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1、3 3 细胞工程细胞工程学习目的学习目的 了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。学习如何进体并进行细胞融合的基本方法。学习如何进行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。领会人类干细胞研究的原理和其重要意义。领会人类干细胞研究的原理和光明前景。光明前景。细胞工程(
2、shi)3.1 细胞工程的基础知识与基本技术细胞工程的基础知识与基本技术细胞工程细胞工程3细胞工程细胞工程3.1.1基础知识基础知识原核细胞：原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细要同步化培养；生长慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。胞具细胞壁。细胞工程(shi)3.1.2基本操作基本操作3.1.2.1无菌操作概念与技术无菌操作概念与技术细胞工程细胞工程3.1细胞工程的基础知识与基本技
3、术细胞工程的基础知识与基本技术无菌室布局、卫生、无菌室布局、卫生、消毒、超净台消毒、超净台细胞工程(shi)3.1.2.2细胞培养技术细胞培养技术取样取样灭菌灭菌培养培养传代传代收获收获除菌除菌取样取样3.1.2.3细胞融合技术细胞融合技术原生质体原生质体融合融合筛选筛选鉴定鉴定细胞工程细胞工程3.1.2基本操作基本操作细胞工程(shi) 3.2 3.2 植物细胞工程植物细胞工程细胞工程细胞工程3细胞工程细胞工程n植物组织培养植物组织培养n悬浮细胞培养和次生代谢物生产悬浮细胞培养和次生代谢物生产n花药及单倍体植株培养花药及单倍体植株培养n原生质体制备与细胞融合原生质体制备与细胞融合n人工种子制
4、备人工种子制备n植物脱病毒技术植物脱病毒技术细胞工程(shi)3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程细胞工程3.2植物细胞工程植物细胞工程在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。技术。全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。蔬菜和花卉等实现商品化生产。细胞工程(shi)离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细
5、胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化芽芽根根植植物物体体培养培养细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养植物组培的基本过程植物组培的基本过程细胞工程(shi)细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程(shi)n选择合适的外植体外植体大小要适宜外植体大小要适宜外植体的部位影响分化能力和器官分化类型外植体的部位影响分化能力和器官分化类型外植体的年龄影响其分化率外植体的年龄影响其分化率同一植物不同部位的分化需不同的生长素同一植物不同部位的分化需不同的生长素/激激动素比例动素比例不同物种的相同部位外植体分化能力不一样不同物种的相同部位外植体分化能力不一样3.2.1
6、.1预备阶段预备阶段细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程(shi)n除菌与接种除菌与接种 自来水多次漂洗自来水多次漂洗 消毒剂处理消毒剂处理 无菌水反复冲洗无菌水反复冲洗外植体外植体 无菌滤纸吸干无菌滤纸吸干 切割切割无菌无菌外植体外植体细胞工程细胞工程3.2.1.1预备阶段预备阶段小块外植体小块外植体置培养基上置培养基上培养培养细胞工程(shi)消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度/%清除清除消毒时间消毒时间/min灭菌效果灭菌效果次氯酸钠次氯酸钠2容易容易530很好很好次氯酸钙次氯酸钙910容易容易530很好很好漂白粉漂白粉饱和溶液饱和溶液容易容易530很好很好升汞升汞0.1
7、1较难较难210最好最好酒精酒精7075容易容易0.22好好过氧化氢过氧化氢1012最容易最容易515好好溴水溴水12容易容易210很好很好硝酸银硝酸银1较难较难530好好抗生素抗生素450mg/L中等中等3060较好较好常用消毒剂的使用和效果常用消毒剂的使用和效果细胞工程细胞工程3.2.1.1预备阶段预备阶段细胞工程(shi)n基本组分基本组分n微量无机物微量无机物n微量有机物微量有机物n琼脂琼脂细胞工程细胞工程3.2.1.1预备阶段预备阶段n培养基配置培养基配置细胞工程(shi)添加较高浓度的生长素添加较高浓度的生长素固体培养固体培养液体培养液体培养光照培养光照培养黑暗培养黑暗培养3.2.
8、1.2诱导去分化阶段诱导去分化阶段细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程(shi)n吲哚乙酸（吲哚乙酸（IAA）,常用常用110mg/Ln吲哚丁酸（吲哚丁酸（IBA）,常用常用15mg/Ln2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸），常用二氯苯氧乙酸），常用10-510-7mol/Ln萘乙酸（萘乙酸（NAA），常用），常用1.0mg/L生长素类激素生长素类激素细胞工程细胞工程3.2.1.2诱导去分化阶段诱导去分化阶段细胞工程(shi)细胞分裂素类激素细胞分裂素类激素n激动素（激动素（KT）n6-苄氨基嘌呤（苄氨基嘌呤（6-BA）n玉米素玉米素先加少量先加少量碱液预溶碱液预溶细胞工程
9、细胞工程3.2.1.2诱导去分化阶段诱导去分化阶段细胞工程(shi)3.2.1.3 继代增殖阶段继代增殖阶段n移植扩增移植扩增n分割继代分割继代细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程(shi)光照培养室光照培养室细胞工程细胞工程3.2.1.3继代增殖阶段继代增殖阶段细胞工程(shi)n生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同，对有协同作用，它们的量以及比例的不同，对细胞分化起着重要的作用。细胞分化起着重要的作用。n外植体本身内源激素水平的差异，导致它们外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中
10、所添加的这两种激素量及分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同。其比例反应不尽相同。3.2.1.4生根长芽阶段生根长芽阶段细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程(shi)细胞工程细胞工程3.2.1.4生根长芽阶段生根长芽阶段细胞工程(shi)n保湿是关键保湿是关键n避免强光直射避免强光直射n温度适宜温度适宜3.2.1.5移栽成活阶段移栽成活阶段细胞工程细胞工程3.2.1植物组织培养植物组织培养细胞工程(shi)手指玫瑰手指玫瑰细胞工程细胞工程3.2.1.5移栽成活阶段移栽成活阶段细胞工程(shi)3.2.2 3.2.2 植物细胞培养和次生代谢物生产植物细胞培
11、养和次生代谢物生产细胞工程细胞工程3.2植物细胞工程植物细胞工程植物细胞培养罐细胞工程(shi)产量产量物物种种天然产物天然产物细胞培养细胞培养原植物原植物橘叶鸡眼藤蒽醌900g/g干重110g/g干重决明蒽醌鲜重的0.334%种子干重的0.21%长春花蛇根碱干重的1.3%干重的0.26%三角叶薯蓣薯蓣皂苷26mg/g干重20mg/g干块根人参人参皂角苷鲜重的0.38%鲜重的0.3%3.3%烟草烟碱干重的3.4%干重的2%5%烟草泛醌0.5mg/g干重16mg/g干叶大红罂粟蒂巴因130mg/g干重140mg/g干叶细胞培养细胞培养和和原植物原植物的天然产物量的比较的天然产物量的比较细胞工程细
12、胞工程3.2.2植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产细胞工程(shi)u氨基酸、核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类、维生氨基酸、核酸、蛋白质、碳水化合物、脂类、维生素、有机酸素、有机酸u抗白血病药、抗肿瘤药、抗病毒药、抗微生物药、抗白血病药、抗肿瘤药、抗病毒药、抗微生物药、酶抑制剂酶抑制剂u色素、香料、甜味剂、鸦片、杀虫剂、激素、强心色素、香料、甜味剂、鸦片、杀虫剂、激素、强心苷、核苷酸苷、核苷酸u橡胶、阿司匹林、奎宁、可卡因橡胶、阿司匹林、奎宁、可卡因从植物培养细胞中获得的各类物质从植物培养细胞中获得的各类物质细胞工程细胞工程3.2.2植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细
13、胞培养和次生代谢物的生产细胞工程(shi)1.成批培养（封闭式培养）成批培养（封闭式培养）优点：易于操作；优点：易于操作；次生代谢物含量高。次生代谢物含量高。缺点：效率低。缺点：效率低。2.半连续和连续培养半连续和连续培养封闭式植物细胞培养系统封闭式植物细胞培养系统3.2.2.1悬浮培养悬浮培养细胞工程细胞工程3.2.2植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产细胞工程(shi)l次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性v细胞固定化有利于组织化的形成；细胞固定化有利于组织化的形成；v细胞固定化有利于在细胞团内外形成化学物质和细胞固定化有利于
14、在细胞团内外形成化学物质和物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；v细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；v细胞固定化有利于回收次生代谢物。细胞固定化有利于回收次生代谢物。3.2.2.2固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统细胞工程细胞工程3.2.2植物细胞培养和次生代谢物的生产植物细胞培养和次生代谢物的生产细胞工程(shi)n平床培养系统平床培养系统优点：制作简单；优点：制作简单；能生产较多次生代谢物。能生产较多次生代谢物。缺点：占地面积大；缺点：占地面积大；分化区比例较小；分化区比例较小；02供应受限。供应受限
15、。细胞工程细胞工程3.2.2.2固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统细胞工程(shi)褐藻酸钙固定细胞褐藻酸钙固定细胞无菌大量培养植物细胞无菌大量培养植物细胞等量混合等量混合注入尼龙网注入尼龙网配制配制4%褐藻酸钠，灭菌褐藻酸钠，灭菌氯化钙溶液（氯化钙溶液（2%）浸浴）浸浴褐藻酸钙固定的细胞团褐藻酸钙固定的细胞团n立柱培养系统立柱培养系统细胞工程细胞工程3.2.2.2固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统细胞工程(shi)立柱培养系统示意图立柱培养系统示意图细胞工程细胞工程3.2.2.2固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统细胞工程(shi)立柱培养系统操作要素立柱培养系统操作要素v取静止期细胞，
16、并使细胞达到一定密度；取静止期细胞，并使细胞达到一定密度；v控制营养液的成分（包括激素）、浓度及控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2供应；供应；v某些种的细胞培养需光照；某些种的细胞培养需光照；v尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）。胞内释出的植物（品种）。细胞工程细胞工程3.2.2.2固定化细胞培养系统固定化细胞培养系统细胞工程(shi)3.2.3 3.2.3 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合细胞工程细胞工程3.2植物细胞工程植物细胞工程植物原生质体细胞工程(shi)几个名词：几个名词：n原生质体（原生质体（pro
17、toplast):去除全部细胞壁的细胞去除全部细胞壁的细胞n亚原生质体（亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生质的只含有部分原生质的原生质体（有核或无核）原生质体（有核或无核）n微原生质体（微原生质体（miniprotoplast):经细胞松弛素经细胞松弛素B处理处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体n原生质球（球状体，原生质球（球状体，spheroplast):残存少量细胞壁残存少量细胞壁的原生质体的原生质体细胞工程细胞工程3.2.3植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合细胞工程(shi)n外植体除菌外植体除菌n外植体
18、酶解外植体酶解（纤维素酶为主）（纤维素酶为主） 除菌后叶片除菌后叶片 撕去下表皮撕去下表皮 切块放入反应切块放入反应 不时轻摇不时轻摇 反应液转绿反应液转绿 细胞工程细胞工程3.2.3 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合253024h3.2.3.1原生质体的制备原生质体的制备细胞工程(shi)原生质体分离原生质体分离p过滤法过滤法p离心法（低速）离心法（低速）p漂浮法（不同比重）漂浮法（不同比重） 细胞工程细胞工程3.2.3.1 原生质体的制备原生质体的制备细胞工程(shi)双亲本双亲本原生质体原生质体滴加聚滴加聚乙二醇乙二醇2525保温保温151545min45min滴加高钙滴加高
19、钙高高pHpH溶液溶液培养液培养液洗洗涤涤筛选筛选鉴定鉴定目的目的植株植株 细胞工程细胞工程 3.2.3 植物原生质体制备与融合植物原生质体制备与融合3.2.3.2原生质体的融合原生质体的融合细胞工程(shi)野生马铃薯和栽培马铃薯细胞融合融合前融合前融合融合2min融合融合3min融合融合10min 细胞工程细胞工程3.2.3.2 原生质体的融合原生质体的融合细胞工程(shi)设想中的设想中的设想中的设想中的“番茄番茄番茄番茄- - - -马铃薯马铃薯马铃薯马铃薯” 细胞工程细胞工程3.2.3.2 原生质体的融合原生质体的融合细胞工程(shi)3.2.4 单倍体植物的诱发与利用单倍体植物的诱
20、发与利用 细胞工程细胞工程3.2 植物细胞工程植物细胞工程u单倍体植物的特点单倍体植物的特点一套染色体一套染色体株矮，叶、花、果小，生活力弱株矮，叶、花、果小，生活力弱高度不育高度不育加倍后可得到纯合隐性基因表达植株加倍后可得到纯合隐性基因表达植株细胞工程(shi)单倍体植株的培育单倍体植株的培育u选取成熟度适中的花药选取成熟度适中的花药u离体成熟花粉培养离体成熟花粉培养u未授粉子房或胚珠的培养未授粉子房或胚珠的培养u杂交法获单倍体植株杂交法获单倍体植株u选择适当的培养基（添加激素、脯氨酸等）u适当密植 细胞工程细胞工程3.2.4 单倍体植物的诱发与利用单倍体植物的诱发与利用细胞工程(shi)
21、单倍体植物的加倍单倍体植物的加倍秋水仙素（0.2%0.4%）处理 2448h全苗或根或芽处理后洗净，弱光保湿培养 细胞工程细胞工程3.2.4 单倍体植物的诱发与利用单倍体植物的诱发与利用细胞工程(shi)3.2.5 3.2.5 人工种子的研制人工种子的研制 细胞工程细胞工程3.2 植物细胞工程植物细胞工程细胞工程(shi)人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成分、人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。激素以及其他成分的人工胶囊。人工种子的构成人工种子的构成：n胚状体：由组织培养或细胞培养产生胚状体：由组织培养或细胞培养产生n人工胚乳：营养物质人工胚乳：营养物质+激素
22、激素+农药农药+抗生素抗生素+除草剂等除草剂等n人工种皮：抗压，保水，透气人工种皮：抗压，保水，透气 细胞工程细胞工程3.2.5 人工种子的研制人工种子的研制3.2.5.1人工种子的构成及特点人工种子的构成及特点细胞工程(shi)人工种子的优点人工种子的优点v不受环境因素制约不受环境因素制约, , 全年进行工厂化生产全年进行工厂化生产 v无性繁殖有利于保存该种系的优良性状无性繁殖有利于保存该种系的优良性状v成本低，适合于机械化播种成本低，适合于机械化播种 v可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长剂等，以利胚状体的健康生长 细胞工程
23、细胞工程3.2.5.1 人工种子的构成及特点人工种子的构成及特点细胞工程(shi)胚状体胚状体褐藻酸钠褐藻酸钠（终浓度（终浓度4%）混匀混匀合成胚乳合成胚乳1015minCaCl2（2.0 % 2.5 %）圆形圆形胶囊胶囊圆形人工种子圆形人工种子无菌水漂洗无菌水漂洗干燥处理干燥处理捞起捞起3.2.5.2人工种子的制备人工种子的制备 细胞工程细胞工程3.2.5 人工种子的研制人工种子的研制细胞工程(shi) 细胞工程细胞工程3.2.5.2 人工种子的制备人工种子的制备细胞工程(shi)反应池CaCl2储罐多管滴嘴 细胞工程细胞工程3.2.5.2 人工种子的制备人工种子的制备大大大大量量量量制制制
24、制备备备备人人人人工工工工种种种种子子子子细胞工程(shi)n物理方法：温度（高温）物理方法：温度（高温）n化学方法：孔雀绿等（难）化学方法：孔雀绿等（难）n生物学方法：芽尖、根尖生物学方法：芽尖、根尖n综合脱毒方法综合脱毒方法3.2.6.1植物脱毒途径植物脱毒途径 细胞工程细胞工程3.2 植物细胞工程植物细胞工程3.2.6 植物脱病毒技术植物脱病毒技术细胞工程(shi)生物学方法生物学方法茎尖培养茎尖培养茎尖越小越没病毒，但越小越茎尖越小越没病毒，但越小越难成活难成活,一般要超过一般要超过2万个细胞，或万个细胞，或至少至少310mg茎尖。茎尖。花瓣培养花瓣培养花药培养花药培养 细胞工程细胞工
25、程3.2.6.1 植物脱毒途径植物脱毒途径细胞工程(shi)植物脱毒处理植物脱毒处理植物茎除菌除菌超净台无菌植物茎超净台无菌切割无菌茎尖无菌培养无菌培养无菌苗脱毒苗检测检测 细胞工程细胞工程3.2.6.1 植物脱毒途径植物脱毒途径细胞工程(shi)种子脱毒种子脱毒n诱导植物进入种子繁殖阶段，形成种子、诱导植物进入种子繁殖阶段，形成种子、未成熟种子或种子胚未成熟种子或种子胚n检验其是否带毒检验其是否带毒n取无病毒种子胚进行组培快速繁殖取无病毒种子胚进行组培快速繁殖浙江大学专利（浙江大学专利（2004） 细胞工程细胞工程3.2.6.1 植物脱毒途径植物脱毒途径细胞工程(shi)v外形观察法外形观察
26、法v电镜法电镜法v免疫血清法免疫血清法离心去渣植物组织匀浆植物组织匀浆上清液上清液纯化病毒纯化病毒待检植物匀浆上清液动物免疫动物免疫抗血清（抗体）抗血清（抗体）免疫检测免疫检测3.2.6.2植物脱毒检测植物脱毒检测 细胞工程细胞工程3.2.6 植物脱病毒技术植物脱病毒技术细胞工程(shi)植物脱病毒进展植物脱病毒进展n脱毒马铃薯（青海）脱毒马铃薯（青海）染病毒的普通马铃薯亩产约染病毒的普通马铃薯亩产约1 1吨，脱病毒的马铃吨，脱病毒的马铃薯亩产达薯亩产达4 4吨。吨。n脱毒草莓脱毒草莓鲜红色，酸甜适口，果汁丰润，果香四溢。鲜红色，酸甜适口，果汁丰润，果香四溢。n脱毒唐菖蒲脱毒唐菖蒲长势旺盛，花
27、色艳，品质提高长势旺盛，花色艳，品质提高1 12 2个等级。个等级。n脱毒水仙脱毒水仙鳞茎大，花枝多，花期长。鳞茎大，花枝多，花期长。 细胞工程细胞工程3.2.6 植物脱病毒技术植物脱病毒技术细胞工程(shi)3.3 3.3 动物细胞工程动物细胞工程细胞工程细胞工程3细胞工程细胞工程n动物细胞与组织培养动物细胞与组织培养n动物细胞融合动物细胞融合n动物细胞核移植与胚胎克隆动物细胞核移植与胚胎克隆n淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体n染色体转移与基因转移染色体转移与基因转移细胞工程(shi)l细胞系细胞系（cellline)原代培养物经首次传代成功后的细原代培养物经首次传代成功
28、后的细胞培养物，包括有限细胞系和连续细胞胞培养物，包括有限细胞系和连续细胞系。系。l细胞株细胞株（cellstrain)通过选择或克隆从原代培养物或通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物。培养物。 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程细胞工程(shi)制备动物细胞制备动物细胞无菌取出目的组织无菌取出目的组织 无菌组织无菌组织 小组织块小组织块 细胞细胞 移放培养瓶移放培养瓶抗生素漂洗抗生素漂洗离心洗涤离心洗涤 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程培养液漂洗培养液漂洗切割切割解离液解离液3.3.1.1细胞培养
29、法3.3.1动物细胞组织培养动物细胞组织培养细胞工程(shi) 细胞工程细胞工程3.3.1.1细胞培养法细胞培养法细胞工程(shi)n微导管法微导管法以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维管，以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维管，搭成多层培养床。管内通空气，管外为培养液搭成多层培养床。管内通空气，管外为培养液n微载体法微载体法葡萄糖等聚合物形成直径葡萄糖等聚合物形成直径50500m的微球的微球悬浮培养液中悬浮培养液中细胞贴附生长细胞贴附生长n微胶囊法微胶囊法细胞与褐藻酸钠混合液细胞与褐藻酸钠混合液滴入滴入CaCl2中中褐藻酸钙胶囊褐藻酸钙胶囊悬浮培养悬浮培养 细胞工程细胞工程3.3.1.1 细
30、胞培养法细胞培养法细胞工程(shi)动物细胞动物细胞培养器培养器 细胞工程细胞工程3.3.1.1细胞培养法细胞培养法细胞工程(shi)动物表面消毒动物表面消毒 获组织获组织 小组织块小组织块 无菌刀切无菌刀切加培养液加培养液 吸放培养瓶吸放培养瓶 组织块组织块长大长大传代传代众多组织块众多组织块培养液、抗生素漂洗培养液、抗生素漂洗解剖解剖静置培养静置培养（37）3.3.1.2组织培养法组织培养法 细胞工程细胞工程3.3.1动物细胞组织培养动物细胞组织培养细胞工程(shi)培养细胞培养细胞 贴壁细胞游离贴壁细胞游离弃上清弃上清细胞沉淀细胞沉淀 悬浮细胞悬浮细胞培养培养 细胞工程细胞工程 3.3.
31、1动物细胞组织培养动物细胞组织培养加新培养液加新培养液分瓶分瓶离心离心胰酶胰酶EDTA3.3.1.3培养物的传代培养物的传代细胞工程(shi)3.3.1.4无血清培养细胞和组织的体外培养一般都需添加一定量的血清，不仅价格昂贵、容易混进污染物(包括病毒和病菌)，而且其成分不能完全确定，不同批次的血清之间难以保证实验结果的可重复性。因此无血清培养日益受到重视，并已取得了较大的进展。 细胞工程细胞工程 3.3.1动物细胞组织培养动物细胞组织培养细胞工程(shi)3.3.1.5培养物的长期保存目前最常用的是液氮保存法：n将成熟培养物(细胞)与5%10%的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓿瓶中；n缓慢
32、降温(13/min)至-30；n继续降温(1530/min)至-150；n转移至液氮冻存，可无限期保存。 细胞工程细胞工程 3.3.1动物细胞组织培养动物细胞组织培养细胞工程(shi)n微生物污染微生物污染o细菌污染细菌污染o真菌污染真菌污染o支原体污染支原体污染o病毒污染病毒污染n其他细胞污染其他细胞污染3.3.1.6细胞组织培养污染的防治细胞组织培养污染的防治 细胞工程细胞工程 3.3.1动物细胞组织培养动物细胞组织培养细胞工程(shi) 污染源污染源 治治 理理细菌细菌青霉素（青霉素（200U/mL),链霉素（链霉素（200g/mL)真菌真菌制霉菌素（制霉菌素（100U/mL)支原体支原
33、体卡那霉素（卡那霉素（100g/mL，不能根除，不能根除)病毒病毒？其他细胞其他细胞1.同一工作面不能有其他细胞系存在同一工作面不能有其他细胞系存在2.两种细胞系不能共用培养器具两种细胞系不能共用培养器具 细胞工程细胞工程3.3.1.6 细胞组织培养污染的防治细胞组织培养污染的防治细胞工程(shi)3.3.2 3.3.2 动物细胞融合动物细胞融合 3.3.2.1 病毒诱导融合 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程细胞工程(shi)双亲本细胞双亲本细胞灭活仙台病毒灭活仙台病毒（疱疹病毒，副黏液病毒）细胞沉淀细胞沉淀细胞凝集细胞凝集各种融合子各种融合子混匀，冰浴混匀，冰浴20min，稍
34、摇，稍摇 37 30 min洗涤洗涤选择培养基选择培养基所需的融合子所需的融合子分别制悬液分别制悬液 混合离心混合离心 细胞工程细胞工程3.3.2.1 病毒诱导融合病毒诱导融合细胞工程(shi)n1974年，高国南发现PEG能诱导植物细胞原生质体融合n1975年，Pontecorvo用PEG法融合动物细胞取得成功o悬浮法PEG400040%50%，处理12min;o离心法PEG100030%40%，离心58min;(可加5%15%二甲亚砜） 细胞工程细胞工程3.3.2 动物细胞融合动物细胞融合3.3.2.2化学诱导融合化学诱导融合细胞工程(shi)杂种细胞筛选杂种细胞筛选n抗药筛选抗药筛选n营
35、养缺陷筛选营养缺陷筛选 细胞工程细胞工程3.3.2.2 化学诱导融合化学诱导融合细胞工程(shi)3.3.3 3.3.3 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程细胞工程(shi)B淋巴细胞淋巴细胞（脾）（脾）浆细胞浆细胞特异抗体特异抗体融和融和小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 2002年年12月神舟月神舟4号飞船搭载号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓瘤细胞升淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验空进行细胞融合实验特异抗体特异抗体产生产生产生产生筛选筛选 细胞工程细胞工程3.3.3 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术淋巴
36、细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术抗原记忆细胞记忆细胞细胞工程(shi)淋巴细胞杂交瘤产淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术生单克隆抗体技术示意图示意图 细胞工程细胞工程3.3.3 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术细胞工程(shi)3.3.4 3.3.4 细胞核移植与动物克隆细胞核移植与动物克隆 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程 将细胞的各部件进行重新将细胞的各部件进行重新组合装配，主要有组合装配，主要有核移植核移植、叶、叶绿体移植、核糖体重建及线粒绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等技术。体装配等技术。细胞工程(shi)细胞核的制备细胞核的制备显微操作法显
37、微操作法细胞松弛细胞松弛素素B处理法处理法细胞培养细胞培养获得获得核质体核质体和和胞质体胞质体离心离心细胞松弛素细胞松弛素B处理处理3.3.4.1细胞核移植细胞核移植 细胞工程细胞工程3.3.4 细胞核移植与动物克隆细胞核移植与动物克隆细胞工程(shi)3.3.4.2体细胞克隆体细胞克隆 细胞工程细胞工程3.3.4 细胞核移植与动物克隆细胞核移植与动物克隆细胞工程(shi)维尔穆特等用羊乳腺细胞克隆了多莉维尔穆特等用羊乳腺细胞克隆了多莉（19961996）取取434个绵羊乳腺细胞的细胞核与同等数量的去核卵个绵羊乳腺细胞的细胞核与同等数量的去核卵电激融合电激融合277个融合细胞（个融合细胞（63
38、.8%）移入母移入母羊输卵管发育，成功羊输卵管发育，成功247个（个（89.2%）发育到桑发育到桑椹胚椹胚29个（个（11.7%）分别植入分别植入13只母羊子宫只母羊子宫仅生一只仅生一只“多莉多莉”（0.23%） 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)“多莉（多莉（Dolly）”的身世的身世1.从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度营从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度营养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞； 2.2. 从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞
39、，并立从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；体细胞； 3.3. 利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、的一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞，进行早期胚胎发育；分化，从而形成胚胎细胞，进行早期胚胎发
40、育； 4. 4. 将早期胚胎转移到苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进将早期胚胎转移到苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi) 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)克隆哺乳动物基本途径克隆哺乳动物基本途径取出体细胞核取出体细胞核未受精卵去核未受精卵去核异核卵异核卵早期胚胎早期胚胎化学或电激诱导融合化学或电激诱导融合产下幼畜产下幼畜假孕状态假孕状态植入代孕母畜子宫中植入代孕母畜子宫中 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克
41、隆体细胞克隆体外发育体外发育细胞工程(shi)自自体体克克隆隆的的小小母母马马Prometea 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi) 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆2 20 00 04 4年年2 2月月1 15 5日日，美美国国爱爱达达荷荷大大学学的的研研究究人人员员在在西西雅雅图图的的美美国国科科学学年年会会上上展展示示三三头头克克隆隆骡骡子子细胞工程(shi)世世界界首首例例成成年年体体细细胞胞克克隆隆水水牛牛2005年年3月月17日日在在广广西西大大学学“863计计划划”良良种种牛牛南南方方繁繁殖殖中中心心诞诞生生 细胞工程细胞工程
42、3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)2005年年4月月24日日韩韩国国科科学学家家培培育育出出首首只只克克隆隆狗狗“史史纳纳皮皮” （ snuppy ） 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)我国第一头体细胞克隆猪诞生我国第一头体细胞克隆猪诞生经中国农业大学李宁教授领导的课经中国农业大学李宁教授领导的课题组一年多的科技攻关，题组一年多的科技攻关，2005年年8月月5日，我国第一头体细胞克隆猪终日，我国第一头体细胞克隆猪终于在河北省三河成功诞生于在河北省三河成功诞生 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)2005年
43、年12月月8日中国科学院动物研究所用山羊克隆的一日中国科学院动物研究所用山羊克隆的一只亚洲黄羊只亚洲黄羊(左左)与普通山羊一起在山东临沂亮相与普通山羊一起在山东临沂亮相 国国际际首首例例体体细细胞胞异异种种克克隆隆亚亚洲洲黄黄羊羊临临沂沂降降生生 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)世界冠军赛马世界冠军赛马“斯卡普斯卡普”被克隆成被克隆成功功世界速度赛马冠军查尔马妮世界速度赛马冠军查尔马妮詹詹姆士姆士2006年年11月月16日对外宣布，日对外宣布，她向德克萨斯州奥斯汀的她向德克萨斯州奥斯汀的ViaGen公司支付了公司支付了15万美元万美元,在四次尝试失败后，最
44、终在今在四次尝试失败后，最终在今年年8月月8日成功克隆了她的赛马日成功克隆了她的赛马夺得过十项世界冠军的夺得过十项世界冠军的“斯卡普斯卡普”，产下小马驹，产下小马驹“克莱克莱顿顿” 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)东北农业大学刘忠华教东北农业大学刘忠华教授带领的课题组，把水母绿授带领的课题组，把水母绿色荧光蛋白基因转移到猪胎色荧光蛋白基因转移到猪胎儿成纤维细胞的基因组中，儿成纤维细胞的基因组中，再把转基因体细胞的细胞核再把转基因体细胞的细胞核移植到成熟的去核猪卵母细移植到成熟的去核猪卵母细胞中构建成转基因胚胎。再胞中构建成转基因胚胎。再将其植入受体母猪，经
45、过将其植入受体母猪，经过114天的发育，天的发育，2006年年12月月22日日成功培育出国内首例绿色荧成功培育出国内首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪光蛋白转基因克隆猪中国首例绿色荧光蛋中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪问世白转基因克隆猪问世 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi)哺乳动物克隆存在的问题哺乳动物克隆存在的问题v流产率高；流产率高；v 难产率高；难产率高；v 畸形率高；畸形率高；v 围产期死亡率高；围产期死亡率高；v 幼年死亡率高；幼年死亡率高； 细胞工程细胞工程3.3.4.2 体细胞克隆体细胞克隆细胞工程(shi) 3.3.5 3.3.5 染色体转移染色
46、体转移 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程n微细胞（微核体）介导微细胞（微核体）介导 微细胞微细胞(minicell)(minicell)：只含有一至几条染色：只含有一至几条染色体、少量细胞质和完整质膜的核质体。体、少量细胞质和完整质膜的核质体。 优点：优点：1.1.简化供体简化供体2.2.受体细胞受影响小受体细胞受影响小3.3.染色体很少损坏或不损坏染色体很少损坏或不损坏细胞工程(shi)微细胞制备微细胞制备秋水仙素，秋水仙素，816h细胞松弛素细胞松弛素B，46h供体细胞培养供体细胞培养中期细胞中期细胞大小细胞悬液大小细胞悬液12000g，10min细胞松弛素细胞松弛素B，0
47、.51h39000g,20min含微细胞上清液含微细胞上清液微细胞微细胞无血清培养基悬浮无血清培养基悬浮滤膜过滤滤膜过滤微细胞微细胞微细胞沉淀微细胞沉淀线性梯度线性梯度BSA悬浮悬浮分别离心分别离心微细胞微细胞 细胞工程细胞工程3.3.5 染色体转移染色体转移细胞工程(shi)微细胞与受体细胞融合微细胞与受体细胞融合微细胞（百万个）微细胞（百万个）含植物凝集素含植物凝集素P的无血清培养基的无血清培养基受体细胞受体细胞吸去植物凝集素吸去植物凝集素P加加PEG1540（30%50%）吸去吸去PEG液液无血清培养基洗涤无血清培养基洗涤3次次加完全培养基，胰酶消化加完全培养基，胰酶消化收获离散细胞收获
48、离散细胞分装培养瓶分装培养瓶选择培养基筛选选择培养基筛选 细胞工程细胞工程3.3.5 染色体转移染色体转移悬浮液悬浮液细胞凝集细胞凝集371015min1min1624h，37细胞工程(shi) 细胞工程细胞工程3.3 动物细胞工程动物细胞工程3.3.6 人类干细胞研究人类干细胞研究细胞工程(shi)3.3.6.1 干细胞（干细胞（stem cell）简介）简介n干细胞是动物（包括人）胚胎及器官中干细胞是动物（包括人）胚胎及器官中具有具有自我复制自我复制和和多向分化潜能多向分化潜能的原始细的原始细胞，能分裂、产生出表现型和基因型都胞，能分裂、产生出表现型和基因型都和自己完全相同的子细胞，同时还
49、能分和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为各类化为各类祖细胞祖细胞，是重建、修复病损或，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。衰老组织、器官功能的理想种子细胞。 细胞工程细胞工程3.3.6 人类干细胞研究人类干细胞研究细胞工程(shi)干细胞的特征干细胞的特征n具有无限增殖分裂的能力具有无限增殖分裂的能力n长期保持自我稳定的能力长期保持自我稳定的能力n长期保持分化成其他细胞的可能性长期保持分化成其他细胞的可能性 n产生新细胞是对组织（细胞）损伤的反应产生新细胞是对组织（细胞）损伤的反应n以以对对称称和和（或或）不不对对称称两两种种方方式式进进行行生生长长：或或保保持持不不分分化化
50、状状态态，或或不不可可逆逆地地向向终终末末分分化化 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)干细胞的应用干细胞的应用n干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有生命干细胞生物学研究与应用几乎涉及所有生命科学和生物医药学领域。科学和生物医药学领域。n除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗除了在细胞治疗、组织器官移植、基因治疗具重要意义外，还将在新基因发现与基因功具重要意义外，还将在新基因发现与基因功能分析、发育生物学研究、新药开发与药效能分析、发育生物学研究、新药开发与药效以及毒性评估等领域产生极其重要的影响。以及毒性评估等领域产生极其重要的影响。 细胞工程细胞工程3.3.
51、6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)1999年干细胞研究被世界著名年干细胞研究被世界著名杂志杂志Science评为十大科技进展之评为十大科技进展之首；首；2000年再度入选世界十大科年再度入选世界十大科技进展技进展 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)中国支持治疗性克隆研究中国支持治疗性克隆研究n中中国国科科学学院院副副院院长长陈陈竺竺院院士士2002年年7月月指指出出：“一一个个体体外外的的胚胚胎胎在在有有限限的的时时间间，如如14天天里里，尚尚属属一一般般的的生生物物细细胞胞，此此时时还还没没有有神神经经细细胞胞和和脑脑细细胞胞的的产产生生，既既
52、无无知知觉觉也也无无感感觉觉，因因此此科科学学界界一一般般认认为为它它在在此此时时还还不不是是一一个个道道德德意意义义上上的的人人。人人类类干干细细胞胞研研究究给给21世世纪纪医医学学的的革革命命性性发发展展带带来来可可能能，因此总的平衡利弊，还是要支持因此总的平衡利弊，还是要支持”。n陈陈竺竺副副院院长长还还强强调调，在在支支持持的的同同时时还还要要有有严严厉厉的的法法律律、法法规来保证这样的技术发展能真正造福人类。规来保证这样的技术发展能真正造福人类。 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)国家干细胞基地通过验收国家干细胞基地通过验收n天津国家干细胞工程产品
53、产业化基地建筑面积天津国家干细胞工程产品产业化基地建筑面积1.9万万m2，建，建设总投资设总投资1.18亿元，亿元，2004年初建成。年初建成。n天津脐带血造血干细胞库是目前世界规模最大的干细胞库天津脐带血造血干细胞库是目前世界规模最大的干细胞库之一，日处理脐带血能力之一，日处理脐带血能力100份，可储存量达份，可储存量达30万份。万份。n天津脐带血库还在国内首创了自体血储存，并创建公共储天津脐带血库还在国内首创了自体血储存，并创建公共储存与自体储存相结合模式，已在全国存与自体储存相结合模式，已在全国19个省市建立个省市建立70多家多家分公司和工作站，储存新生儿脐带血干细胞分公司和工作站，储存
54、新生儿脐带血干细胞3万余份，为数万余份，为数十位患者提供了移植供体。十位患者提供了移植供体。 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)干细胞分类干细胞分类o全能性干细胞（全能性干细胞（totipotenttotipotent stem stem cellcell）o多能性干细胞多能性干细胞(pluripotent(pluripotent stem stem cell)cell)o单能性干细胞单能性干细胞(unipotent(unipotent stem stem cell)cell) 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)干细胞分干
55、细胞分类示意图类示意图全能干细胞全能干细胞多能干细胞多能干细胞 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)干细胞研究干细胞研究“三步曲三步曲”n获得干细胞系获得干细胞系 ; ;n建立干细胞诱导分化模型建立干细胞诱导分化模型 ; ;n将上述干细胞或干细胞培育体系植将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。察其效果。 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)获得干细胞系获得干细胞系 这是本研究最重要的第一步。这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器可以从动物或人的早期
56、胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传稳定传25代以上）；代以上）； 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)干细胞培养干细胞培养n饲养层细胞饲养层细胞提供附植环境提供附植环境饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑制饲养层细胞分泌物对维持干细胞的生长、抑制分化起重要作用；分化起重要作用；人类胚胎干细胞（人类胚胎干细胞（ESC）可用小鼠纤维母细胞）可用小鼠纤维母细胞作饲养层，但效果不十分理想；可用人输卵管作饲养层，但效果不十分理想；可用人输卵管上皮细胞作饲养层。上皮细胞
57、作饲养层。n培养液培养液 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)建立干细胞诱导分化模型建立干细胞诱导分化模型n可利用基因工程手段引入外源目可利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置的基因（对原有致病基因进行置换改造）换改造）n探索诱导干细胞向特定组织、器探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学和（或）物理条件官分化的化学和（或）物理条件 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)效果考察效果考察n将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织中，考察其效果。或组
58、织中，考察其效果。n20062006年年1212月月2727日旅美学者张曙光等报道，发明了一种由蛋日旅美学者张曙光等报道，发明了一种由蛋白质纳米纤维组成的三维支架结构，其中每个蛋白质纤维白质纳米纤维组成的三维支架结构，其中每个蛋白质纤维是人的头发丝的是人的头发丝的1/5 0001/5 000，支架结构中包含的孔洞是针眼，支架结构中包含的孔洞是针眼的的1/20 0001/20 000。 n干细胞能够在这种干细胞能够在这种“脚手架脚手架”上生长、繁殖并分化成脑细上生长、繁殖并分化成脑细胞。这种胞。这种“脚手架脚手架”比现有的任何细胞培养系更接近生物比现有的任何细胞培养系更接近生物活体本身。活体本身
59、。 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)干细胞治疗的优点干细胞治疗的优点n低低毒毒性性（或或无无毒毒性性），一一次次治治疗疗有效；有效；n不不需需要要完完全全了了解解疾疾病病发发病病的的确确切切机理；机理；n用自身干细胞移植，可避免产生用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。免疫排斥反应。 细胞工程细胞工程3.3.6.1 干细胞简介干细胞简介细胞工程(shi)n胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）是从哺乳动物囊胚内细胞团（）是从哺乳动物囊胚内细胞团（innercellmass）和原生殖细胞（）和原生殖细胞（primodialge
60、rmcell，PGC）分离并克隆培养出来的）分离并克隆培养出来的原始、未分化细胞，具有自我复制、更新原始、未分化细胞，具有自我复制、更新和发育全能性并能产生后代的和发育全能性并能产生后代的早期胚胎细早期胚胎细胞。胞。3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞 细胞工程细胞工程3.3.6 人类干细胞研究人类干细胞研究细胞工程(shi)胚泡中的胚胎干细胞胚泡中的胚胎干细胞n受精后受精后57天，胚胎由大约天，胚胎由大约140个细胞组成，个细胞组成，呈空心圆球状，即呈空心圆球状，即胚泡。胚泡。n胚泡中央的腔称胚泡中央的腔称囊胚腔。囊胚腔。n胚泡囊胚腔一侧的细胞群即为胚泡囊胚腔一侧的细胞群即为胚胎干细胞。胚胎
61、干细胞。n胚胎干细胞可能发育成完整的个体，或演变胚胎干细胞可能发育成完整的个体，或演变成构成人体任何器官、组织的细胞。成构成人体任何器官、组织的细胞。 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)桑椹胚桑椹胚( (囊胚囊胚) ) 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)人早期胚胎人早期胚胎囊胚囊胚 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)胚胎干细胞的特征胚胎干细胞的特征饲养层依赖的饲养层依赖的有抑制因子存在时呈未有抑制因子存在时呈未 分化状态分化状态无抑制因子存在时可被无抑制因子存在时可被 诱导成各种细胞诱导
62、成各种细胞悬浮培养时可形成拟胚悬浮培养时可形成拟胚 体，并有序分化体，并有序分化 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)胚胎干细胞的培养胚胎干细胞的培养n将胚胎干细胞置于滋养层上；将胚胎干细胞置于滋养层上；n放入放入COCO2 2（5%5%）培养箱中，）培养箱中，373739,39,饱和饱和湿度；湿度；n培养液：培养液：DMEM + 15%DMEM + 15%胎牛血清胎牛血清+LIF+EGF+LIF+EGF（表皮生长因子）（表皮生长因子）+IGF+IGF（胰岛素样生长因（胰岛素样生长因子）子）+ +胰岛素胰岛素+-+-巯基乙醇。巯基乙醇。 细胞工程细胞工程3.3
63、.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞n2002年年2月日本京都大学再生医学科学研究月日本京都大学再生医学科学研究所用所用鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞，并将它，并将它们转移到们转移到3只患糖尿病的实验鼠体内，一周后只患糖尿病的实验鼠体内，一周后实验鼠的血糖值都正常。实验鼠的血糖值都正常。 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)胚胎干细胞生成牛微型肾胚胎干细胞生成牛微型肾n2002年2月美国马萨诸塞州的先进细胞技术公司从母牛耳朵取皮肤细胞的细胞核，与去核卵电激融合，形成早期胚胎。
64、取出其中的胚胎干细胞，放在肾形可降解“支架”上生长，获得外形和功能都似牛肾的微型器官牛肾的微型器官，可泌尿，存活数月，不被排斥。 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)中国建立人胚胎干细胞中国建立人胚胎干细胞n2002年10月广州中山大学附属第二医院黄绍良教授等在国内首次建立三个中国人胚胎干细胞系CHE1、CHE2和CHE3，并采用分阶段方法成功诱导小鼠胚胎干细胞发育成造血干细胞。 细胞工程细胞工程3.3.6.2 胚胎干细胞胚胎干细胞细胞工程(shi)3.3.6.3造血干细胞造血干细胞两个特征两个特征高度的自我更新或自我复制能力高度的自我更新或自我复制能力;可分
65、化为各类血细胞可分化为各类血细胞(不对称分裂不对称分裂)。n造血干细胞仅占骨髓有核细胞的造血干细胞仅占骨髓有核细胞的0.5% 细胞工程细胞工程3.3.6 人类干细胞研究人类干细胞研究细胞工程(shi)三类造血干细胞三类造血干细胞n脐血干细胞（约占脐血组织的脐血干细胞（约占脐血组织的0.4%）n骨髓造血干细胞（约占骨髓造血组织的骨髓造血干细胞（约占骨髓造血组织的0.1%）n外周血干细胞（约占外周血单核细胞的外周血干细胞（约占外周血单核细胞的0.1%0.01%）它们各自的优缺点？它们各自的优缺点？ 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)造血干细胞的分化造血干细胞的分
66、化 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)造血干细胞表面标志物造血干细胞表面标志物nCD34CD34分子是目前应用最广泛的造血干细胞的表面阳分子是目前应用最广泛的造血干细胞的表面阳性标志；性标志；nCD34CD34分子是一种跨膜黏蛋白，在造血干细胞、造血分子是一种跨膜黏蛋白，在造血干细胞、造血祖细胞、小血管内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表面祖细胞、小血管内皮细胞以及胚胎成纤维细胞表面表达；表达；nCD34CD34+ +细胞不全是造血干细胞，但造血干细胞表面都细胞不全是造血干细胞，但造血干细胞表面都具有具有CD34CD34分子；分子；nLinLin- -CD34CD3
67、4- -细胞中有些是比细胞中有些是比CD34CD34+ +造血干细胞更原始造血干细胞更原始的前体细胞。的前体细胞。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)骨髓库骨髓库n建立骨髓库是造血干细胞移植的必然需要；建立骨髓库是造血干细胞移植的必然需要；n美国骨髓供者库是世界最大的骨髓库，已有注册志愿者美国骨髓供者库是世界最大的骨髓库，已有注册志愿者500500多万人；多万人；n欧洲，约欧洲，约300300万份；万份；n日本，日本，1818万份；万份；n台湾骨髓捐赠中心已有志愿者台湾骨髓捐赠中心已有志愿者2424万人。已经为约万人。已经为约200200人（其人（其中内地近
68、中内地近100100人）提供了骨髓；人）提供了骨髓；n中国内地，到中国内地，到20062006年年3 3月，中华骨髓库入库月，中华骨髓库入库HLAHLA分型资料为分型资料为3636万份万份，为患者检索配型，为患者检索配型1 1万多人次，仅可以使万多人次，仅可以使50%50%患者初配成患者初配成功；功；n我国有大约我国有大约400400万名白血病患者等待骨髓移植；万名白血病患者等待骨髓移植； 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)造血干细胞培育出人体肾脏组织造血干细胞培育出人体肾脏组织n2006年年12月，日本东京慈惠会医科大学和自治医科大学的研究月，日本东京慈惠
69、会医科大学和自治医科大学的研究人员从人体骨髓液中提取干细胞，将其植入人员从人体骨髓液中提取干细胞，将其植入11天半大的大白鼠天半大的大白鼠胚胎内可能长出肾脏的部位。胚胎内可能长出肾脏的部位。n两天后，人体干细胞就分化为承担肾脏主要功能的丝球体和尿两天后，人体干细胞就分化为承担肾脏主要功能的丝球体和尿细管。将它们移植到其他大白鼠腹腔中的大网膜内，结果新的细管。将它们移植到其他大白鼠腹腔中的大网膜内，结果新的血管开始朝着丝球体的方向延伸。植入的组织最终发育成只有血管开始朝着丝球体的方向延伸。植入的组织最终发育成只有普通大白鼠肾脏普通大白鼠肾脏1/10大小的人体肾脏组织。大小的人体肾脏组织。n这项技
70、术成熟后，可将肾功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等这项技术成熟后，可将肾功能衰竭患者的骨髓干细胞植入猪等动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植回患者体内。动物的胚胎内，在干细胞分化成肾脏组织后再植回患者体内。等大网膜内的血管延伸到移植组织后，这些组织就能过滤尿液。等大网膜内的血管延伸到移植组织后，这些组织就能过滤尿液。这样，患者既不需要人工透析，也不必等待肾脏捐献者。这样，患者既不需要人工透析，也不必等待肾脏捐献者。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)造血干细胞移植供者来源难题破解造血干细胞移植供者来源难题破解n2007年1月8日，北京大学人民医院报道：他
71、们已建立了“HLA不合造血干细胞移植技术体系”，使六个位点中部分不合者也获得治疗机会。标志我国在这一领域的创新性研究居于世界领先水平。 n他们已使3/6相合的亲属间骨髓移植成为常规。由于3/6相合亲属可来源于父母、同胞、堂兄妹、表亲之一，因此，几乎能为100的人群找到供者，这从根本上解决了供者来源问题。 n迄今采用该配型不合技术体系，完成HLA不合移植300多例，总体生存率达到6070。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)外周血干细胞移植外周血干细胞移植v优点优点：无需麻醉，采集方便，可重采；重建造血无需麻醉，采集方便，可重采；重建造血功能快，免疫功能恢复早
72、；感染等并发症轻；混入功能快，免疫功能恢复早；感染等并发症轻；混入肿瘤细胞的机会较少。肿瘤细胞的机会较少。v缺点：缺点：细胞少，仅占外周血有核细胞的细胞少，仅占外周血有核细胞的0.01%0.01%0.10.1% %，相当于骨髓干细胞的，相当于骨髓干细胞的1% 10%1% 10%；操作较复杂；操作较复杂；要有一定条件和设备；费用比骨髓干细胞移植高。要有一定条件和设备；费用比骨髓干细胞移植高。v外周血外周血CD34+细胞是造血干细胞的重要来源。细胞是造血干细胞的重要来源。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病外周血干细胞移植治疗下
73、肢缺血性疾病n2005年年8月国家干细胞工程技术研究中心主任韩月国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝教授报道，在国际上率先开展外周血干细胞忠朝教授报道，在国际上率先开展外周血干细胞移植治疗下肢缺血性疾病的研究，建立了一个安移植治疗下肢缺血性疾病的研究，建立了一个安全有效、简单经济的新方法。全有效、简单经济的新方法。n已治疗的已治疗的4545例患者（例患者（1212例动脉闭塞症，例动脉闭塞症，2828例糖尿例糖尿病足，病足，5 5例血栓闭塞性脉管炎）全部取得显著疗效，例血栓闭塞性脉管炎）全部取得显著疗效，使患者避免截肢的痛苦。使患者避免截肢的痛苦。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血
74、干细胞细胞工程(shi)脐血干细胞脐血干细胞l脐带血的优点：脐带血的优点：vv含丰富的造血干细胞和（或）祖细胞（约含丰富的造血干细胞和（或）祖细胞（约含丰富的造血干细胞和（或）祖细胞（约含丰富的造血干细胞和（或）祖细胞（约1%1%，与，与，与，与骨髓相同，为外周血的骨髓相同，为外周血的骨髓相同，为外周血的骨髓相同，为外周血的12121616倍）；倍）；倍）；倍）；vv免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟免疫原（抗原）性较弱（主要含不成熟T T细胞）；细胞）；细胞）；细胞）；vv增殖快，集落形成率高；增殖快，集落形成率高；增殖快，
75、集落形成率高；增殖快，集落形成率高；vv所需细胞数少；所需细胞数少；所需细胞数少；所需细胞数少；vv来源广泛。来源广泛。来源广泛。来源广泛。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)脐血干细胞是更原始的干细胞脐血干细胞是更原始的干细胞n脐血造血干细胞中的脐血造血干细胞中的CD34CD34+ +CD38CD38- -细胞的百分比细胞的百分比明显高于外周血和骨髓，提示明显高于外周血和骨髓，提示脐血造血干细胞脐血造血干细胞中含有较多更为原始的造血干细胞。中含有较多更为原始的造血干细胞。n脐带血造血干细胞移植时双方的白细胞组织相脐带血造血干细胞移植时双方的白细胞组织相容性
76、抗原无须完全相合，容性抗原无须完全相合，同胞间有同胞间有7575的机会的机会适合移植，非亲属间适合移植的机会相对较多，适合移植，非亲属间适合移植的机会相对较多，并且手术后也较少发生排异反应。并且手术后也较少发生排异反应。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)用脐带血细胞培育出肝细胞用脐带血细胞培育出肝细胞n20032003年年3 3月东京医科齿科大学教授寺冈弘文领导的研究小月东京医科齿科大学教授寺冈弘文领导的研究小组，从婴儿的脐带血中提取细胞，加入对肝细胞的生成组，从婴儿的脐带血中提取细胞，加入对肝细胞的生成有促进作用的一些物质，经过一段时间的培养，这些细有促
77、进作用的一些物质，经过一段时间的培养，这些细胞胞生成了肝细胞生成了肝细胞，并且开始分泌只有肝脏才能合成的白，并且开始分泌只有肝脏才能合成的白蛋白。蛋白。 n目前治疗严重肝病只能依靠肝脏移植，但肝脏的来源得目前治疗严重肝病只能依靠肝脏移植，但肝脏的来源得不到保证；用人体胚胎干细胞生成肝细胞正在研究之中，不到保证；用人体胚胎干细胞生成肝细胞正在研究之中，但存在伦理方面的争议。如果用脐带血细胞培育出大量但存在伦理方面的争议。如果用脐带血细胞培育出大量肝细胞，并将它们注入患者的肝脏，有可能开辟治愈肝肝细胞，并将它们注入患者的肝脏，有可能开辟治愈肝病的新途径。病的新途径。 细胞工程细胞工程3.3.6.3
78、 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)脐带血干细胞修复脊髓脐带血干细胞修复脊髓n20042004年年1212月，一名瘫痪长达月，一名瘫痪长达2020年的韩国女年的韩国女子黄美顺，在韩国科学家用脐带血修复她子黄美顺，在韩国科学家用脐带血修复她受损的脊髓后，又重新获得站立和蹒跚行受损的脊髓后，又重新获得站立和蹒跚行走的能力。走的能力。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)脐血库脐血库n美国纽约脐血库是世界最大的脐血库，1993年建成。1998年存有8 700份，2005年约存有80 000份脐血。已为世界600多例患者进行了脐血移植；n西欧、加拿大、日本和韩国等
79、相继建立国家脐血库；n北京、天津、上海、济南、杭州、成都和广州分别建立了脐血库，已有脐血15 000多份；n2005年世界约有5 000个脐血库。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)脐血库建造脐血库建造“生命银行生命银行” 脐血库被称做“生命的银行”，至2005年7月北京脐血库已经存储1万多例脐血。 细胞工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)脐带血储备脐带血储备取血取血50mL50mL婴儿出生婴儿出生脐带结扎脐带结扎造血干细造血干细胞分离胞分离添加冷冻添加冷冻保护剂保护剂 冷冻至冷冻至-80 保存在保存在-196液氮中液氮中 细胞
80、工程细胞工程3.3.6.3 造血干细胞造血干细胞细胞工程(shi)干细胞培育出胸腺干细胞培育出胸腺n2002年6月澳大利亚的莫纳什大学研究人员在世界上首次利用人干细胞培育出完整的功能齐全的胸腺。 细胞工程细胞工程3.3.6 人类干细胞研究人类干细胞研究3.3.6.4其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi) 干细胞长成牙冠干细胞长成牙冠 n2002年9月美国波士顿弗西斯研究中心从小猪体内提取牙齿干细胞，用酶催化后，放入可降解牙模中，再植入小鼠腹部。30周内，这些细胞长成包含珐琅质和牙质的牙冠。长成包含珐琅质和牙质的牙冠。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程
81、(shi)神经干细胞治脑瘫神经干细胞治脑瘫n2005年年6月月6日海军总医院宣布为一名刚出生日海军总医院宣布为一名刚出生70多天多天的脑瘫患儿娜娜进行神经移植手术取得了成功。的脑瘫患儿娜娜进行神经移植手术取得了成功。n医生先从流产胎儿大脑中取出脑组织进行细胞培养和医生先从流产胎儿大脑中取出脑组织进行细胞培养和扩增扩增，然后在娜娜头颅上穿刺，在，然后在娜娜头颅上穿刺，在B超的引导下，用超的引导下，用探针将健康的神经干细胞种进娜娜受损的大脑。探针将健康的神经干细胞种进娜娜受损的大脑。17天天后，娜娜会笑了，眼神灵活了，可以玩拨浪鼓，还能后，娜娜会笑了，眼神灵活了，可以玩拨浪鼓，还能认出妈妈，智力发
82、育已经追上了同龄婴儿。认出妈妈，智力发育已经追上了同龄婴儿。n这种治疗小儿脑瘫的方法尚属世界首例。这种治疗小儿脑瘫的方法尚属世界首例。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)干细胞形成脑组织干细胞形成脑组织n2002年10月韩国与美国的科学家把干细胞置于可被吸收的生化塑料小架子上，再放到受中风严重破坏的老鼠脑部。一个月之内，干细胞形成了新的脑部组织，还刺激原有的脑细胞生长。受损的部位已经大部分恢复。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)单个干细胞使小鼠生成乳腺单个干细胞使小鼠生成乳腺n20062006年1 1月澳
83、大利亚墨尔本的沃尔特-伊丽莎白霍尔研究所的科学家发现乳腺组织中有一种细胞具有干细胞的特性， 只要有一个这样的细胞， 科学家就可能在实验室 中培养出一个具备完全 功能的乳腺。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)干细胞治尿失禁干细胞治尿失禁n20042004年年1010月，奥地利因斯布鲁克医科大学科学月，奥地利因斯布鲁克医科大学科学家报告说，他们从家报告说，他们从2020名患有尿失禁症女性的手名患有尿失禁症女性的手臂取干细胞，培养臂取干细胞，培养6 6周后，借助超声波三维显示，周后，借助超声波三维显示，将干细胞注入她们的尿道和括约肌。将干细胞注入她们的尿
84、道和括约肌。n术后术后24h24h内，多数患者表示，尿漏症停止，尿道内，多数患者表示，尿漏症停止，尿道和括约肌力量和功能得到恢复。一年之后，其和括约肌力量和功能得到恢复。一年之后，其中中1818名患者都能自控小便。名患者都能自控小便。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)干细胞首次培育出内脏细胞干细胞首次培育出内脏细胞n美国科学家美国科学家20052005年年1010月宣布找到一种在实验室培育内脏月宣布找到一种在实验室培育内脏器官细胞的方法。几乎囊括了胰腺、肝脏与肺在内的所器官细胞的方法。几乎囊括了胰腺、肝脏与肺在内的所有内脏器官细胞。这一科研成果，对
85、于疾病治疗、研究有内脏器官细胞。这一科研成果，对于疾病治疗、研究生命演变等都具有极其重大的意义。生命演变等都具有极其重大的意义。n关键在于，科学家成功地将胚胎干细胞转变为一种关键在于，科学家成功地将胚胎干细胞转变为一种内脏内脏原始细胞原始细胞。这种原始细胞可以适应并转化为各种内脏器。这种原始细胞可以适应并转化为各种内脏器官细胞，也意味着人类利用干细胞组合成人体器官的时官细胞，也意味着人类利用干细胞组合成人体器官的时代已为时不远。代已为时不远。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)首次成功移植人造再生膀胱首次成功移植人造再生膀胱n新科学家杂志新科学家杂志
86、20062006年年4 4月月4 4日报道，美国科学家研制成人造日报道，美国科学家研制成人造膀胱移植到病人的体内，临床试验获得了成功。膀胱移植到病人的体内，临床试验获得了成功。n首先，科学家从每个患者的膀胱中提取半张普通邮票大小的活首先，科学家从每个患者的膀胱中提取半张普通邮票大小的活细胞样本，剥下胶原质，将肌肉细胞和膀胱上皮细胞分别置于细胞样本，剥下胶原质，将肌肉细胞和膀胱上皮细胞分别置于不同的培养器皿中培育。利用这种方法培育的细胞可以在两个不同的培养器皿中培育。利用这种方法培育的细胞可以在两个月内迅速增长。月内迅速增长。n经过经过7 7到到8 8个星期，原先的数万个细胞已经繁殖到个星期，原
87、先的数万个细胞已经繁殖到1515亿个左右。亿个左右。接下来，科学家通过精细的手术，将这种新膀胱移植入患者体接下来，科学家通过精细的手术，将这种新膀胱移植入患者体内。这样，新器官会继续生长，并与老器官内。这样，新器官会继续生长，并与老器官“重组重组”，取代老，取代老器官中丧失功能的部分。先后在器官中丧失功能的部分。先后在7 7名患者身上取得成功。名患者身上取得成功。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)干细胞培育出心脏瓣膜干细胞培育出心脏瓣膜n在2006年11月15日的美国心脏学会科学年会上,瑞士苏黎世大学的西蒙赫斯特鲁普博士等研究者报告,他们首次利用胎
88、儿羊水中提取的干细胞培育出人类心脏瓣膜。这为将来修复有缺陷的心脏提供了一种革命性的方法,也避免了可能的伦理学争议。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)羊水干细胞培育出人体组织羊水干细胞培育出人体组织n美国科学家2007年1月7日宣布，在子宫的羊水中发现了丰富的干细胞来源，并利用这些干细胞培育出多种人体组织。这项成果不仅避免了关于胚胎干细胞的伦理争论，而且为今后的医学治疗开辟了新途径。为器官移植提供了更大可能性。n这项研究由美国维克森林大学和哈佛大学的科学家共同进行，研究成果发表在自然-遗传学上。研究发现，从羊水中提取的干细胞含有大量与胚胎干细胞相同的
89、成分，可以培育成各种人体组织，如大脑、肝脏和骨骼可以培育成各种人体组织，如大脑、肝脏和骨骼等。 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)干细胞器官工程的难点干细胞器官工程的难点w地球重力限制了细胞的三维生长；地球重力限制了细胞的三维生长；w离体培养难以确保器官形成所需的离体培养难以确保器官形成所需的多种条件；多种条件；w细胞间相互促进或抑制的机理尚未细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究清楚；研究清楚； 细胞工程细胞工程3.3.6.4 其他干细胞研究其他干细胞研究细胞工程(shi)3.4 微生物细胞工程微生物细胞工程 3.4.13.4.1原核细胞的原生质体融合
90、原核细胞的原生质体融合 细胞工程细胞工程3 细胞工程细胞工程细胞工程(shi)溶菌酶的作用溶菌酶的作用n溶菌酶可分解革兰氏阳性菌（溶菌酶可分解革兰氏阳性菌（G G+ +）细胞壁）细胞壁; ;n溶菌酶要分解革兰氏阴性菌（溶菌酶要分解革兰氏阴性菌（G G- -）细胞壁须添）细胞壁须添加加EDTANaEDTANa2 2 ( (乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸););n提高溶菌酶作用效率的因素提高溶菌酶作用效率的因素: :o菌龄菌龄: : 指数生长期指数生长期; ;o预处理预处理: : 酸酸, ,碱碱, ,热热, ,冷冷, ,表面活性剂表面活性剂, ,巯基乙醇巯基乙醇, ,丙酮，三氯乙酸，丙酮，三氯乙酸，ED
91、TANaEDTANa2 2。 细胞工程细胞工程3.4.1 原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合细胞工程(shi)革兰氏阳性菌融合的主要步骤革兰氏阳性菌融合的主要步骤实验菌实验菌30振摇振摇5107CFU/mL离心离心菌沉淀菌沉淀高渗液悬浮高渗液悬浮菌悬液菌悬液加溶菌酶加溶菌酶混合双亲本混合双亲本双亲本溶菌液双亲本溶菌液约约30min双亲本原生质体双亲本原生质体离心离心原生质体沉淀原生质体沉淀加加1/10体积体积 高渗液高渗液加加PEG6000（40）原生质体凝集原生质体凝集约约1min高渗液适量稀释高渗液适量稀释融合细胞融合细胞融合子悬浮液融合子悬浮液筛选筛选传代传代融合子融合子验证验
92、证 细胞工程细胞工程3.4.1 原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合细胞工程(shi)革兰氏阴性菌球状体制备大肠大肠杆菌杆菌培养培养37 摇动摇动菌悬液菌悬液 (OD450=0.9)离心离心菌沉淀菌沉淀10mmol/L Tris(pH8.0) 缓冲液洗缓冲液洗2次次 离心离心菌沉淀菌沉淀加加100mmol/L Tris(pH8.0)缓冲液（包括缓冲液（包括20%蔗糖）蔗糖） 菌悬液菌悬液37摇摇1min加溶菌酶加溶菌酶 (100g /mL)溶菌酶溶菌酶- -大肠大肠杆菌悬浮液杆菌悬浮液37 轻摇轻摇 12min加加0.1mol /L EDTANa2 37 轻摇轻摇 12min球状体球状
93、体 细胞工程细胞工程3.4.1 原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合细胞工程(shi)融合子筛选u营养缺陷重组法营养缺陷重组法产生原养型细胞产生原养型细胞产生新的重组缺陷型细胞产生新的重组缺陷型细胞u抗药标记法抗药标记法产生双抗药重组细胞产生双抗药重组细胞 细胞工程细胞工程3.4.1 原核细胞的原生质体融合原核细胞的原生质体融合细胞工程(shi)降解酵母细胞壁的酶降解酵母细胞壁的酶消解酶（消解酶（zymolase）：）：0.3mg/mL纤维素酶（纤维素酶（cellulase）蜗牛酶蜗牛酶几丁质酶等几丁质酶等Drislase3.4.2真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合 细胞工程细胞工程
94、3.4 微生物细胞工程微生物细胞工程细胞工程(shi)丝状真菌的脱壁酶丝状真菌的脱壁酶l消解酶（消解酶（zymolase)l新酶（新酶（novozyme)l纤维素酶（纤维素酶（cellulase)l几丁质酶（几丁质酶（chicinase)l解螺旋酶（解螺旋酶（helicase)l-D-葡萄糖苷酸酶（葡萄糖苷酸酶（-D-glucuronidase) 细胞工程细胞工程3.4.2 真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合细胞工程(shi)融合子分析融合子分析n核标记分析核标记分析细胞核染色：融合成一个核或异核体细胞核染色：融合成一个核或异核体DNADNA含量测定含量测定染色体核型分析染色体核型分析营养缺
95、陷型纠正分析营养缺陷型纠正分析 细胞工程细胞工程3.4.2 真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合细胞工程(shi)胞质标记分析胞质标记分析n抗药性检测：由胞质中的质粒决定。抗药性检测：由胞质中的质粒决定。n呼吸缺陷的纠正：呼吸缺陷的纠正：缺线粒体的酵母仍可呼吸，移入线粒缺线粒体的酵母仍可呼吸，移入线粒体可大大提高呼吸效率。体可大大提高呼吸效率。 细胞工程细胞工程3.4.2 真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合细胞工程(shi)生化分析生化分析特定代谢产物的量与质的分析特定代谢产物的量与质的分析蛋白质电泳分析蛋白质电泳分析 细胞工程细胞工程3.4.2 真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合细胞工程
96、(shi)应用非选择标记应用非选择标记菌落形态，生长速度，孢子菌落形态，生长速度，孢子颜色，孢子形态，代谢产物（色颜色，孢子形态，代谢产物（色素、抗生素、同工酶等）；素、抗生素、同工酶等）； 细胞工程细胞工程3.4.2 真菌的原生质体融合真菌的原生质体融合细胞工程(shi)复习思考题复习思考题n如何从一片嫩叶经组织培养培育出众多的完整植株?n如何从植物细胞培养中获得较高的次生代谢物产量?n单倍体植株形单体弱,为什么还有不少科学家热衷于诱发产生单倍体植株?n什么叫植物原生质体?如何进行植物原生质体的融合?n可以采取哪些途径脱去植物体内的病毒？如何检测植株中是否还有病毒？n人工种子包括哪几部分?如
97、何制备人工种子?n怎样才能在体外大量培养哺乳动物细胞？n如何获得能在体外大量生长、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆？n如何用体细胞克隆出一只哺乳动物?克隆动物有什么积极意义?n开展干细胞研究对人类有何积极的意义？n有什么方法可以分别去除革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌的细胞壁？ 细胞工程细胞工程3 细胞工程细胞工程细胞工程(shi)主要参考文献主要参考文献1.李建凡.2002.克隆技术.北京：化学工业出版社2.李志勇.2003.细胞工程.北京：科学出版社3.林加涵，魏文铃.2001.现代生物学实验.北京：高等教育出版社，施普林格出版社4.刘广发.2001.现代生命科学概论.北京：科学出版社5
98、.马晓岚，陈大元.细说克隆牛.科学时报，2002年3月12日6.裴雪涛.2002.干细胞克隆技术.北京：化学工业出版社7.谢从华，柳俊.2004.植物细胞工程.北京：高等教育出版社8.郑国锠.2003.植物细胞融合与细胞工程.兰州：兰州大学出版社9.MullerWA著.1998.发育生物学.黄秀英，劳为德，郑瑞珍等译.北京：高等教育出版社，施普林格出版社10.WilmutIetal.1997.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells.Nature.385(6619):81081311.中国生物技术信息网12.中国干细胞网(刘广发编写) 细胞工程细胞工程3 细胞工程细胞工程细胞工程(shi)
