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1、 第十六章第十六章 RNA的生物合成的生物合成 （转录）（转录） RNA Biosynthesis，transcription定义：定义： 在在RNA聚合酶的催化下，生物体以聚合酶的催化下，生物体以 DNA为模板合成为模板合成RNA的过程。的过程。 转录产物转录产物: mRNA, rRNA, tRNA等等 转录的选择性：转录的选择性： 不对称转录不对称转录(asymmetric transcription)结构基因：能转录出RNA的DNA区段 不对称转录不对称转录在特定的生长发育阶段，转录只在某些在特定的生长发育阶段，转录只在某些DNA 区段进行区段进行DNA双链中仅有一条单链可作为模板指导转
2、双链中仅有一条单链可作为模板指导转 录的进行录的进行 ,且模板链并非总在同一条单链上且模板链并非总在同一条单链上RNA生物合成体系生物合成体系原料原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板模板: DNA 酶酶: RNA聚合酶聚合酶 (RNA polymerase, RNA-pol)其他蛋白质因子其他蛋白质因子第一节第一节 转录的模板和酶转录的模板和酶1.模板模板 (template) 模板链模板链 (template strand) 编码链编码链 (coding strand)2. RNA聚合酶聚合酶 (DNA dependent RNA polymerase, RNA-p
3、ol)a.原核生物的原核生物的RNA聚合酶聚合酶 (以以E.coli为例为例) 2 (核心酶,core enzyme)：2 (全酶全酶,holoenzyme) 亚基：亚基：辨认转录起始点辨认转录起始点 特异抑制剂特异抑制剂: 利福平利福平催化催化NTPNTP按模板的指引合成按模板的指引合成RNARNAb.真核生物的真核生物的RNA聚合酶聚合酶 RNA-pol : 45S-rRNA RNA-pol : hnRNA, lncRNA, piRNA, miRNA RNA-pol : 5S-rRNA,tRNA,snRNA 特异抑制剂特异抑制剂: 鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱真核生物真核生物RNA聚合酶的亚基组成聚合
4、酶的亚基组成 各有各有2个不同的分子个不同的分子量超过量超过100 kD的大的大分子量的亚基分子量的亚基都含有多个小分子都含有多个小分子量的亚基量的亚基 某些小分子量的亚某些小分子量的亚基相同，可同时出基相同，可同时出现在两种或三种酶现在两种或三种酶上上 3. RNA聚合酶辨认结合聚合酶辨认结合DNA模板的启动子模板的启动子 原核生物的转录单位: 操纵子(operon)TTGACATATAATPribnow Box5335RNA-pol辨认位点辨认位点(recognition site) RNA聚合聚合酶保护法酶保护法转录过程转录过程起始起始 (initiation)延长延长 (elongat
5、ion)终止终止 (termination)第二节第二节 原核生物的转录过程原核生物的转录过程转录起始转录起始 (Initiation) 需要解决两个问题需要解决两个问题:RNA聚合酶必须准确的结合在转录模板聚合酶必须准确的结合在转录模板 的启动序列区域的启动序列区域DNA双链解开，其中的一条单链作为转双链解开，其中的一条单链作为转 录模板录模板转录起始过程转录起始过程:形成闭合转录复合体形成闭合转录复合体：全酶靠全酶靠亚基识别结合启动序列亚基识别结合启动序列的的-35区区, 形成闭合的全酶形成闭合的全酶-DNA复合物复合物DNA双链打开双链打开(开放转录复合体开放转录复合体)：全酶随即滑动至
6、全酶随即滑动至-10区，在区，在亚基的作用下，启动序列区域的亚基的作用下，启动序列区域的DNA双链迅双链迅速打开，形成开放转录复合体。速打开，形成开放转录复合体。 转录起始复合物形成转录起始复合物形成：在转录起始点，在转录起始点，RNA聚合酶催聚合酶催化发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物化发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物。 (sigma subunit) allows RNA polymerase to recognize and bind specifically to promoter regions.E. coliE. coli RNA polymerase + RNA pol
7、ymerase + subunit subunit转录起始复合物转录起始复合物5pppGpN-OH3转录延长转录延长a. 转录延长的化学反应转录延长的化学反应RNA聚合酶的反应机制聚合酶的反应机制mRNAmRNAb. 转录空泡转录空泡 (transcription bubble)转录终止转录终止 (termination) （1）依赖）依赖Rho因子的转录终止因子的转录终止 （2）非依赖）非依赖Rho因子的转录终止因子的转录终止（1）依赖）依赖Rho因子的转录终止因子的转录终止a. Rho works by chasing RNA polymerase and knocking it off
8、the templateb. This is an active process that requires the hydrolysis of ATP.依赖依赖Rho因子的转录终止模式：因子的转录终止模式： 1.Rho因子辨认结合新生因子辨认结合新生RNA链上的链上的Rho因子识别位点，因子识别位点，借助水解借助水解ATP获得的能量推动其沿着获得的能量推动其沿着RNA链由链由5-3端移端移动到达动到达RNA聚合酶区域，并使聚合酶区域，并使RNA聚合酶构象发生变化聚合酶构象发生变化而停顿；而停顿； 2.Rho因子利用其解螺旋酶的活性在因子利用其解螺旋酶的活性在ATP供能的情况下，供能的情况下，
9、使使DNA：RNA杂化双链解离，从而使杂化双链解离，从而使RNA链和链和RNA聚合聚合酶从转录复合物上脱落下来，转录过程随即终止。酶从转录复合物上脱落下来，转录过程随即终止。 （2 2）非依赖）非依赖RhoRho因子的转录终止因子的转录终止非依赖非依赖Rho因子的转录终止模式：因子的转录终止模式：1.当当RNA链延长至接近终止区时，该区域附近的转录产链延长至接近终止区时，该区域附近的转录产物形成特殊的茎环结构，阻止物形成特殊的茎环结构，阻止RNA聚合酶继续向前移动，聚合酶继续向前移动，并促进转录复合物的解体；并促进转录复合物的解体；2.茎环结构末端的一段寡聚茎环结构末端的一段寡聚U与与DNA链
10、之间形成的链之间形成的U-A配配对极不稳定，亦有助于对极不稳定，亦有助于RNA链从转录复合物上脱落链从转录复合物上脱落 Termination(6-7)Phases of RNA SynthesisInitiation(1-3)Elongation(4-5) 转录过程转录过程起始起始 (initiation)延长延长 (elongation)终止终止 (termination)第三节第三节 真核生物的生物合成真核生物的生物合成转录延长转录延长RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小体核小体转转录录延延长长中中的的核核小小体体移移位位转录方向转录方向5 -AAUAAA-5 -AAUAAA-
11、核酸酶核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAA GTGTGTG转录终止的修饰点转录终止的修饰点5 5 3 3 3 3 加尾加尾AAAAAAA 3 mRNA 和转录后修饰密切相关和转录后修饰密切相关转录终止 第四节第四节 真核生物真核生物RNA的加工的加工 （Eukaryotic post-transcriptional modification）几种主要的修饰方式几种主要的修饰方式: :1. 剪接剪接(splicing)2. 剪切剪切(cleavage)3. 修饰修饰(modification)4. 添加添加(addition)真核生物真核生物mRNA的转录后加工的转录后加工 1. 5
12、 帽子结构 2. 3 poly (A) 尾巴 3. mRNA剪接 (mRNA splicing) 4. mRNA编辑 (mRNA editing)1. 5 帽子结构(m7GpppG)(G)7-7-甲基鸟苷酸甲基鸟苷酸加帽过程需要加帽酶和加帽过程需要加帽酶和甲基转移酶的参与。甲基转移酶的参与。5 pppGp5 GpppGppppG ppi鸟苷酸鸟苷酸转移酶转移酶5 m7GpppGp甲基转移酶甲基转移酶+CH3帽子结构的生成帽子结构的生成5 ppGp磷酸酶磷酸酶 Pi帽结构的作用帽结构的作用 对对mRNAmRNA的的5 5/ /- -端端起保护作用，避免酶起保护作用，避免酶解解 在蛋白质合成中在蛋
13、白质合成中促进促进mRNAmRNA翻译翻译2. 3 poly (A) 尾巴 poly Apoly A尾不是模板编码，基因中没有相应序列，转录生成尾不是模板编码，基因中没有相应序列，转录生成的的mRNAmRNA在核内以在核内以ATPATP为底物，在为底物，在poly Apoly A聚合酶催化下逐个加上去，聚合酶催化下逐个加上去，形成形成poly Apoly A尾结构。尾结构。 真核细胞内真核细胞内mRNAmRNA的的poly Apoly A可长达可长达100-200100-200个腺苷酸。个腺苷酸。 5/ m7GpppG 3/ AAAAAAAAAAA poly Apoly A尾的作用：尾的作用：
14、 增加增加mRNAmRNA自身的稳定性自身的稳定性 维持维持mRNAmRNA翻译模板的活性翻译模板的活性3 3/ /- -端多聚腺苷酸端多聚腺苷酸(poly A)(poly A)尾的形成尾的形成：3. mRNA 剪接 断裂基因断裂基因(split gene) 真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，这些基因称为断互相间隔开但又连续镶嵌而成，这些基因称为断裂基因。裂基因。 编码区：外显子编码区：外显子 (exon) 非编码区：内含子（非编码区：内含子（intron）a. 剪接信号剪接信号3. mRNA3. mRNA的剪接机制
15、的剪接机制 U1snRNPU1snRNP和和U2snRNPU2snRNP分别结合在内含子的分别结合在内含子的3 3和和5 5末端末端 U4U4、U5U5、U6U6加入，形加入，形成剪接体，内含子弯曲成剪接体，内含子弯曲形成套索状，形成套索状，E1E1、E2E2距距离拉近离拉近 U2U2和和U6U6形成催化中形成催化中心，发生转酯反应，心，发生转酯反应，即磷酸二酯键的转移即磷酸二酯键的转移反应反应 UACUACA - AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA - AGUGU6E1E2U1、U4、U5U2pG-OH(ppG-OH, pppG-OH)-OHGpXpGpG第一次转酯反应第一次
16、转酯反应第二次转酯反应第二次转酯反应GpGGpX外显子外显子1内含子内含子外显子外显子2G-OHGpXpGpG剪接过程的二次转酯反应剪接过程的二次转酯反应 (twice transesterification) U1-snRNAU2-snRNA RNARNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工化加工(differential RNA processing)(differential RNA processing)。4. mRNA4. mRNA的编辑的编辑(mRNA edit
17、ing)(mRNA editing)：转录后：转录后mRNAmRNA上的修饰和加工使其携带的遗传信息发生改变上的修饰和加工使其携带的遗传信息发生改变 人类人类apo B基因基因 mRNA（14500个核苷酸）个核苷酸）肝脏肝脏apo B100（分子量为（分子量为500 000）肠道细胞肠道细胞apo B48（分子量为（分子量为240 000）mRNA编辑编辑补：内含子的分类补：内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为子分为4 4类。类。 I I：主主要要存存在在于于线线粒粒体体、叶叶绿绿体体及及某某些些低低等等真真核生物的核生物的 rRN
18、ArRNA基因；基因；IIII：也也发发现现于于线线粒粒体体、叶叶绿绿体体，转转录录产产物物是是mRNAmRNA； IIIIII：是是常常见见的的形形成成套套索索结结构构后后剪剪接接，大大多多数数mRNAmRNA基因有此类内含子；基因有此类内含子； IVIV：是是tRNAtRNA基基因因及及其其初初级级转转录录产产物物中中的的内内含含子，剪接过程需酶及子，剪接过程需酶及ATPATP。 真核生物真核生物tRNAtRNA的转录后加工的转录后加工tRNA前体前体RNA pol TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNARNAaseP、D内切酶内切酶连接酶连接酶tRNA核苷酸转移酶核苷酸转移酶
19、ATPADP碱基修饰碱基修饰（2 2）还原反应）还原反应 如：如：U U DHU DHU （3 3）核苷内的转位反应）核苷内的转位反应 如：如：U U （4 4）脱氨反应）脱氨反应 如：如：A A I I 如：如：A A A Am m（1 1）甲基化）甲基化（1 1）（1 1）（3 3）（2 2）（4 4）真核生物真核生物rRNA的转录后加工的转录后加工四膜虫四膜虫rRNArRNA的二级结构的二级结构四膜虫四膜虫rRNArRNA的剪接采用的剪接采用自我剪接自我剪接方式方式5 5- -端核苷酸序列端核苷酸序列核核 酶酶 (ribozyme): 具有酶促活性的分子。一一般是指无需蛋白质参与或不与蛋
20、白质般是指无需蛋白质参与或不与蛋白质结合，就具有催化功能的结合，就具有催化功能的RNARNA分子。分子。l1968年Francis Crick在他的论文“基因密码的起源”一文中提到“可能第一个酶是具有复制能力的RNA”时，没有人予以注意。l20年后，在1987年第52届冷泉港定量生物学国际讨论会上Alan Weiner做会议总结时又重复了20年前Francis Crick的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性的RNA分子上。核酶的发现核酶的发现l1981年，Cech发现四膜虫rRNA的前体在没有蛋白质的情况下能专一地催化寡聚核苷酸底物的切割与连接，具有分子内催化的活性。 l1983年，A
21、ltman等发现大肠杆菌RNaseP的蛋白质部分除去后，在体外高浓度Mg2+存在下，留下的RNA部分(M1 RNA)具有与全酶相同的催化活性。l1986年，Cech又证实rRNA前体的内含子能催化分子间反应。 l 1995年6月，Cuenoud等设计了具有连接酶活性的DNA分子，它能够催化两个DNA片段的连接。l 同年10月，Usman等人化学合成了一个由14个脱氧核糖核苷酸组成的单链DNA片段，能够较弱地水解RNA磷酸二酯键。利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA片段，称为酶性DNA，又称脱氧核酶T.CechT.Cech的研究工作的研究工作: : 研究目的：
22、细胞中DNA转录成rRNA后，rRNA中一些无意义的序列，或“内含子”（intron），如何从RNA分子中剪切下来的。根据过去传统的概念，这一过程必须要有蛋白质酶来完成。研究对象：四膜虫，其含有一种rRNA前体，其组成中除了核糖体RNA的固有序列外还有一个由413个核苷酸组成的插入序列（interveningsequence，IVS）。重要发现开始于1981年研究发现： a.转录产物rRNA前体很不稳定，在鸟苷和Mg2+存在下切除自身的413个核苷酸的内含子（IVS），使两个外显子拼接起来，变成成熟的rRNA分子。催化反应是在没有任何蛋白质酶的存在下发生的，称为自我剪接。 b. IVS具有类似
23、蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键。rRNA前体能靠自己完成剪接过程。在一定条件下rRNA前体可以按一定方式盘绕，进而自己切割自己，然后把保留的rRNA部分的末端连接起来。即它是可以催化自有底物切割的具有酶活性的RNA。RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应。研究目的：研究目的：t-RNA分子的剪接过程研究发现：研究发现： 在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核糖核酸酶P （RNase P）中的 RNA能够切割tRNA前体的5端。 S.Altman的研究工作的研究工作核糖核酸酶P是一种核糖核蛋白, 含有一个单链RNA分子, 长度为375个碱基，结
24、合一个相对分子质量为20kDa的多肽(119个氨基酸残基)。过去都认为核酸酶P的催化作用由RNA和蛋白质共同完成的。而该实验证明，核酸酶P的催化作用是由RNA完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用。 (Thomas Robert Cech) (SidneyAltman) 核酶的发现对于所有酶都是蛋白质的传统观念提出了挑战。1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖。最简单的核酶二级结构最简单的核酶二级结构槌头状结构槌头状结构(hammerhead structure)底物部分底物部分通常为通常为6060个核苷酸左右个核苷酸左右同同一一分分子子
25、上上包包括括有有催催化化部份和底物部份部份和底物部份 催催化化部部份份和和底底物物部部份份组组成锤头结构成锤头结构 人工设计的核酶人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子细线表示天然的核酸分子X 表示一致性序列表示一致性序列箭头表示切断点箭头表示切断点（一）应用于生命起源的研究（一）应用于生命起源的研究核酶的应用核酶的应用生命的起源？新的观点：生命从RNA开始目前已经找到了一些催化基本生化反应（如RNA剪切、连接、合成以及肽键合成等）的核酶，这些结果支持了在蛋白质产生以前核酶可能参与催化最初的新陈代谢的设想。（二）在医学领域中的应用（二）在医学领域中的应
26、用经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的RNA分子，从而抑制目标基因的表达，抑制效率高，专一性强； 利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷；免疫源性低，很少引起免疫反应；针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。核酶技术面临的问题核酶技术面临的问题核酶催化切割反应的可逆性问题提高催化效率寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞使核酶在细胞内有调控地高效表达增强核酶在细胞内的稳定性对宿主的损伤问题有待进一步考察 转录是基因表达的重要环节转录是基因表达的重要环节,转录产物进转录产物进 一步参与和调控基因
27、表达一步参与和调控基因表达(翻译环节翻译环节)DNARNAProtein转录转录转录转录翻译翻译翻译翻译 转录具有十分重要的生物学意义转录具有十分重要的生物学意义科恩伯格科恩伯格 5959岁岁, ,美国斯坦福大学医学院美国斯坦福大学医学院研究领域研究领域: : 真核生物转录的分子基础真核生物转录的分子基础 科恩伯格的研究揭示了真核生物科恩伯格的研究揭示了真核生物体内的细胞如何利用基因内存储的信体内的细胞如何利用基因内存储的信息合成蛋白质，而人类的多种疾病如息合成蛋白质，而人类的多种疾病如癌症、心脏病等都与这一过程发生紊癌症、心脏病等都与这一过程发生紊乱有关乱有关 20062006年诺贝尔化学奖
28、得主科恩伯格年诺贝尔化学奖得主科恩伯格 总总 结结1. 复制和转录的区别复制和转录的区别 2.2.几个定义几个定义 模板链、编码链、不对称转录、断裂基因、模板链、编码链、不对称转录、断裂基因、 剪接体、核酶剪接体、核酶3.3.几个问题几个问题(1)(1)原核生物原核生物RNARNA聚合酶的组成及功能聚合酶的组成及功能(2)(2)原核生物原核生物RNARNA聚合酶与模板的辨认结合过程聚合酶与模板的辨认结合过程(3)(3)原核生物的转录过程原核生物的转录过程(4)(4)真核生物真核生物mRNAmRNA的转录后加工过程的转录后加工过程 大肠杆菌大肠杆菌( (E.coliE.coli) )的的RNARNA聚合酶聚合酶
