表达，产生出人类所需要的新的生物类人类所需要的新的生物类型和生物产品。型和生物产品。基础理论基础理论和技术的发展和技术的发展催生了基因工程催生了基因工程阅读课本第阅读课本第2页页1.1DNA重组技术的基本工具
2、重组技术的基本工具n是在生物体外，通过对是在生物体外，通过对DNA分子进行人工分子进行人工“剪切剪切”和和“拼接拼接”，对生物的基因进行改，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出生出人类所需要的新的生物类型和生物产品人类所需要的新的生物类型和生物产品分析概念分析概念：工工具具为什么为什么要加工要加工什么是什么是表达表达用什么用什么导入导入基因操作的基本工具基因操作的基本工具基因的剪刀（分子手术刀）基因的剪刀（分子手术刀）限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切
3、酶（限制酶）基因的针线（分子缝合针）基因的针线（分子缝合针）DNA连接酶连接酶基因的运输工具（分子运输车）基因的运输工具（分子运输车）运载体运载体到哪里去寻找这种酶到哪里去寻找这种酶（1）限制酶）限制酶n分布：主要在原核生物中。分布：主要在原核生物中。n作用特点作用特点:专一性，识别特定核苷酸序列，专一性，识别特定核苷酸序列，切割特定切点。切割特定切点。n结果：产生黏性未端和平末端结果：产生黏性未端和平末端n举例：举例：EcoR1限制酶、限制酶、Sma1限制酶限制酶与我们学过的与我们学过的DNA酶相同吗？酶相同吗？识别序列的特点识别序列的特点作用是什么作用是什么两者的区别两者的区别这两种酶切的
4、特点这两种酶切的特点切断的是什么键切断的是什么键限制酶的识别特点限制酶的识别特点n以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列上碱基呈反向对称，重复排列nn如：如：GAATTCCCCGGGnCTTAAGGGGCCC两种不同的末端两种不同的末端GAATTCCTTAAGCCCGGG GGGCCCGA ATTCCTTAA GCCC GGG GGG CCC黏性末端黏性末端平末端平末端（2）DNA连接酶连接酶n连接的部位：连接的部位：磷酸和脱氧核糖之间的键：磷酸和脱氧核糖之间的键：磷酸二酯键（梯子的扶手）磷酸二酯键（梯子的扶手）n结果：使两个相同的未端的连接。结果：使两个相同的未端的连接
5、。n举例：举例：EcoliDNA连接酶连接酶nT4DNA连接酶连接酶与与DNA聚合酶聚合酶相同吗相同吗二者在性质二者在性质上的区别上的区别DNA分分子子的的切切割割与与连连接接（3）运载体）运载体作用：将外源基因送入受体细胞。作用：将外源基因送入受体细胞。具备的条件：具备的条件：能在宿主细胞内复制，并稳定地保存。能在宿主细胞内复制，并稳定地保存。具有多个限制酶切点。具有多个限制酶切点。具有某些标记基因具有某些标记基因对受体细胞无害对受体细胞无害举例：质粒、噬菌体举例：质粒、噬菌体和动植物病毒。和动植物病毒。为什么为什么要具备要具备这些条件这些条件1.2基因工程的基因工程的基本操作程序基本操作程
6、序为什么要获得目的基因为什么要获得目的基因为什么要把目的基因为什么要把目的基因与载体结合与载体结合受体细胞是指什么受体细胞是指什么为什么要进行检测为什么要进行检测第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因方法方法：1.从基因文库中获取目的基因。从基因文库中获取目的基因。基因文库的构建模式图基因文库的构建模式图通过对通过对受体菌的受体菌的培养而培养而储存基因储存基因第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因方法方法：1.从基因文库中获取目的基因。从基因文库中获取目的基因。2.利用利用PCR技术合成技术合成DNAPCR:聚合酶链式反应聚合酶链式反应.是以是以DNA变性、复制的变性、复制的某些特性为原理
7、设计的某些特性为原理设计的.前提条件是必须对目的基因有一定的了解，前提条件是必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。需要设计引物。PCR原原理理图图PCR的过程的过程（1）以）以DNA片段作模板，在片段作模板，在90高温下，分开成高温下，分开成为为单链单链DNA。（2）以）以DNA小段寡聚核苷酸做引物，在小段寡聚核苷酸做引物，在50的温度的温度下，找到可以配对的正链和负链，形成互补结合下，找到可以配对的正链和负链，形成互补结合（3）在）在70高温下，合成一条与模板高温下，合成一条与模板DNA单链（正单链（正链或负链）互补结合的链或负链）互补结合的DNA新链。新链。（4）以上三个步骤周而复始，
8、即反应体系的温度从）以上三个步骤周而复始，即反应体系的温度从90oC-50oC-75oC，目的基因的量不断增加，目的基因的量不断增加n反应体系中经历：变性反应体系中经历：变性淬火淬火合成合成重复重复。n结果：目的基因的量成指数形式扩增（结果：目的基因的量成指数形式扩增（2n)高温的作用是？高温的作用是？引物是怎样获得的？引物是怎样获得的？四种脱氧核苷三磷酸（四种脱氧核苷三磷酸（4XdNTP)酶酶高温高温DNA聚合酶聚合酶（Taq酶），酶），原料原料第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因方法方法：1.从基因文库中获取目的基因。从基因文库中获取目的基因。2.利用利用PCR技术合成技术合成DNA3
9、.mRNA差异显示法获得目的基因差异显示法获得目的基因（反转录）（反转录）由由mRNA反转录形成反转录形成cDNAnmRNADNA单链单链nDNA单链单链RNADNA杂交分子杂交分子nRNADNA杂交分子杂交分子单链单链DNAn单链单链DNA双链双链DNA逆转录逆转录使使RNA降解降解复制复制核酸酶核酸酶H?形成氢键形成氢键第一步：获取目的基因第一步：获取目的基因方法方法：1.从基因文库中获取目的基因。从基因文库中获取目的基因。2.利用利用PCR技术合成技术合成DNA3.mRNA差异显示法获得目的基因差异显示法获得目的基因（反转录）（反转录）4.采用采用DNA合成仪人工合成长度不是很大的合成仪
10、人工合成长度不是很大的DNA片段。片段。5.用机械的方法，如超声波把打成片段。用机械的方法，如超声波把打成片段。原原核核生生物物基基因因表表达达的的调调 控控乳糖代谢基因表达调控图解：乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时有乳糖时) lacZ lacY lacA 调节基调节基 因因启动启动 子子 操纵基操纵基 因因结构基结构基 因因RNA聚合酶聚合酶信使信使 RNA转转 录录翻翻 译译阻抑物阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与 操纵基因结合，使得结构基因进行转录。操纵基因结合，使得结构基因进行转录。阻抑阻抑 物物乳糖乳糖 转转 录录半乳糖苷酶半乳糖苷
11、酶 酶酶酶酶第二步：第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的构建核心核心目的基因与载体结合成为重组基因目的基因与载体结合成为重组基因需要需要哪两种哪两种工具工具总结：表达载体需由哪几部分组成总结：表达载体需由哪几部分组成n复制原点复制原点n启动子启动子n目的基因目的基因n终止子终止子n标记基因标记基因它们的作用是？它们的作用是？第三步：将目的基因导入受体细胞第三步：将目的基因导入受体细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞什么叫转化什么叫转化常用的转化方法有哪些？常用的转化方法有哪些？具体过程？
12、具体过程？第四步：目的基因的检测与鉴定第四步：目的基因的检测与鉴定n首先：首先：n其次：其次：n最后：最后：n还要：还要：检测与鉴定哪些环节检测与鉴定哪些环节具体具体方法？方法？DNA分子杂交技术分子杂交技术n基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸基因探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待片段，能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。测核酸样品中特定基因顺序的探测。n满足：（满足：（1）必须是单链，（）必须是单链，（2）带有容易）带有容易被检测出来的标记物。被检测出来的标记物。编码区上游编码区下游RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶
13、结合位点编码蛋白质调控调控原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞真核细胞1、3基因工程的应用基因工程的应用转基因生物转基因生物目的基因目的基因目的基因来源目的基因来源抗虫植物抗虫植物Bt毒蛋白基因毒蛋白基因苏云金芽胞杆菌苏云金芽胞杆菌（如：抗虫（如：抗虫蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂基因植物植物棉）棉）淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因植物凝集素基因植物凝集素基因抗病植物抗病植物病毒外壳蛋白基因病毒外壳蛋白基因（如：转基（如：转基病毒的复制酶基因病毒的复制酶基因因烟草）因烟草）几丁质酶基因几丁质酶基因请继续把表格完成请继续把表格完成抗逆转基因植物抗逆转基因植物 抗冻蛋白基因抗冻蛋白基因鱼鱼抗除草剂基因抗
14、除草剂基因转基因玉米转基因玉米富含赖氨酸的蛋白质编码基因富含赖氨酸的蛋白质编码基因转基因延熟番茄转基因延熟番茄 控制番茄果实成熟的基因控制番茄果实成熟的基因转基因矮牵牛转基因矮牵牛植物花青素代谢有关的基因植物花青素代谢有关的基因转基因鲤鱼转基因鲤鱼外源生长激素基因外源生长激素基因人人转基因牛转基因牛肠乳糖酶基因肠乳糖酶基因人人转基因牛（羊）转基因牛（羊） 抗凝血酶基因、血清白蛋白基抗凝血酶基因、血清白蛋白基因、生长激素基因、因、生长激素基因、a-抗胰蛋抗胰蛋白酶白酶转基因烟草转基因烟草发光基因发光基因萤火虫萤火虫工程菌工程菌细胞因子、抗体、疫苗、细胞因子、抗体、疫苗、激素、白细胞介素激素、白细
15、胞介素-2、干、干扰素、乙肝疫苗扰素、乙肝疫苗基因治疗基因治疗腺苷酸脱氨酶基因腺苷酸脱氨酶基因功能正常的基因功能正常的基因反义基因反义基因自杀基因自杀基因器官移植的供体器官移植的供体动物动物被导入某种调节因子的器被导入某种调节因子的器官供体基因组官供体基因组1、4蛋白质工程的崛起蛋白质工程的崛起n蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念n是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地为地设计设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。或者或者从蛋
16、白质结构与功能的关系出发，定向地从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造改造天然天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。新型的蛋白质。一、蛋白质的改造一、蛋白质的改造n干扰素在体外保存困难n玉米中赖氨酸含量比较低将分子中的一个半胱氨酸转变成丝氨酸将分子中的一个半胱氨酸转变成丝氨酸第第104位的位的天冬酰胺天冬酰胺变成变成异亮氨酸异亮氨酸第第352位的位的苏氨酸苏氨酸变成变成异亮氨酸异亮氨酸解除赖氨酸对酶活性的限制解除赖氨酸对酶活性的限制赖氨酸赖氨酸天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶二氢吡啶二羧酸合成酶二氢吡啶二羧酸合成酶二、蛋白质
17、工程的基本原理二、蛋白质工程的基本原理天然蛋白质的合成过程时怎样的？天然蛋白质的合成过程时怎样的？遵循中心法则，并需经过高级空间结构的转变遵循中心法则，并需经过高级空间结构的转变蛋白质工程的途径蛋白质工程的途径预期蛋白质功能预期蛋白质功能设计蛋白质结构设计蛋白质结构推测氨基酸序列推测氨基酸序列相应的脱氧核苷酸序列（基因）相应的脱氧核苷酸序列（基因）投入生产投入生产依赖于什么工程依赖于什么工程根据什么预期根据什么预期包括哪些方面的结构包括哪些方面的结构依据是什么依据是什么n讨论：某多肽链的一段氨基酸序列是：n丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应
18、的碱基序列写出来。有多少种？n（2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？（1）怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？请把相应的碱基序列写出来。有多少种？n（2）确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因（DNA）？mRNA序列为：序列为：GCU（或（或C或或A或或G）UGGAAA（或（或G）AUGUUU（或（或C）脱氧核苷酸序列：脱氧核苷酸序列：CGA（或（或G或或T或或C）ACCTTT（或（或C）TACAAA（或（或G）。）。16种种确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改确定目的基因的碱基序列后，就可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法
19、或从基因库中获取。造它，通过人工合成的方法或从基因库中获取。蛋白质工程操作程序的基本思路与蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程的不同基因工程的不同n基因工程基因工程是遵循中心法则，是遵循中心法则，n从从DNAmRNA蛋白质蛋白质折叠产生功能，折叠产生功能，n生产出自然界已有的蛋白质。生产出自然界已有的蛋白质。n蛋白质工程是蛋白质工程是：确定蛋白质的功能：确定蛋白质的功能蛋白质应蛋白质应有的高级结构有的高级结构蛋白质应具备的折叠状态蛋白质应具备的折叠状态应应有的氨基酸序列有的氨基酸序列应有的碱基排列，应有的碱基排列，n创造自然界不存在的蛋白质创造自然界不存在的蛋白质。蛋白质工程的进展和前景蛋白
20、质工程的进展和前景n1、蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件的，蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件的，它是随着它是随着分子生物学分子生物学、晶体学晶体学以及以及计算机技术计算机技术的发展而诞生的，与的发展而诞生的，与基因组学基因组学、蛋白质组学蛋白质组学、生物信息学生物信息学的发展等因素有关的发展等因素有关n2、现状：成功的例子不多，、现状：成功的例子不多，主要是因为蛋白质主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科发挥其功能需要依赖于正确的空间结构，而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。酶工程简介酶工程简介n酶工程就是指将酶所具
21、有的生物催化作用，借酶工程就是指将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。由断和环境保护等方面的一门科学技术。由酶制酶制剂的生产剂的生产和和应用应用两方面组成的。两方面组成的。酶工程酶工程通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存酶通常是用工程菌生产酶制剂，重点在于对已存酶的合理充分利用。的合理充分利用。蛋白质工程蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
