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1、第六章第六章 植物原生质体培育和体细植物原生质体培育和体细胞杂交胞杂交 知识目的：知识目的：掌握原生质体的分别以及培育过掌握原生质体的分别以及培育过程程了解原生质体培育过程中浸透压了解原生质体培育过程中浸透压和激素的调控原理与技术和激素的调控原理与技术了解体细胞杂交的根本原理了解体细胞杂交的根本原理掌握电交融和掌握电交融和PEG交融的根本方交融的根本方法。法。一、原生质体培育的意义一、原生质体培育的意义1.原生质体概念原生质体概念原生质体原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体亚原生质
2、体(subprotoplast)：在原生质体分：在原生质体分别过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而别过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而构成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。构成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。它可以具有细胞核或没有细胞核。第一节第一节 原生质体的分别和培育原生质体的分别和培育核质体核质体(nuclearplast)(nuclearplast)：由原生质膜和薄：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核构成的小原生质体。层细胞质包围细胞核构成的小原生质体。也称为微小原生质体也称为微小原生质体(miniprotoplast)(miniprotoplast
3、)。胞质体胞质体cytoplastcytoplast：不含细胞核而仅含：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。有部分细胞质的原生质体。2.2.意意义：获得再生植株；得再生植株； 可以可以远缘体体细胞交融，胞交融，实现体体细胞胞杂交。交。二、原生质体分别的大致步骤二、原生质体分别的大致步骤根底资料预备根底资料预备预处置与酶解预处置与酶解原生质体搜集与纯化原生质体搜集与纯化原生质体活力测定原生质体活力测定用于分别原生质体的资料预备用于分别原生质体的资料预备 无菌试管苗叶片，上胚轴和子叶无菌试管苗叶片，上胚轴和子叶培育细胞培育细胞预处置与酶解用黑暗处置，低温处置和不同光质照射等方法，可提高某些资料
4、原生质体的产量和活力不同植物及资料预处置的方法不同酶解酶解所需酶类：纤维素酶半纤维素酶果胶酶所需酶类：纤维素酶半纤维素酶果胶酶 浸透压稳定剂浸透压稳定剂:A.:A.糖溶液系统糖溶液系统;B.;B.盐溶液系统盐溶液系统酶解条件：解条件： A.A.普通在要求黑暗静止；普通在要求黑暗静止；难游离原生游离原生质体体的的资料，那么置于料，那么置于摇床上，低速振床上，低速振荡。 B.B.酶解解时间：不等，普通不超越：不等，普通不超越24h24h。 C.C.酶解温度：解温度：2525。 D.D.参与浸透参与浸透稳定定剂：糖溶液系：糖溶液系统；盐溶液溶液系系统 E.E.酶解解PHPH值：普通在：普通在5.6-
5、5.85.6-5.8。方法一步法：方法一步法：A.A.灭菌的叶片或子叶去掉下表皮，去下表灭菌的叶片或子叶去掉下表皮，去下表皮的一面朝下放入酶液。皮的一面朝下放入酶液。B.B.悬浮细胞培育物用尼龙网筛过滤后再参悬浮细胞培育物用尼龙网筛过滤后再参与酶液中。与酶液中。 原生质体的搜集和纯化 沉降法过滤：筛孔40-100微毫的滤网。 离心：500r/min, 5min。 再离心：先悬浮在洗液后离心，反复三次,培育基清洗调原生质体培育密度漂浮法常用的漂浮剂为蔗糖.梯度离心法培育前进展原生质体活性检测培育前进展原生质体活性检测 三、原生质体的培育三、原生质体的培育一培育基一培育基1浸透压浸透压常常用用的的
6、浸浸透透压压调调理理剂剂：甘甘露露醇醇、山山梨梨醇醇、蔗蔗糖糖和和葡葡萄萄糖糖等等。原原生生质质体体的的浸浸透透压压原原那那么么：培培育育基基浸浸透透压压与与细胞浸透压等渗。细胞浸透压等渗。2无机盐无机盐大大量量元元素素浓浓度度；NO3和和NH4+的的比比例例；Ca2+浓度浓度3 3有机成分有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。物、水解酪蛋白。4 4激素激素常用的激素：常用的激素：NAANAA、IAAIAA、BABA与与2,4-D2,4-D5 5pHpH值值( (二二) )原生质体培育方法原生质体培育方法1液体浅层培育 此法是先把原生质
7、体以一定的密度悬浮在液体培育基中，用吸管将悬浮液移到直径为60cm的平皿中使之构成一个浅层。 优点：培育基与空气接触面大、通气好，原生质体的代谢物易分散，防止了有害物质积累过多而呵斥毒害。此外，转移培育物或添加新颖培育基也方便，并便于察看和照相。缺陷：因原生质体不易集聚而影响培育。 双层培育法固体培育和液体浅层培育相结合的方法。先将含0.7低熔点琼脂糖的固体培育基溶化后凝固于直径为6cm的培育皿内，再参与2ml原生质体与培育液的均匀混合物。开场12d需经常细微摇动，使其均匀、不集聚。该方法既具有较丰富的培育基，又不易枯燥，且细胞分裂后可在固体培育基上生长和繁衍，为较好的培育方法。 平板法培育
8、取1ml原生质体密度为4105/ml悬浮液，与等体积已溶解的含有1.4%低熔点40琼脂糖的培育基均匀混合后，置于直径为6cm培育皿中，此时密度为2105/ml，待凝固后，将培育皿翻转，置于周围垫有保湿资料的直径为9cm培育皿内。用此方法得到的原生质体分布均匀，有利于定点察看，也有利于在部分资料污染时抢救未污染的部分。(三)植板密度 原生质体培育的密度普通是1104/ml至l105/ml。 (四)培育条件光照 新分别出来的原生质体应在散射光或黑暗中培育。 2温度 原生质体的培育温度普通为2530。 (五)原生质体的发育和植株再生 原生质体在适宜的培育条件下，先再生构成新的细胞壁，然后再生细胞进展
9、分裂构成细胞团和愈伤组织，最后经过愈伤组织或胚状体途径获得再生植株。 1细胞壁再生 原生质体培育数小时后开场再生新的细胞壁，一至数天内便可构成完好的细胞壁。 2细胞分裂和生长原生质体普通培育27d后开场第一次分裂 ， 培育一周后再生细胞进展第二次分裂，之后很快进展第三、四次分裂。培育二周后，构成多细胞的细胞团，三周后构成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后构成直径1 mm的小愈伤组织。 3植株再生 原生质体培育构成愈伤组织以后，将其转到分化培育基上诱导器官构成或胚胎发生，使其长成完好植株。 总结原生质体分别与培育四、影响原生四、影响原生质体培育的要素体培育的要素培育基成分：培育基成分：KMP；N6
10、。无机。无机盐：降：降铁、增、增钙、降、降铵利于原生利于原生质体培育。体培育。浸透浸透压稳定定剂：葡萄糖最好。随胞壁再生：葡萄糖最好。随胞壁再生和和细胞胞继续分裂，其分裂，其浓度度须不断降低，有利不断降低，有利生生长。 激素：必需生激素：必需生长素和素和细胞分裂素，留意其胞分裂素，留意其配比。配比。 PH PH值：普通：普通为5.6-5.85.6-5.8原生原生质密度：密度：104-106/ml104-106/ml第二节第二节 体细胞杂交体细胞杂交一、植物体细胞杂交的概念一、植物体细胞杂交的概念 植植物物体体细细胞胞杂杂交交(somatic hybridization)又又称称为为原原生生质质
11、体体交交融融(protoplast fusion)，是是指指将将植植物物不不同同种种、属属，甚甚至至科科间间的的原原生生质质体体经经过过人人工工方方法法诱诱导导交交融融，然然后后进进展展离离体体培培育育，使其再生杂种植株的技术。使其再生杂种植株的技术。 原生质体交融根据其细胞交融时的完好程度可以分为两大类。 (1)对称交融 对称交融(symmetric fusion)是指两个完好的细胞原生质体交融，在交融子中包含有两个交融亲本的全套染色体和全部的细胞质。 对称交融表示图对称交融表示图 (2)非对称交融 非对称交融(asymmetric fusion)是指利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞
12、质失活后再进展交融。 非对称交融表示图非对称交融表示图 二、体细胞杂交二、体细胞杂交(一一)原生质体交融原生质体交融原原生生质质体体交交融融，也也称称体体细细胞胞杂杂交交，就就是是使使分分别别下下来来的的不不同同亲亲本本的的原原生生质质体体，在在人人工工控控制制条条件件下下，像像性性细细胞胞受受精精作作用用那那样样相相互互交交融融成成一体。一体。 (二)原生质体交融的方法及过程 1无机盐诱导交融 利用硝酸钠的作用是中和质膜的负电荷，使原生质体间不再彼此相互排斥，而严密地结合在一同。 2聚乙二醇(PEG)与高pH-高钙相结合的诱导交融 交融的特点：其优点是交融本钱低，勿需特殊设备；交融子产生的异
13、核率较高；交融过程不受物种限制。其缺陷是交融过程繁琐，PEG能够对细胞有毒害。 PEG的作用机理： Kao等以为，由于PEG分子具有细微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等构成H键，从而在在原生质体之间构成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的交融；另外，PEG能添加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、细胞器发生交融成为能够。 交融技术要点：交融液：CaCl2?2H2O 810mmolKH2PO4 0.7mmol甘露醇或山梨醇 0.51.0molpH 5.6诱导液：交融液PEG 2045稀释液：A液g/100mlpH6.0 B液g/100mlpH10.5 交融
14、过程稀释参与稀释液PP交融液混合静止minP P参与PEG交融参与培育基洗涤培育选择电交融法与PEG交融比较起来，电交融有三大优点：一是不存在对细胞的毒害问题；二是交融效率高；三是交融技术操作简便。电交融仪的构造特点：一是交变电场部分；一是高频直流电击部分 电交融的根本过程：1、细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即经过原生质体而不是经过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体严密接触陈列成串；2、膜的击穿：原生质体成串陈列后，立刻给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个严密接触的细胞交融在一同 交融过程：交融过程： 膜交融胞质交融核交融膜交融胞质交融核交融( (五五) )杂种植株的鉴定杂种植株的鉴定形状鉴定形状鉴定分子标志鉴定分子标志鉴定染色体原位杂交染色体原位杂交复习思索题原生质体、亚原生质体、微小原生质体和原生质球的概念。为什么原生质体要培育在等渗培育基中？影响原生质体培育的主要要素。原生质体的培育方法有哪些？各有何优缺陷。如何纯化分别植物原生质体并鉴定其活力。
