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1、液相色谱固定相种类、性质、液相色谱固定相种类、性质、选择原则和适用范围选择原则和适用范围主要内容主要内容基质及其种类基质及其种类1硅胶硅胶2氧化铝氧化铝3聚合物聚合物4化学键合固定相化学键合固定相5Company Logo基质及其种类基质及其种类基质（担体）基质（担体）无机物基质无机物基质 ：刚性大，在溶剂刚性大，在溶剂中不容易膨胀。中不容易膨胀。有硅胶、羟基磷有硅胶、羟基磷灰石、石墨化碳、灰石、石墨化碳、氧化铝、氧化钛氧化铝、氧化钛以及氧化锆等金以及氧化锆等金属氧化物属氧化物1有机聚合物基质有机聚合物基质 ：刚性小、易压缩，刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导入有
2、机基质中，导致填料颗粒膨胀，致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最结果减少传质，最终使柱效降低。主终使柱效降低。主要有交联苯乙烯要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。丙烯酸酯。 1 Xue Z D, He F, Feng Y Q. Wuhan University Journal, 2002, 48( 2): 142Company Logo基质及其种类基质及其种类硅胶硅胶氧化铝氧化铝聚合物聚合物基质的种类基质的种类基质的种类基质的种类Company Logo硅胶硅胶性质：性质： 硅胶是硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。填料中最普遍的基质。硅胶除了具有良好的硅胶除了具有良好的机械强
3、度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定机械强度、容易控制的孔结构和比表面积、较好的化学稳定性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优点外性和热稳定性以及专一的表面化学反应等优点外2 , 还有一还有一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基, 这是硅胶可以进这是硅胶可以进行表面化学键合或改性的基础行表面化学键合或改性的基础3。缺点是在碱性水溶性流动。缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。相中不稳定。2 Kamahara M, N akamura H, Naka jima T. Anal Sc,i 1989,5: 4853 W ang J D, Shang Z
4、H, Yu Y L. Method of H igh Efficient L iquid Chromatog raphy. Be ijing: China Petroleum and Chemistry Press ，1992: 107适用范围：适用范围： 硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。通常，硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析硅胶基质的填料推荐的常规分析pHpH范围为范围为2 28 8。 Company Logo硅胶硅胶1. 高高纯度的多孔球形硅胶基度的多孔球形硅胶基质全多孔球形硅胶的制备步骤全多孔球形硅胶的制备步骤: 反应反应 凝胶凝胶
5、老化老化 洗涤洗涤 浸泡浸泡 干燥干燥 焙烧焙烧 4。制备方法分为四类制备方法分为四类: 堆砌硅珠堆砌硅珠法法 5、两相法、两相法 6、喷雾干燥法、喷雾干燥法7和生物囊法和生物囊法8。 4 Yang X L, W ang J D, Xiong B H. Chinese Journal of chromatography,2000,18( 4): 308 5 Lu Z R. Chemical Reagents ,1995, 17( 5): 279 6 Unger K, Shick K alb J, P at G. G er 2155281, 1971 7 BergnaH E, Kirkland
6、J J. US 4131542, 1978 8 L iX H. PhD D issertation. Beij ing: Institute of Chemistry, CAS ,19949 Lu Z R. Chemical Reagents (陆志仁. 化学试剂), 1995, 17( 5): 279图图1堆砌硅珠法生产硅胶的流程图堆砌硅珠法生产硅胶的流程图9Company Logo硅胶硅胶图图2 硅球电镜图硅球电镜图10 10 蒋生祥，刘霞.硅胶基质高效液相色谱固定相J.Chinese Journal of Chromatography,2007, 25( 2): 164Company L
7、ogo硅胶硅胶2硅胶基质键合正相色谱固定相硅胶基质键合正相色谱固定相3 硅胶基质键合反相色谱固定相硅胶基质键合反相色谱固定相4 硅胶基质手性色谱固定相硅胶基质手性色谱固定相4.1 多糖手性固定相多糖手性固定相 韩小茜等用这种固定相对甲霜灵进行了半制备韩小茜等用这种固定相对甲霜灵进行了半制备11 , 拆分拆分了农药三唑西酮、戊菌唑、己唑醇及烯唑醇对映体了农药三唑西酮、戊菌唑、己唑醇及烯唑醇对映体 12。张红。张红丽等丽等13 和罗兴平等和罗兴平等14在纤维素在纤维素 三三( 3, 5二甲基苯基氨基甲二甲基苯基氨基甲酸酯酸酯) (CDMPC)上分别进行了分析和半制备雷诺嗪的上分别进行了分析和半制备
8、雷诺嗪的HPLC方方法研究法研究. 11 H an X Q, Zhou Z Q, L iu C H, L iY M, Chen L R. Journal of Instrumental Analy sis (韩小茜, 周志强, 柳春辉, 李永民, 陈立仁. 分析测试学报), 2002, 21( 5 ): 40 12 H an X Q, W en X G, Guan YH, Chen L R. Chinese Journal of Applied Chemistry (韩小茜, 温晓光, 管永红, 陈立仁.应用化学), 2004, 21( 2 ): 14013 Zhang H L, L iX Y
9、, Liu C H, Zhao Y F, L iYM, Chen L R.Chinese Journa l of Ana ly tical T esting and Instruments (张红丽, 李晓艳, 柳春晖, 赵艳芳, 李永民, 陈立仁. 分析测试与仪器), 2004, 10( 3 ): 151 14 Luo X P, Zhai Z D, Wu X M, Shi Y P, Chen L R, Li YM.J Sep Sc,i 2006, 29: 164Company Logo硅胶硅胶4.2 大环手性固定相大环手性固定相 Hirose等等 15, 16 制备了含有制备了含有1 苯基苯
10、基 1, 2 乙二醇和乙二醇和1 苯基苯基 1, 2 环己二醇手性单元的苯并环己二醇手性单元的苯并18 冠冠 6 手性固手性固定相定相, 对一些氨基酸和脂肪胺进行了拆分。对一些氨基酸和脂肪胺进行了拆分。Farkas 等等17 合合成了吡啶并成了吡啶并18 冠冠 6手性固定相手性固定相, 拆分了萘乙胺、苯丙氨酸拆分了萘乙胺、苯丙氨酸及丙氨酸和蛋氨酸的衍生物。及丙氨酸和蛋氨酸的衍生物。4.3 刷型手性固定相刷型手性固定相 Pirkle研究小组先后制备了研究小组先后制备了酸型的酸型的(R ) 苯甘氨酸的二硝苯甘氨酸的二硝基苄酰基苄酰(简称简称DNB)衍生物衍生物CSP ( DNBPG CSP )和和
11、(R )亮氨酸亮氨酸的的DNB 衍生物衍生物CSP( DNB Leucine CSP)。这一类型固定相被。这一类型固定相被称为第二代刷型手性固定相称为第二代刷型手性固定相, 它们能拆分很多带有烷基、醚基或它们能拆分很多带有烷基、醚基或氨基取代的给电子芳香环的对映体。氨基取代的给电子芳香环的对映体。 15 HiroseK, N akamura T, N ishioka R, U eshige T, T obea Y.Te trahedron Le tters, 2003, 44( 8 ): 1 549 16 HiroseK, Yongzhu Z, N akamura T, N ishioka R
12、, UeshigeT, T obe Y. J Chromatog rA, 2005, 1 078: 35 17 Viktor F, T unde T, G yorgy O, Pete r H, M ik lo H. T etrahedron: Asymme try, 2006, 17( 12 ): 1 883Company Logo硅胶硅胶5. 硅胶基质键合离子色谱固定相硅胶基质键合离子色谱固定相5.1硅胶基质键合阴离子色谱固定相硅胶基质键合阴离子色谱固定相5.2硅胶基质键合阳离子色谱固定相硅胶基质键合阳离子色谱固定相5.3阴阳离子同时分离的硅胶基质固定相阴阳离子同时分离的硅胶基质固定相5.4
13、离子液体修饰的硅胶基质离子色谱固定相离子液体修饰的硅胶基质离子色谱固定相 把甲基咪唑把甲基咪唑 18键合在经过键合在经过氯丙基三甲氧基硅烷试剂硅氯丙基三甲氧基硅烷试剂硅烷化后的硅胶上制备了一种离子液体键合硅胶固定相烷化后的硅胶上制备了一种离子液体键合硅胶固定相, 键合步键合步骤如图骤如图3 所示。所示。该固定相是一种强阴离子交换该固定相是一种强阴离子交换固定相固定相, 能够很好地对无机、能够很好地对无机、有机阴离子进行分离有机阴离子进行分离, 分离度分离度大大, 柱效高。柱效高。图3.N甲基咪唑键合硅胶色谱固定相的制备 18 18 Q iu H D, Jiang S X, L iu X. J
14、Chroma togrA, 2006, 1 103:265Company Logo5.5硅胶整体柱离子色硅胶整体柱离子色谱谱固定相固定相 Xu等等 19 则将十二烷基硫酸锂则将十二烷基硫酸锂(L iDS)涂敷在涂敷在C18硅胶硅胶整体柱上整体柱上,快速分离了雨水中的快速分离了雨水中的H+ , Mg2+ 和和Ca2 + 。Lucy等等 20采用涂敷有表面活性剂十二烷基二甲基溴化铵采用涂敷有表面活性剂十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)的短的的短的( 0.5 1 cm )硅胶整体柱硅胶整体柱, 用于低压下常见无机阴离子的分离。用于低压下常见无机阴离子的分离。6.硅胶基质无机改性的色谱固定相硅胶基质无机
15、改性的色谱固定相 敦惠娟等敦惠娟等 21, 22 利用利用LbLSA 方法在多孔硅胶微球表面方法在多孔硅胶微球表面组装多层纳米氧化锆颗粒组装多层纳米氧化锆颗粒, 制备了比表面积为制备了比表面积为172.53m2 /g、孔体积为孔体积为0.378 4 cm3 /g、具有良好化学稳定性、具有良好化学稳定性ZrO2/SiO2 核核壳型色谱填料壳型色谱填料, 并对其进行了表征。并对其进行了表征。 19 Xu Q, MoriM, Tanaka K, IkedoM, HuW Z. JChromatog r A, 2004, 1 026: 191 20 Pelletier S, Lucy C A. J Ch
16、romatogr A, 2006, 1 118: 12 21 Dun H J, Song X Q, We iY, Li YM, Chen L R. Chemical Journal of Chinese Universities (敦惠娟, 宋秀芹, 魏雨,李永民, 陈立仁. 高等学校化学学报), 2003, 24 ( 12 ):2 192 22 Dun H J, ZhangW Q, We iY, Song X Q, L iY M, Chen LR. Ana lChem, 2004, 76: 5 016硅胶硅胶Company Logo硅胶硅胶 ZrO2 /SiO2 的制备工艺为的制备工艺为:
17、( 1)将酸化过的色谱用将酸化过的色谱用SiO2 球浸球浸入到十二烷基硫酸钠入到十二烷基硫酸钠( SDS)表表面活性剂溶液中面活性剂溶液中, 待在待在SiO2 球球表面组装一层有机单分子膜后表面组装一层有机单分子膜后取出取出, 洗去表面物理吸附成分洗去表面物理吸附成分, 干燥。干燥。( 2)将已被膜包覆的将已被膜包覆的SiO2 球放入氧化锆溶胶中球放入氧化锆溶胶中, 磁力搅拌磁力搅拌3 h后分离后分离, 用去离子水充分洗用去离子水充分洗涤涤, 干燥。重复进行干燥。重复进行( 1)、(2 )步步骤多次。骤多次。( 3)将制备的将制备的ZrO2 /有有机膜机膜/SiO2 球在一定温度下焙烧球在一定
18、温度下焙烧后得后得ZrO2 /SiO2 核壳型色谱核壳型色谱填料填料, 制备工艺示意图见图制备工艺示意图见图4。图4 表面多层纳米氧化锆包覆硅球的制备步骤 23 23 Dun H J, ZhangW Q, We iY, Song X Q, L iY M, Chen LR. Ana lChem, 2004, 76: 5 016Company Logo性质：性质： 具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。范围。它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不但与硅胶不同的
19、是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键稳定。不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的合相，并显示出优秀的pH稳定性。稳定性。 氧化铝氧化铝Company Logo聚合物聚合物性质：性质： 以高交联度的苯乙烯以高交联度的苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯二乙烯苯或聚甲基丙烯酸酯为基质的填料是用于普通压力下的为基质的填料是用于普通压力下的HPLC，它们的压，它们的压力限度比无机填料低。苯乙烯力限度比无机填料低。苯乙烯-二乙烯苯基质疏水性强。二乙烯苯基质疏水性强。使用任何流动相，在整个使用任何流动相，在整个pH范围内稳定，可以用范围内稳定，可
20、以用NaOH或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质或强碱来清洗色谱柱。甲基丙烯酸酯基质本质上比苯乙烯上比苯乙烯-二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当二乙烯苯疏水性更强，但它可以通过适当的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯的功能基修饰变成亲水性的。这种基质不如苯乙烯-二二乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在乙烯苯那样耐酸碱，但也可以承受在pH13下反复冲洗。下反复冲洗。Company Logo 适用范围：适用范围： 聚合物基质广泛用于分离大分子物质。聚合物基质广泛用于分离大分子物质。聚合物聚合物交联聚苯乙烯交联聚苯乙烯 交联聚苯乙烯微球是应用最为广泛的一种有机基质色谱固交联聚苯乙烯微球是应
21、用最为广泛的一种有机基质色谱固定相具有不溶解于各种有机溶剂在定相具有不溶解于各种有机溶剂在pH 为为114 的溶剂环境中具的溶剂环境中具有很高的化学稳定性及介质表面不存在自由离子等优良特性。有很高的化学稳定性及介质表面不存在自由离子等优良特性。固定相合成：固定相合成： 将将 7.0g 氯甲基化聚苯乙烯树脂用氯甲基化聚苯乙烯树脂用10ml 四氢呋喃溶胀四氢呋喃溶胀1h 然后加入然后加入40ml 乙二胺在乙二胺在70 反应反应24h 反应物冷却后抽滤洗涤反应物冷却后抽滤洗涤干燥得到乙二胺树脂干燥得到乙二胺树脂I ，称取乙二胺树脂，称取乙二胺树脂3.5g, 80ml 含含2%葡萄糖酸内脂的乙醇溶液一
22、起加入反应瓶中葡萄糖酸内脂的乙醇溶液一起加入反应瓶中80下反应下反应24h 抽抽滤并依次用甲醇水洗涤得到排阻色谱固定相滤并依次用甲醇水洗涤得到排阻色谱固定相II。2424卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分离中的应用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448Company Logo聚合物聚合物 该微球表面呈现强的疏水作用作为固定相可直接应用于反相该微球表面呈现强的疏水作用作为固定相可直接应用于反相色谱和以有机溶剂为流动相的排阻色谱中如用于以盐水为流动色谱和以有机溶剂为流动相的排阻色谱中如用于以盐水为流动相的排阻
23、色谱分离就必须对其表面进行化学改性相的排阻色谱分离就必须对其表面进行化学改性.键合相制备过程键合相制备过程24 ：PCH2Cl+H2NCH2CH2NH2PCH2NHCH2CH2NH2+HCl O ( I )( I )+OC(CHOH)3CHOCH2OHPCH2NHCH2CH2NHCO(CH OH)4CH2OH ( II ) P 表示树脂骨架表示树脂骨架24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分离中的应用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448Company Logo聚合物聚合物 图图5 是当流动相从纯水向是当流
24、动相从纯水向纯纯THF 变化时未改性变化时未改性(a )和键合和键合了了 葡萄糖酸内酯的聚氯甲基葡萄糖酸内酯的聚氯甲基苯乙烯色谱柱苯乙烯色谱柱(b) 的柱压降随时的柱压降随时间的变化图。未改性的色谱柱间的变化图。未改性的色谱柱在流动相组成变化过程中柱压在流动相组成变化过程中柱压变化很大说明了填料的溶胀程变化很大说明了填料的溶胀程度较大。由图可知，改性树脂度较大。由图可知，改性树脂在水中的溶胀能力增强。在水中的溶胀能力增强。图5.聚氯甲基苯乙烯色谱柱的柱压降随时间的变化图 24 24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分离中的应用J.
25、离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448Company Logo聚合物聚合物 图图6是是 Lact、 Myo 和和Fer 在在II 树脂固定相上保留时间与流树脂固定相上保留时间与流动相中硫酸钠浓度的关系可以看动相中硫酸钠浓度的关系可以看出三种蛋白质在硫酸钠度为出三种蛋白质在硫酸钠度为00.50mol/L 范围内保留时间几范围内保留时间几乎没有变化这进一步证实了前述乎没有变化这进一步证实了前述的蛋白质与固定相之间静电作用的蛋白质与固定相之间静电作用力和疏水作用均很弱的结论表明力和疏水作用均很弱的结论表明合成的合成的II 型型 SEC 柱接近于理想柱接近于理想的的SEC 柱。柱。
26、图6： Lact、 Myo 和Fer 在II 树脂固定相上保留时间与流动相中硫酸钠浓度的关系24 24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分离中的应用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448Company Logo聚合物聚合物 图图7 是铁蛋白是铁蛋白 乳球蛋白乳球蛋白和细胞色素和细胞色素C 在以在以Tris 缓冲液缓冲液为流动相固定相为为流动相固定相为II 型树脂的型树脂的SEC 分离图，三种蛋白质的分子分离图，三种蛋白质的分子量依次为量依次为440,000 35,000 和和12,000 道尔顿三种蛋白质的
27、洗脱道尔顿三种蛋白质的洗脱次序与分子量大小的次序一致表次序与分子量大小的次序一致表明蛋白在明蛋白在II 型固定相上的分离遵型固定相上的分离遵循排阻色谱分离机理。循排阻色谱分离机理。图7 是铁蛋白 乳球蛋白和细胞色素C 在以Tris 缓冲液为流动相固定相为II 型树脂的SEC 分离图1. Fer； 2. b-Lact; 3. Cyt-C 24 24卫引茂, 陈 强, 姜 波,耿信笃.以氯甲基聚苯乙烯为基质的新型排阻色谱固定相的合成及在生物大分子分离中的应用J.离子交换与吸附, 2000, 16(5): 441 448Company Logo基质的选择基质的选择硅胶基硅胶基质：用于大部分的：用于大
28、部分的HPLC分析，尤其是小分分析，尤其是小分子量的被分析物；子量的被分析物；聚合物：用于大分子量的被分析物聚合物：用于大分子量的被分析物质，主要用来制，主要用来制成分子排阻和离子交成分子排阻和离子交换柱。柱。聚合物聚合物Company Logo化学键合固定相化学键合固定相1.键合相的性质特点：键合相的性质特点： 将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。这类固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变固定相的突出特点是耐溶剂冲洗，并且可以通过改变键合相有机官能团
29、的类型来改变分离的选择性。键合相有机官能团的类型来改变分离的选择性。 2键合相的种合相的种类 键合相合相极性键合相极性键合相 ：氰基氰基(-CN)、氨基、氨基(-NH2)和和二醇基二醇基(DIOL)键合相键合相 。非极性键合相非极性键合相 ：各种烷基：各种烷基(C1C18)和苯和苯基、苯甲基等，以基、苯甲基等，以C18应用最广。应用最广。 Company Logo 极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合极性键合相常用作正相色谱，混合物在极性键合相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的相上的分离主要是基于极性键合基团与溶质分子间的氢键作用，极性强的组分保留值较大。极性键合相有氢键作用，
30、极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。时也可作反相色谱的固定相。 非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保非极性键合相的烷基链长对样品容量、溶质的保留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随留值和分离选择性都有影响，一般来说，样品容量随烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值烷基链长增加而增大，且长链烷基可使溶质的保留值增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合增大，并常常可改善分离的选择性；但短链烷基键合相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称相具有较高的覆盖度，分离极性化合物时可得到对称性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性性较好的色谱峰。苯基键合相与短链烷基键合相的性质相似。质相似。 化学键合固定相化学键合固定相Company Logo3固定相的固定相的选择化学键合固定相化学键合固定相 分离中等极性和极性较强的化合物分离中等极性和极性较强的化合物 分离非极性和极性较弱的化合物分离非极性和极性较弱的化合物 极性键合相极性键合相 非极性键合相非极性键合相 Company Logo
