酶的分离纯化与制剂

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1、第三章 酶的分离纯化与制剂 酶分离纯化的目的是使酶制剂酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。产品达到应用所需的纯度。n 19261926年年SumnerSumner制备了第一个制备了第一个结晶酶结晶酶，自此以后，自此以后，酶的分离纯化工作进展很快。到现在已有数以百计的酶的分离纯化工作进展很快。到现在已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净。酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净。n 并且根据酶的作用特点、物理化学性质等发展了并且根据酶的作用特点、物理化学性质等发展了各种类型的分离纯比方法、试剂和设备，各种类型的分离纯比方法、试剂和设备，n 但是，由于酶和它的来源不同

2、，也由于与之共存但是，由于酶和它的来源不同，也由于与之共存的高分子物质的复杂多样，因此要使一种酶达到高度的高分子物质的复杂多样，因此要使一种酶达到高度纯净，往往需要纯净，往往需要多种方法协同发挥作用多种方法协同发挥作用才有可能。才有可能。2酶分离的一般流程酶分离的一般流程 原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性物质名浓度(C)价格(P，)尿激酶51053108荧光素酶81032106胰岛素41019104

3、头孢菌素10102乙醇11023101第一节第一节 酶分离纯化工作的基本原则酶分离纯化工作的基本原则n。3分离纯化过程包括分离纯化过程包括3个基本步骤：个基本步骤：1 抽提抽提2 纯化纯化3 制剂制剂也就是说整个工作包括三个基本环节：也就是说整个工作包括三个基本环节：n抽提抽提(extraction)(extraction)n 是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液；n纯化纯化(purification)(purification)n 是要将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶是要将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地

4、将杂质从酶溶液中移除出去；液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去；n制剂制剂(Preparation)(Preparation)n 是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。n 为了能够成功地进行酶的分离纯化，为了能够成功地进行酶的分离纯化，应注意以下问题应注意以下问题1防止酶变性失效(denaturation-deactivationdenaturation-deactivation)n 防止酶的变性失效是酶的分离纯化工作中非常重要的问题，这一防止酶的变性失效是酶的分离纯化工作中非常重要的问题，这一点在纯化的后期尤为突出。一般地说，凡是用以预防蛋白质变性失

5、效点在纯化的后期尤为突出。一般地说，凡是用以预防蛋白质变性失效的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化工作。的方法与措施都应考虑用于酶的分离纯化工作。包括：包括： n (1)(1)除了少数例外，所有除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下操作都必须在低温条件下进行，进行，特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心；特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心；n (2)(2)大多数酶在大多数酶在pH4pH10pH10的情况下不稳定的情况下不稳定，应控制，应控制整个系统不要过酸、过碱同时要避免在调整整个系统不要过酸、过碱同时要避免在调整pHpH时产生局部时产生局部酸碱过量；酸碱过量；n 41防止酶变性失效(续)n

6、(3)(3)酶和其他蛋白一样，常易在酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成；n(4)(4)重金属等能引起酶失效重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视所有这些必须高度重视。酶不可逆失活的原因和机理蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解蛋白酶水解或自溶作用或自溶作用表面活性剂表面活性剂和去垢剂和去垢剂聚合作用聚合作用氧化作用氧化作用机械力机械力变性剂变性剂重金属离

7、子重金属离子和巯基试剂和巯基试剂冷冻和脱水冷冻和脱水热热极端极端pH蛋白质蛋白质不可逆失活不可逆失活脲和胍脲和胍高浓度盐高浓度盐螯合螯合有机溶剂有机溶剂辐射作用辐射作用蛋白质的稳定化蛋白质的稳定化蛋白质稳定化途径蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生稳定蛋白质（酶）的方法稳定蛋白质（酶）的方法2选择有效的纯化方法n 理论上，凡用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用理论上，凡用于蛋白质分离纯化的一切方法都同样适用于酶，但实际上，对于酶的分离纯化来说，它还有更大的选于酶，但实际上，对于酶的分离纯化来说，它还有更大的选择余地。因为：择余地。因为：n (1) (1)酶

8、纯化的酶纯化的最终目的最终目的是要将酶以外的一切杂质是要将酶以外的一切杂质( (包括其包括其他酶他酶) )尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的目的酶酶”的限度内，使用的限度内，使用各种各种“激烈激烈”手段手段。n (2) (2)由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可和性，因此可应用各种亲和分离法应用各种亲和分离法；而且，当这些物质存在；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化，这时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化，这样又扩大了纯化方法与纯化条

9、件的选择范围。样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。53酶活性测定贯穿纯化过程的始终n应贯穿于整个纯化过程的酶活性测定始终应贯穿于整个纯化过程的酶活性测定始终。酶具有催化活。酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。据。n 也就是说，从原料开始，整个过程中每一步都要进行比也就是说，从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一

10、步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。6第二节 酶的抽提n 抽提的要求是要将尽可能多的酶、抽提的要求是要将尽可能多的酶、尽量少的杂质从原料引入溶液。尽量少的杂质从原料引入溶液。n 抽提包括以下环节抽提包括以下环节:7 一、预处理和破细胞一、预处理和破细胞 材料预处理：材料预处理： 酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。微生物胞外酶微生物胞外酶 可以用盐析或有

11、机溶剂沉淀等从发酵可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥液中沉淀成酶泥胞内酶胞内酶 要先收集菌体，经细胞破碎后提取要先收集菌体，经细胞破碎后提取动物材料动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪应先剔除结缔组织和脂肪组织等组织等植物材料植物材料 应去皮等以免单宁等物质应去皮等以免单宁等物质着色污染着色污染酶，根据它的分布可分为酶，根据它的分布可分为酶，根据它的分布可分为酶，根据它的分布可分为细胞内酶细胞内酶细胞内酶细胞内酶( ( ( (intracellular enzymeintracellular enzymeintracellular enzymeintracellular enzyme)

12、 ) ) )和和和和细胞外细胞外细胞外细胞外酶酶酶酶( ( ( (excellular enzymeexcellular enzymeexcellular enzymeexcellular enzyme) ) ) )。n 细胞外酶细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题；n 而而细胞内酶细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。n “周质酶周质酶”(”(Pe

13、riplasmic enzymePeriplasmic enzyme) )通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放。可释放。n “ “膜结合酶膜结合酶”(”(membrance-binding enzymemembrance-binding enzyme) )则往往还有一个切断酶与颗则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题；有些情况下，蛋白质或酶在合成以后，以无活性的粒体或膜的连结问题；有些情况下，蛋白质或酶在合成以后，以无活性的状态作为状态作为“包含体包含体”(”(inclusion bodyinclusion body) )形式积累，在分出包含体后还有一形式

14、积累，在分出包含体后还有一个蛋白质复性的问题个蛋白质复性的问题。8破细胞破细胞(cell disruption)(cell disruption)9物理和化学两大类方法物理和化学两大类方法 1 1、物理破碎：、物理破碎： 研磨（手磨，球磨和石磨），研磨（手磨，球磨和石磨）， 机械捣碎（匀浆器和高速组织机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等），捣碎器等）， 高压法，高压法， 爆破性减压法，爆破性减压法， 专用波振荡，专用波振荡， 快速冷冻融化法等。快速冷冻融化法等。2 2、化学破碎：、化学破碎： 渗透作用渗透作用 自溶：自溶： 酶处理酶处理 表面活性剂表面活性剂（I I）渗透作用）渗透作用 将指数生

15、长期的菌体用缓冲液洗将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和净，并悬浮于含蔗糖和EDTAEDTA的稀的稀TrisTris缓冲液中，离心，加入缓冲液中，离心，加入 MgCl MgCl2 2剧烈搅剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。来。（IIII）自溶）自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持一定时间后可渗透性改变保持一定时间后可以使细胞自溶；以使细胞自溶；（IIIIII）酶处理）酶处理 用用溶菌酶溶菌酶专一性地分解原核专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放微生物细胞壁，使

16、胞内酶释放（IVIV）表面活性剂）表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后很膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂与脂难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。蛋白形成微泡，使之溶解。“丙酮干粉丙酮干粉” 处理法也处理法也适用于微生物材料适用于微生物材料，一般程序是先，一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在将材料粉碎、分散，然后在O O 以下的低温条件下，加入以下的低温条件下，加入5 51010倍预先冷至约倍预先冷至约-20 -20 的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。最后低温干燥，研磨过筛。丙酮处理丙酮处理一方面能有效地

17、破坏细胞壁一方面能有效地破坏细胞壁( (膜膜) )， 另一方面由于丙酮是有机溶剂，这种处理也有利另一方面由于丙酮是有机溶剂，这种处理也有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰，同时于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰，同时这种处理还能使某些膜结合酶易于溶解。这种处理还能使某些膜结合酶易于溶解。 此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。但是应注此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。但是应注意的是丙酮可能引起某些酶变性失效，有些酶则根本不能采意的是丙酮可能引起某些酶变性失效，有些酶则根本不能采用此法。用此法。丙酮干粉法丙酮干粉法(acetone powder)(acetone powde

18、r)n 微生物，由于种类不同，来源不同，处微生物，由于种类不同，来源不同，处理的方法与难易程度也有些差异。理的方法与难易程度也有些差异。n 霉菌通常比较容易对付，通过机械剪霉菌通常比较容易对付，通过机械剪切、研磨或者加细胞壁溶解酶就能解决。切、研磨或者加细胞壁溶解酶就能解决。n 对于细菌，少量的材料可用超声波破对于细菌，少量的材料可用超声波破碎器和溶菌酶等处理，大量材料可用碎器和溶菌酶等处理，大量材料可用丙酮干丙酮干粉法粉法，或用，或用自溶法自溶法(autolysis)(autolysis)。自溶自溶n 所谓所谓自溶自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与，就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与pHp

19、H条件下直接保温，条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶液化。或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶液化。此法此法有人认为不是好方法有人认为不是好方法，理由是：，理由是：n第一溶液中成分十分复杂；第一溶液中成分十分复杂；n第二有破坏目的酶的危险。在工业生产中，细菌材料还可以用细菌磨第二有破坏目的酶的危险。在工业生产中，细菌材料还可以用细菌磨或挤榨器等处理。至于酵母细胞，由于其壁厚较难对付，过去多用自溶或挤榨器等处理。至于酵母细胞，由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法。法。n后来采用的办法有：后来采用的办法有：细胞壁溶解酶处理法；细胞壁溶解酶

20、处理法； 稀盐溶液振荡法；稀盐溶液振荡法；冷冷热破壁法。热破壁法。10二、抽提大多数酶蛋白是属于大多数酶蛋白是属于球蛋白球蛋白，因此，可用，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体抽提液的具体组成组成和抽提和抽提条件的选择条件的选择取决取决于酶的于酶的溶解性溶解性、稳定性稳定性以及有利于以及有利于切断酶切断酶与其它物质的连结与其它物质的连结。111pHn 首先应考虑的是首先应考虑的是酶的酸碱稳定性酶的酸碱稳定性，选择的，选择的pHpH不能超出酶的稳定不能超出酶的稳定范围。其次，从最佳的抽提效果而言，范围。其次，从最佳的抽提效果而言，选择的选择的

21、pHpH最好远离目的酶的等最好远离目的酶的等电点电点。n 也就是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，也就是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白质宜用酸性溶液。碱性蛋白质宜用酸性溶液。n 例如，从肌肉中抽提甘油醛例如，从肌肉中抽提甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶，以稀碱溶液效果最磷酸脱氢酶，以稀碱溶液效果最好，产量较高；胰蛋白酶的抽提，通常选用好，产量较高；胰蛋白酶的抽提，通常选用O.125MolO.125MolL L的硫酸，这的硫酸，这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的杂是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的杂质也较少。

22、质也较少。n 最后，考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，最后，考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用通常以选用pH4pH46 6为佳。为佳。121 1、提取的主要方法、提取的主要方法（1 1）盐溶液提取）盐溶液提取（2 2）酸溶液提取）酸溶液提取（3 3）碱溶液提取）碱溶液提取（4 4）有机溶剂提取）有机溶剂提取2 2、酶提取过程的注意事项、酶提取过程的注意事项 pHpH的选择的选择 盐的选择盐的选择 温度的选择温度的选择 抽提液用量抽提液用量 其它其它2 2、酶提取过程的注意事项、酶提取过程的注意事项 pHpH的选择的选择 盐的选择盐的选择 温度的选择温度

23、的选择 抽提液用量抽提液用量 其它其它 pH的选择的选择首先考虑酶的稳定性；其次应首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择远离等电点；一般选择pH4-6pH4-6 为宜。为宜。 盐的选择盐的选择 大多数酶在低浓度的盐溶液大多数酶在低浓度的盐溶液 中有较大的溶解度，中有较大的溶解度， 一般选一般选 择等渗盐溶液，如择等渗盐溶液，如0.02-0.05mol/L的磷酸缓冲液或的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的的NaCl等。等。温度的选择温度的选择 一般控制在一般控制在0-4 0C，如果酶，如果酶 比较稳定可以例外。比较稳定可以例外。 例胃蛋白酶就可在例胃蛋白酶就可在3737条件下保温抽提。

24、条件下保温抽提。抽提液用量抽提液用量常采用材料量的常采用材料量的1-5倍倍 其它加入蛋白酶抑制剂、半胱 氨酸或细胞色素C等，来 稳定抽提系统。例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)；为防止氧化；为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、等因素的影响可加入半胱氨酸、DTT(dithiothreitol)DTT(dithiothreitol)以及以及惰性蛋白和底物等。惰性蛋白和底物等。三、酶

25、溶液的絮凝、净化与脱色三、酶溶液的絮凝、净化与脱色 絮凝絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等天然高分子：如壳多糖等 过滤或离心净化过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等

26、固经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。及脂类等大分子物质去除。 脱色脱色酶的工业生产中，常用的脱酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。四、浓缩n 抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低，所以在进抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低，所以在进行纯化前往往须先加以浓缩行纯化前往往须先加以浓缩(concentration)(concentration)，n这样这样一方面可使每一步的回收率升高，一方面可使每一步的回收率升

27、高，n 同时，酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较同时，酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。高。 16常用的浓缩的方法有以下几种常用的浓缩的方法有以下几种n蒸发法蒸发法超过滤法超过滤法胶过滤法胶过滤法反复冻融反复冻融n干燥（冻干燥法冻干燥法） 其他其他1 1蒸发蒸发n 一般的减压蒸发浓缩除了效率低、费时一般的减压蒸发浓缩除了效率低、费时外，有时还要加热，并且可能产生泡沫，易外，有时还要加热，并且可能产生泡沫，易使蛋白质变性失效，因此，不能用于稳定性使蛋白质变性失效，因此，不能用于稳定性较差的酶。较差的酶。n 同时，蒸发过程还可能出现同时，蒸发过程还可能出现增色增色现象，现象，影响产品的质量

28、影响产品的质量n 过去实验室中也采用过去实验室中也采用超蒸发浓缩法超蒸发浓缩法，即让暖空气流通过冷的，即让暖空气流通过冷的酶溶液表面，或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，酶溶液表面，或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳。但此法效率不佳。n 工业生产上现在应用较多的是工业生产上现在应用较多的是薄膜蒸发浓缩薄膜蒸发浓缩，即将待浓缩的，即将待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜，并使之与大面积热空酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。由于水分蒸气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。由于水分

29、蒸发时能带走部分热量，所以，只要真空条件好，酶在浓缩过程中发时能带走部分热量，所以，只要真空条件好，酶在浓缩过程中实际受到的热作用不强，因而可用于热敏性酶类的浓缩。实际受到的热作用不强，因而可用于热敏性酶类的浓缩。n 薄膜蒸发浓缩器有三种形式：薄膜蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板升膜、降膜和刮板。对于较粘。对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来增增色色现象。现象。2 2超过滤超过滤(ultrafiltration)(ultrafiltration)n 这是在加压情况下，将待浓缩液通过一层只容许水分子和小分这是在

30、加压情况下，将待浓缩液通过一层只容许水分子和小分子选择性透过的子选择性透过的微孔超滤膜微孔超滤膜，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓缩目的的一种技术。缩目的的一种技术。n 这种方法的这种方法的优点优点是：是：n 没有热破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和没有热破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和pHpH；如；如果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行粗分粗分，成本也不高，故为，成本也不高，故为人们所乐用。人们所乐用。n 超过滤可用于小量样品超过滤可用于小量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各，也可用于工业生产规模，现在已有各

31、种超过滤装置可供选择。如下图所示种超过滤装置可供选择。如下图所示17图 用超滤器浓缩蛋白酶3 3胶过滤胶过滤(gel-filtration )(gel-filtration )n 这是利用葡聚糖凝胶这是利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25Sephadex G-25或或G-50G-50等能吸等能吸水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩种浓缩. .通常采用通常采用“静态静态”方式。方式。n 应用这种方法时，可将干胶直接加入样品溶液，应用这种方法时，可将干胶直接加入样品溶液，胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分胶吸水膨润一定时

32、间后，再借助过滤或离心等办法分出浓缩的酶溶液。出浓缩的酶溶液。n 胶过滤浓缩法的胶过滤浓缩法的优点优点是：条件温和，操作简便，是：条件温和，操作简便，也没有也没有pHpH与离子强度等的改变与离子强度等的改变。184 4反复冻融反复冻融(freeze-thawing(freeze-thawing)n 此法的此法的原理原理是溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的是溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。现象。n 实施时可采用实施时可采用两种方式进行两种方式进行：n 一是先将一是先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解，这样，几乎不，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块就将

33、浮于液面，而酶等则融解并集中于下层含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液溶液( (至原体积的四分之一左右至原体积的四分之一左右) )；n 另一种则是先让另一种则是先让酶溶液缓慢冻凝，尔后再移去形成的冰块酶溶液缓慢冻凝，尔后再移去形成的冰块。n n 冻融浓缩的主要问题冻融浓缩的主要问题是，浓缩过程可能会发生是，浓缩过程可能会发生离子强度与离子强度与pHpH的变化的变化，从而导致酶失效，其次是需要大功率的致冷设备。，从而导致酶失效，其次是需要大功率的致冷设备。195.干燥将固体、半固体或浓缩液中水分（或其他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥

34、、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥6 6其他其他n 如聚乙二醇浓缩法等，它们一般只能用于如聚乙二醇浓缩法等，它们一般只能用于小量样小量样品品，而且成本很高。，而且成本很高。20第三节第三节 酶的纯化原理与方法酶的纯化原理与方法n 在抽提液中，除了目的酶以外，通常不可避免地杂有在抽提液中，除了目的酶以外，通常不可避免地杂有其他小分子和大其他小分子和大分子物质分子物质。n 其中，其中，小分子杂质小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去，因此比较容在相继的纯化步骤中一般会自然地除去，因此比较容易解决；易解决；n 大分子物质大分子物质包括包括核酸核酸、粘多糖粘多糖和和其他蛋白质其他蛋白质。核酸和粘多糖

35、往往会干扰。核酸和粘多糖往往会干扰以后的纯化，特别是细菌等的抽提液中常含有大量核酸，最好预先除去。核以后的纯化，特别是细菌等的抽提液中常含有大量核酸，最好预先除去。核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnClMnCl2 2等使之沉淀移去，必要等使之沉淀移去，必要时也可使用核酸酶。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性时也可使用核酸酶。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解有时也可用酶。这些杂质移除后，余下来的就是杂蛋白。剂等处理解有时也可用酶。这些杂质移除后，余下来的就是杂蛋白。n纯化的纯化的主要工作主要工作，同时也是

36、比较困难的工作，就是要将酶从，同时也是比较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出杂蛋白中分离出来来。n 21酶与杂蛋白的分离酶与杂蛋白的分离n 酶与杂蛋白的分离，可参照已有的方法，也可另外设酶与杂蛋白的分离，可参照已有的方法，也可另外设计和建立新的工艺流程。但为了获得较理想的分离效果应计和建立新的工艺流程。但为了获得较理想的分离效果应注意以下问题注意以下问题：n (1) (1)工作前应对所要纯化的酶的理化性质如溶解度、工作前应对所要纯化的酶的理化性质如溶解度、分子大小、电学解离性质和酶的稳定性等有一个较全面的分子大小、电学解离性质和酶的稳定性等有一个较全面的了解了解。n 这样，就可以知道应选择

37、哪些方法与条件，而应避免这样，就可以知道应选择哪些方法与条件，而应避免哪些处理，以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以哪些处理，以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。利用。n 22n(2)(2)判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活力测定为准则。n 一个好的步骤应该是一个好的步骤应该是比活力比活力( (纯度纯度) )提高大、总活力回收高，而且重提高大、总活力回收高，而且重现性好现性好。一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样。一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度

38、进一步上升。只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。n(3)(3)要严格控制操作条件要严格控制操作条件，n 这样，一方面可保证高的重复率，另一方面又可防止酶的变性失效，这样，一方面可保证高的重复率，另一方面又可防止酶的变性失效，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小蛋白质间的相互保护作用随之减小, ,酶的稳定性也因之降低酶的稳定性也因之降低，这一点尤为，这一点尤为重要。重要。 现有纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上现有纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳

39、定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立起来的，包括：的差异以及酶的生物特性为依据而建立起来的，包括： (1)(1)根据溶解度的不同根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。及选择性沉淀法等。n (2) (2)根据分子大小的差别根据分子大小的差别，有胶过滤，有胶过滤( (层析层析) )法、超过滤法及超离法、超过滤法及超离心法等。心法等。n (3) (3)根据电学、解离性质根据电学、解离性质，有吸附，有吸附( (层析层析) )法、离子交换层析法、法、离子交换层析法、电泳法以及集层析与电泳之长的聚焦层析法等。电泳法以及集层析与电泳之长

40、的聚焦层析法等。n (4) (4)基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种亲和分离法特点而建立的各种亲和分离法等。等。n (5) (5)利用稳定性差异利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法。面变性法。n 值得提到的是，在这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作值得提到的是，在这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用。用。23一、根据溶解度不同进行的纯化n1、盐析、盐析(Salting Out)法法2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀降低介电常数法（有机溶剂沉

41、淀 法）法） 3、等电点沉淀法等电点沉淀法4、共沉淀法、共沉淀法5、选择性沉淀法选择性沉淀法n6、液液液分离法液分离法241 1盐析法盐析法n 盐析法是古老的、但也是目前仍广泛采用的方法。盐析法是古老的、但也是目前仍广泛采用的方法。n盐析法根据的盐析法根据的原理原理是：是：n 球蛋白类在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子球蛋白类在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表现强度升高而增大，表现“盐溶盐溶”(salting in)(salting in)特性。但特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别又

42、会先后以不同速度下降，分别“盐析盐析( (salting outsalting out)”)”沉淀析出。沉淀析出。n 原因原因：n这是因为这是因为盐浓度较低盐浓度较低时，盐离子与蛋白质分子中的时，盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数活度系数使使其溶解度增加。其溶解度增加。n 而在而在高浓度盐溶液高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓中，蛋白质的溶解度随盐浓度增加而减少，结果使酶蛋白沉淀而析出，则称为度增加而减少，结果使酶蛋白沉淀而析出，则称为“盐析盐析”。这是因为盐离子与水这种偶极分子作用，使。这是因为盐离子与水这种偶极分子作用，

43、使水分子活度降低水分子活度降低，导致蛋白质水合程度减少，从而趋，导致蛋白质水合程度减少，从而趋使酶蛋白溶解度降低。使酶蛋白溶解度降低。n 由于在某一盐浓度下酶与其他杂蛋白溶解度不同，由于在某一盐浓度下酶与其他杂蛋白溶解度不同，因而可达到彼此分离的目的。因而可达到彼此分离的目的。 n 盐析纯化法盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度高盐浓度的溶的溶液中溶解度差别而建立的一种纯化方法。液中溶解度差别而建立的一种纯化方法。为了获得较好的盐析效果，应控制下述因素：为了获得较好的盐析效果，应控制下述因素：n (1)pH(1)pHn 控制盐析控制盐析pHpH可以提高纯化效果，如甘油醛可

44、以提高纯化效果，如甘油醛-3-3-磷酸脱氢酶在某一磷酸脱氢酶在某一盐浓度下可通过改变盐浓度下可通过改变pHpH而达到纯化。而达到纯化。n 但一般来说，但一般来说，pHpH可选择的范围不大。大多数情况，盐析的可选择的范围不大。大多数情况，盐析的pHpH宜接宜接近待纯酶的等电点。近待纯酶的等电点。n 有些情况，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离。此有些情况，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离。此时如控制时如控制pHpH5 5或或PH PH 6 6，使它们带相同电荷可以减少络合物形成，使它们带相同电荷可以减少络合物形成，这样盐析效果常会有些改善。这样盐析效果常会有些改善。n 25(2

45、)(2)盐盐n 在纯化的最初阶段，盐性质的影响不在纯化的最初阶段，盐性质的影响不一定很明显但是随着酶的纯度提高，盐一定很明显但是随着酶的纯度提高，盐的特征效应就可能突出出来。一般地说，的特征效应就可能突出出来。一般地说，盐析常数盐析常数K Ksoso越大，效果越好。越大，效果越好。n 实践表明实践表明n 就阳离子而言，一价盐通常比二价盐有效；就阳离子而言，一价盐通常比二价盐有效；而阴离子则相反，二价盐比一价盐好。符合这而阴离子则相反，二价盐比一价盐好。符合这种条件的盐有种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠硫酸铵、硫酸钠等。等。n 硫酸铵最常用，它的最大硫酸铵最常用，它的最大优点优点是：溶解度是：溶解度大

46、，溶解的温度系数小大，溶解的温度系数小(0 (0 ，706g706gL;25L;25，767g767gL)L)，即使是在低温的溶解度范围内，即使是在低温的溶解度范围内，几乎所有蛋白质都能盐析出来。几乎所有蛋白质都能盐析出来。n 用硫酸铵进行盐析时，溶液的盐浓度通常以饱和度表示，即以饱和用硫酸铵进行盐析时，溶液的盐浓度通常以饱和度表示，即以饱和溶液中盐的饱和度为溶液中盐的饱和度为100100，即相当于，即相当于4mol/L(04mol/L(0)进行计算。调整溶液进行计算。调整溶液的盐浓度有两种方式，当蛋白质溶液体积不太大，而要达到的盐浓度又的盐浓度有两种方式，当蛋白质溶液体积不太大，而要达到的盐

47、浓度又不太高时，为不太高时，为防止加盐过程中产生局部浓度过高防止加盐过程中产生局部浓度过高，最好添加饱和硫酸铵，最好添加饱和硫酸铵溶液，加入量可按下式计算：溶液，加入量可按下式计算：n V VV Vo o(S(S2 2 - S - S1 1) )(1- S(1- S2 2) 4.2) 4.2n V V和和V Vo o分别为应加入的硫酸铵饱和溶液体积与蛋白溶液原有体积；分别为应加入的硫酸铵饱和溶液体积与蛋白溶液原有体积；S S2 2和和S S1 1为要达到的和原有的硫酸铵饱和度。浓的硫酸铵溶液的为要达到的和原有的硫酸铵饱和度。浓的硫酸铵溶液的pHpH通常是通常是4.54.55.55.5，调节，调

48、节pHpH可用可用硫酸硫酸或或氨水氨水。26n 测定溶液的测定溶液的pHpH时时，一般应先稀释，一般应先稀释l0l0倍左右，然后再倍左右，然后再用用pHpH试纸或试纸或pHpH计测定。计测定。n 另一种情况是蛋白质溶液原来体积已经很大，而要另一种情况是蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高，此时则以加达到的盐浓度又很高，此时则以加固体硫酸铵固体硫酸铵为宜，加为宜，加入量可通过计算，也可以直接查表。入量可通过计算，也可以直接查表。n 加固体较为经济，也较方便加固体较为经济，也较方便, ,但所用的固体应充分研但所用的固体应充分研细，并在不断搅拌下缓缓加入，以避免局部过浓，同时细，并在不

49、断搅拌下缓缓加入，以避免局部过浓，同时要防止泡沫大量生成。要防止泡沫大量生成。(3)(3)温度温度n 从酶的稳定性和溶解度而言，盐析温度以控从酶的稳定性和溶解度而言，盐析温度以控制在制在44为宜；为宜；(4)(4)蛋白质浓度蛋白质浓度n 这是一个十分重要、而又常被忽视的因素：这是一个十分重要、而又常被忽视的因素：n 它它一方面一方面能影响盐析效果的重现性，因为蛋白浓度不同，能影响盐析效果的重现性，因为蛋白浓度不同，分级分离范围也往往会发生一些变动；分级分离范围也往往会发生一些变动；n 另另一方面一方面，蛋白浓度在，蛋白浓度在100ug100ugmlml以下，盐析沉淀一般以下，盐析沉淀一般很困难

50、，有时甚至根本不能形成沉淀。很困难，有时甚至根本不能形成沉淀。n 在在200ug/ml-1mg/ml200ug/ml-1mg/ml范围内，沉淀虽能生成，但时间较范围内，沉淀虽能生成，但时间较长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在白浓度应在1mg/ml1mg/ml以以上。上。n 27(5)(5)盐析操作盐析操作n 盐析沉淀通常至少要近盐析沉淀通常至少要近一小时一小时才能完成，沉淀可才能完成，沉淀可通过离心或压滤和母液分离。通过离心或压滤和母液分离。n 盐浓度低时，离心比较容易，而过滤较难；浓度盐浓度低时，离心比较容易，而过滤

51、较难；浓度较高时，需要高速离心，但过滤较易。较高时，需要高速离心，但过滤较易。n 盐析如果在碱性条件下进行，而盐浓度又很高盐析如果在碱性条件下进行，而盐浓度又很高( (譬譬如大于如大于5050 S) S)时，盐析物常常不易离心沉降，有时还时，盐析物常常不易离心沉降，有时还可能出现上浮现象。可能出现上浮现象。n 为使以后的纯化具有较好的重现性，盐析后沉淀为使以后的纯化具有较好的重现性，盐析后沉淀中夹带的母液应尽量除尽。中夹带的母液应尽量除尽。n 获得盐析沉淀后，可将其溶于适当的缓冲液中，并除获得盐析沉淀后，可将其溶于适当的缓冲液中，并除去不溶蛋白，这样去不溶蛋白，这样相当于又一次纯化相当于又一次

52、纯化。n 有时也可用不同盐浓度的溶液对沉淀进行分级的溶解。有时也可用不同盐浓度的溶液对沉淀进行分级的溶解。n 28盐析法的盐析法的优缺点优缺点n 盐析法的盐析法的优点优点是：简便、安全是：简便、安全( (大多数蛋白质在高浓度盐溶大多数蛋白质在高浓度盐溶液中相当稳定液中相当稳定) )、重现性好。、重现性好。n 其其缺点缺点是：分辨率低，纯度提高不显著，同时还常常有脱是：分辨率低，纯度提高不显著，同时还常常有脱盐问题。盐问题。n 盐析法的一个发展就是和层析技术相结合形成盐析法的一个发展就是和层析技术相结合形成盐析层析法盐析层析法(salting out chromatography),(salti

53、ng out chromatography),即以琼脂糖等非极性物质为柱即以琼脂糖等非极性物质为柱层析的支持体，在高盐浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附层析的支持体，在高盐浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附下来，然后再梯度地降低盐浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来下来，然后再梯度地降低盐浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来, , 这种技术的这种技术的优点优点是纯化量大，重复性好，分辨率较高。是纯化量大，重复性好，分辨率较高。2有机溶剂沉淀法n 此法的此法的原理原理是，不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才是，不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。能使它们分别从溶液中沉淀析出

54、。n 有机溶剂在这个过程中的有机溶剂在这个过程中的主要作用主要作用是是降低溶液的介电常数降低溶液的介电常数，因为分子间的因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。蛋白质分子间的引力增加，溶解度降低。n 有机溶剂的有机溶剂的另一作用另一作用可能是部分地引起可能是部分地引起蛋白质脱水蛋白质脱水而沉淀。不而沉淀。不过，蛋白质溶解度和有机溶剂浓度之间目前还没有一个可用的关过，蛋白质溶解度和有机溶剂浓度之间目前还没有一个可用的关系式。系式。29进行有机溶剂沉淀处理时，应考虑以下因素:n影响介电常数的主要因素：

55、影响介电常数的主要因素： 温度温度 有机溶剂有机溶剂 离子强度离子强度 pH pH值：值： n 30(1)(1)温度温度n 这是最重要的因素，因为大多数蛋白质遇到有机溶剂很不稳这是最重要的因素，因为大多数蛋白质遇到有机溶剂很不稳定定, ,特别特别是温度较高是温度较高( (例如室温例如室温) )的情况下，极易变性失效，故操作的情况下，极易变性失效，故操作应在应在0 0 以下进行。以下进行。n 有机溶剂也必须预先有机溶剂也必须预先冷却到冷却到-20-20-15 -15 ，并在搅拌下缓慢，并在搅拌下缓慢加入。沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离加入。沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离, ,获得的沉淀还

56、应立获得的沉淀还应立即用冷的缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。即用冷的缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。n 个别酶对有机溶剂比较不敏感，比较稳定，此时可在较高温个别酶对有机溶剂比较不敏感，比较稳定，此时可在较高温度度( (如室温如室温) )下进行操作，以便除去较多的杂蛋白。下进行操作，以便除去较多的杂蛋白。(2)pH(2)pHn 由于蛋白质处于等电点时溶解度最低，故有机溶剂沉淀由于蛋白质处于等电点时溶解度最低，故有机溶剂沉淀也多选在也多选在靠靠近目的酶的等电点近目的酶的等电点pHpH条件下进行。条件下进行。n 例如，例如，“肌肉酶肌肉酶”的分离在的分离在pH 6.5pH 6.5时效果较好。时效

57、果较好。pHpH调整调整通常选用通常选用0.05mol0.05molL L的缓冲液。的缓冲液。(3)(3)离子和离子强度离子和离子强度n 中性盐在多数情况下能增大蛋白质的溶解度，并中性盐在多数情况下能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。能减少变性影响。n 在进行有机溶剂的分级沉淀时，如果适当地添加在进行有机溶剂的分级沉淀时，如果适当地添加某些某些中性盐中性盐。n 例如，例如，5 5-10-10的硫酸铵，往往有助于提高分离的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。效果。n 但盐的浓度一般不宜超过但盐的浓度一般不宜超过0.05mol/L0.05mol/L，否则沉淀不，否则沉淀不好，甚至沉淀全无，同时有机

58、溶剂消耗也多。好，甚至沉淀全无，同时有机溶剂消耗也多。多价阳离子效应多价阳离子效应n 在进行有机溶剂沉淀时，也可利用在进行有机溶剂沉淀时，也可利用多价阳离子效应多价阳离子效应，即在向酶溶液加入有机溶剂时，可将溶液的即在向酶溶液加入有机溶剂时，可将溶液的pHpH调整到略高调整到略高于目的蛋白质的等电点，使之带有负电荷，然后再添加少于目的蛋白质的等电点，使之带有负电荷，然后再添加少量量(0.005(0.0050.02mol/L)0.02mol/L)的多价阳离子，例如的多价阳离子，例如ZnZn2+2+、pbpb2+2+。等，。等，n 由于这些离子能和阴离子蛋白质形成络合物，降低其由于这些离子能和阴离

59、子蛋白质形成络合物，降低其溶解度，从而可减少有机溶剂的用量，同时也可提高分离溶解度，从而可减少有机溶剂的用量，同时也可提高分离的分辨效果。但是，应注意的分辨效果。但是，应注意磷酸盐磷酸盐存在的情况下不能用存在的情况下不能用ZnZn2+2+以免导致磷酸锌沉淀形成。以免导致磷酸锌沉淀形成。n 31(4)(4)有机溶剂有机溶剂n 用于蛋白质纯化的有机溶剂中，用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好丙酮的分离效果最好，引起失效的情况也较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。引起失效的情况也较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积比表示，加入量可按下式计算：有机溶剂浓度通常以百分

60、体积比表示，加入量可按下式计算：n V VV Vo o(S(S2 2 - S - S1 1) )(S - S(S - S2 2) ) n其中，其中， V V和和V Vo o分别为应加入的有机溶剂体积和原溶液的体积，分别为应加入的有机溶剂体积和原溶液的体积，S S、S S1 1和和S S2 2分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机分别为待加的有机溶剂、原来溶液中含有的有机溶剂和溶液所要达到的有机溶剂的百分浓度。溶剂和溶液所要达到的有机溶剂的百分浓度。n 有机溶剂沉淀法的有机溶剂沉淀法的优点优点是：分辨率高，溶剂容易除去。是：分辨率高，溶剂容易除去。缺点缺点是酶在有机溶剂中一般不稳定，易引起变

61、性失效。是酶在有机溶剂中一般不稳定，易引起变性失效。3 3共沉淀法共沉淀法n 32 一些大分子一些大分子非离子型聚合物非离子型聚合物如聚乙二醇如聚乙二醇（PEGPEG）, ,聚乙烯亚胺（聚乙烯亚胺（PEIPEI）单宁酸，硫酸链霉素以）单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂（及表面活性剂（SDSSDS）等在一定条件下可以直接或间）等在一定条件下可以直接或间接与蛋白质形成接与蛋白质形成络合物络合物而沉淀析出而沉淀析出, ,再用适当的方法再用适当的方法使酶溶解出来。使酶溶解出来。4、选择性沉淀法选择性沉淀法n n 33 有些多聚电解质可以在有些多聚电解质可以在极低浓度极低浓度下选下选择性地与某些酶结合而形

62、成沉淀。择性地与某些酶结合而形成沉淀。 如聚丙烯酸（如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：过程如下： PAA+酶酶 PAA-酶酶 PAA-酶酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA5 5等电点沉淀法等电点沉淀法n 等电点沉淀根据的等电点沉淀根据的原理原理是，是，蛋白质的溶解度随分子间引力增大而蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，当其他条件相同时，分子间的引力在蛋白质处于等电点状态最变小，当其他条件相同时，分子间的引力在蛋白质处于等

63、电点状态最大，因而容易沉淀析出大，因而容易沉淀析出。n 由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故而一般很少单独使用，更多的是用作其他沉淀法中一个组合条件。而一般很少单独使用，更多的是用作其他沉淀法中一个组合条件。n 例如，用于除去杂蛋白，因为在某种例如，用于除去杂蛋白，因为在某种pHpH条件下，样品中不仅会使条件下，样品中不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀，对于等电点两侧、带相反电荷的杂质处于等电点状态的蛋白质沉淀，对于等电点两侧、带相反电荷的杂质也可能因形成也可能因形成复合物复合物而沉淀。而沉淀。n 34n 从而可除去大

64、量杂蛋白。纯化动物材料抽提液中的酶时，就从而可除去大量杂蛋白。纯化动物材料抽提液中的酶时，就可先将可先将pHpH调整至调整至5 5左右左右，待放置片刻后，核蛋白等颗粒杂质就会沉，待放置片刻后，核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出，使酶溶液达到淀析出，使酶溶液达到“一步澄清一步澄清”。n 又例如，纯化血清胆碱酯酶时，可先将又例如，纯化血清胆碱酯酶时，可先将pHpH调至调至2.82.83.03.0，除，除去酸性杂蛋白。值得顺便提到，调整溶液的去酸性杂蛋白。值得顺便提到，调整溶液的pHpH时，应选用具有相时，应选用具有相同离子的酸、碱或缓冲液。同离子的酸、碱或缓冲液。6 6液液液分离法液分离法n 如果说，上

65、面介绍的方法是利用溶解度差别进行的，那么，从广义如果说，上面介绍的方法是利用溶解度差别进行的，那么，从广义上说，它们都是以上说，它们都是以分配系数分配系数的不同为基础的纯化方法，属于的不同为基础的纯化方法，属于“固固液液”类型；类型；n 与此相对应的，近年来也开发了与此相对应的，近年来也开发了“液液液液”类型的分离法，这种方类型的分离法，这种方法又称为法又称为双相双相( (水溶液水溶液) )分离法分离法(aqueous two-phase separation)(aqueous two-phase separation)。n 它实际上就是利用它实际上就是利用酶和杂蛋白在不相混溶酶和杂蛋白在不相

66、混溶( (的多聚体形成的多聚体形成) )的两相系的两相系统中分配系数不同而达到纯化目的的方法统中分配系数不同而达到纯化目的的方法。n 以聚乙二醇以聚乙二醇(PEG)(PEG)和右旋糖酐和右旋糖酐(dextran)(dextran)形成的两相系统为例，在这形成的两相系统为例，在这样的双相系统中，上相主要是样的双相系统中，上相主要是PECPEC，下相主要的是，下相主要的是dextrandextran，分配系数义，分配系数义定义为：定义为：n n 35n其中，其中，M M为待纯化物质的分子量，为待纯化物质的分子量，A A为系统的特性系数，为系统的特性系数，kBkB为为BoltzmannBoltzma

67、nn常数，常数，T T为绝对温度。通过选择和控制两相系为绝对温度。通过选择和控制两相系统中多聚物的种类与浓度、系统的统中多聚物的种类与浓度、系统的pHpH、离子和离子强度以、离子和离子强度以及温度，就有可能使酶和杂蛋白达到很好的分离。及温度，就有可能使酶和杂蛋白达到很好的分离。n 这种方法的这种方法的优点优点是：条件温和，适于大量样品的纯化；是：条件温和，适于大量样品的纯化；但成本高，纯化后还须除去介质带来的多聚物。但成本高，纯化后还须除去介质带来的多聚物。其中其中C C上上和和C C下下分别为酶或蛋白质在上相和下相中的浓度。分别为酶或蛋白质在上相和下相中的浓度。酶和蛋白质的酶和蛋白质的K K

68、通常介于通常介于0.10.1与与0 0之间。由于这种分配服之间。由于这种分配服从从BrBrnstedtnstedt方程：方程：二、按照分子大小进行的纯化二、按照分子大小进行的纯化n 36透析透析胶过滤胶过滤(层析层析)法法筛膜分离法筛膜分离法超离心分离法超离心分离法。1 1、透、透 析析(Dialysis)(Dialysis)法：法：过程：过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；蛋白质被截留在透析袋中；透析袋类型透析袋类型：有两种，再

69、生纤维素膜透析袋和纤维素：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（留值（ 1 1 10102 2D D）；商品名为）；商品名为spectraporspectrapor等。等。透析袋的预处理透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%10%甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；甘油处理过，只要浸泡湿润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用必要时可用10mmol/L 10mmol/L 碳酸氢钠，碳酸氢钠，50%50%乙醇和乙醇和10mmol/L 10mmol/L EDT

70、AEDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。处理后，再用蒸馏水洗涤。透析袋透析袋酶溶液酶溶液蒸馏水蒸馏水透析装置和过程透析装置和过程2 2胶过滤胶过滤( (层析层析) )法法n 胶过滤胶过滤( (层析层析) )法法(gel filtration or gel permeation (gel filtration or gel permeation chromatography)chromatography)是是PoratchPoratch和和FlodinFlodin最早建立的，现在已广泛用最早建立的，现在已广泛用于生物大分子的纯化。于生物大分子的纯化。n原理原理：又称：又称分子筛层析分子筛层析，在层析柱

71、中填充凝胶介质，加入待分离，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。n n 这种方法的原理如图所示。它通常以这种方法的原理如图所示。它通常以柱层析柱层析的

72、方的方式进行。柱中填充分子筛介质，常用于生物大分子分式进行。柱中填充分子筛介质，常用于生物大分子分离的分子筛介质是具有一定孔径的球状凝放物质。离的分子筛介质是具有一定孔径的球状凝放物质。n 层析柱中装入层析柱中装入( (选择好的选择好的) )适当孔径的凝胶物质以适当孔径的凝胶物质以后，加入待纯化样品，再用适当的溶剂或缓冲液使样后，加入待纯化样品，再用适当的溶剂或缓冲液使样品在柱中自上而下地扩展。品在柱中自上而下地扩展。n 这样，样品中的各种分子将技其分子大小表现不这样，样品中的各种分子将技其分子大小表现不同的层析性态而分离。同的层析性态而分离。n 大于凝胶孔径的分子由于不能进入胶粒内部，只能沿

73、大于凝胶孔径的分子由于不能进入胶粒内部，只能沿胶粒间隙扩展，因而走的是一条较胶粒间隙扩展，因而走的是一条较“直直”的的“路路”，表现，表现出较快的移动速度；反之，小于凝胶孔径的分子，由于它出较快的移动速度；反之，小于凝胶孔径的分子，由于它们能自由进出胶粒内外，按照分子热运动的规律，其运动们能自由进出胶粒内外，按照分子热运动的规律，其运动轨迹轨迹“迂回曲折迂回曲折”，因此，表现为较慢的下移速度。所以，因此，表现为较慢的下移速度。所以，待纯化样品通过一定长度的层析柱后，不同大小的分子都待纯化样品通过一定长度的层析柱后，不同大小的分子都将按先后顺序依次流出，彼此分开，达到纯化目的。由于将按先后顺序依

74、次流出，彼此分开，达到纯化目的。由于某些分子被排阻在胶粒外，故这种层析又称为某些分子被排阻在胶粒外，故这种层析又称为胶排阻层析胶排阻层析(gel exclusion chromatography)(gel exclusion chromatography)。凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤凝胶过滤Tubes march in from left A280Fraction #部分使用的担体部分使用的担体 目前使用最广泛的担体材料：目前使用最广泛的担体材料： 交联后的葡聚糖凝胶交联后的葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 琼脂琼脂 其它物料其它物料为了使胶过滤有较好的分离效果，应考为了使胶过滤有较好的分离效果

75、，应考虑以下问题：虑以下问题：n (1)(1)胶的选择胶的选择n 作为分子筛的凝胶是由亲水的线状聚合物通过交联剂作为分子筛的凝胶是由亲水的线状聚合物通过交联剂交联，或通过聚合物自身缔合组成的、具有网眼结构的交联，或通过聚合物自身缔合组成的、具有网眼结构的胶粒物质。网眼孔径大小由交联程度和聚合物的浓度决胶粒物质。网眼孔径大小由交联程度和聚合物的浓度决定。最常用的凝胶有如下几类：定。最常用的凝胶有如下几类：n 38n葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶，是相对分子质量从几万到几十万的葡聚糖通，是相对分子质量从几万到几十万的葡聚糖通过过环氧氯丙烷环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可用于相对分子质交联而成的网状结构物

76、质，可用于相对分子质量量1000-5000001000-500000分子的分离。以商品分子的分离。以商品Sephadex G-Sephadex G-为例，为例，G-G-后后的数字为胶膨润时吸水量的的数字为胶膨润时吸水量的1010倍，如倍，如G-25G-25就表示该胶物质每就表示该胶物质每1g1g能吸水能吸水2.5ml2.5ml，这个数字越大，说明吸水量越高，孔径也越，这个数字越大，说明吸水量越高，孔径也越大，更适合于较大分子的分离。表大，更适合于较大分子的分离。表4.24.2是各种是各种SephadexSephadex的特性的特性数据。另一类商品为数据。另一类商品为Sephadexe LH-S

77、ephadexe LH-，它和，它和G-G-类型不同，是兼类型不同，是兼具亲脂性和亲水性的凝胶，可用于脂类化合物的分离。此外具亲脂性和亲水性的凝胶，可用于脂类化合物的分离。此外还有一种类型称为还有一种类型称为Sephacyl S-Sephacyl S-，它是通过，它是通过N N，N-N-甲叉双丙甲叉双丙烯酰胺交联形成的烯丙基葡聚糖，可用于水溶液系统，也适烯酰胺交联形成的烯丙基葡聚糖，可用于水溶液系统，也适合于有机溶剂或高浓度氢键解离试剂存在的系统。合于有机溶剂或高浓度氢键解离试剂存在的系统。各种各种SephadexSephadex葡聚糖分子筛凝胶葡聚糖分子筛凝胶39n聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝

78、胶，是丙烯酰胺与交联剂，是丙烯酰胺与交联剂N,N-N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺共聚得到的交联凝胶物质。双丙烯酰胺共聚得到的交联凝胶物质。n 以商品以商品Bio-Gel P-Bio-Gel P-为例，为例，P-P-后的数字乘后的数字乘1000,1000,表示表示该胶可用于分离的最高相对该胶可用于分离的最高相对n 分子质量分子质量( (亦即排阻的相对分子质量亦即排阻的相对分子质量) )。聚丙烯酰。聚丙烯酰胶凝胶适合于分离的范围和葡聚糖凝胶大致相同。表胶凝胶适合于分离的范围和葡聚糖凝胶大致相同。表4.34.3是各种是各种Bio-Gel P-Bio-Gel P-的特性数据。的特性数据。40各种各种Bio

79、-GelBio-Gel聚丙烯酰胺分子筛凝胶聚丙烯酰胺分子筛凝胶41琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶n 是琼脂抽去琼脂胶等后得到的是琼脂抽去琼脂胶等后得到的D-D-半乳糖半乳糖和和3,6-3,6-脱水半乳糖脱水半乳糖相间排相间排列组成的链状多糖。和上述两种凝胶不同，琼脂糖凝胶不包含另外的列组成的链状多糖。和上述两种凝胶不同，琼脂糖凝胶不包含另外的交联物质，是通过琼脂糖本身缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由交联物质，是通过琼脂糖本身缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定。以商品胶的浓度决定。以商品SepharoseSepharose为例，为例，2B2B、4B4B和和6B6B等分别表示琼脂糖等分别表示琼

80、脂糖含量为含量为2 2、4 4和和6 6。这类凝胶的孔径都比较大，适于相对分子质量。这类凝胶的孔径都比较大，适于相对分子质量较大的物质如病毒、细胞颗粒体和较大的物质如病毒、细胞颗粒体和DNADNA等的分离。表等的分离。表4444列举了列举了SepharoseSepharose的有关特性数据。的有关特性数据。n 琼脂糖凝胶还有另外两种商品，一为琼脂糖凝胶还有另外两种商品，一为Bio-Gel A-,Bio-Gel A-,它是琼脂糖与它是琼脂糖与丙烯酰胺的交联胶，可用于有氢键分解试剂存在的情况，而且有较致丙烯酰胺的交联胶，可用于有氢键分解试剂存在的情况，而且有较致密的孔径，适用于蛋白质的分离。另一为

81、密的孔径，适用于蛋白质的分离。另一为Sepharose CLSepharose CL，它是在强碱，它是在强碱性条件下和性条件下和3 3，3-3-二溴丙醇反应的产物，适用于有机溶剂和氢键分解试二溴丙醇反应的产物，适用于有机溶剂和氢键分解试剂存在的情剂存在的情。43某些Sepharose琼脂糖分子筛凝胶43n 上述各类凝胶都有上述各类凝胶都有很高的亲水性很高的亲水性，能在水中膨润。膨，能在水中膨润。膨润后的凝胶具有一定的弹性和硬度，并有很高的化学稳定润后的凝胶具有一定的弹性和硬度，并有很高的化学稳定性，在盐和碱溶液中都很稳。可应用于性，在盐和碱溶液中都很稳。可应用于4-94-9的的pHpH范围；但

82、是，范围；但是，如果在如果在pH 2pH 2以下的酸性条件下长时间处理，则有水解破坏以下的酸性条件下长时间处理，则有水解破坏的可能。的可能。n 此外，它们对氧化剂也较敏感。上述胶都没有易于解此外，它们对氧化剂也较敏感。上述胶都没有易于解离的基团，因此很少非专一性吸附。离的基团，因此很少非专一性吸附。SephacrylSephacryl，Sepharose CLSepharose CL和和Bio-Gel ABio-Gel A相对相对SephadexSephadex与与SeparoseSeparose而言而言, ,在化学稳定性与机械强度上都有所增强，因而适用面更广。在化学稳定性与机械强度上都有所增

83、强，因而适用面更广。n 44胶过滤胶过滤( (层析层析) )法在酶的纯化工作中有法在酶的纯化工作中有三种类型的应用三种类型的应用： 浓缩浓缩 族分族分( (包括脱盐、更换缓冲系统以及分离底物和包括脱盐、更换缓冲系统以及分离底物和产物分离等产物分离等) ) 分级分离分级分离。 前两种前两种应用通常选择小孔径胶如应用通常选择小孔径胶如Sephdex G-25Sephdex G-25，因为它们有较好的机械强度和流动特性因为它们有较好的机械强度和流动特性, ,并足以对付相并足以对付相对分子质量在对分子质量在50005000以下的分子。以下的分子。 至于至于分级分离分级分离，则须根据待纯化样品来选用胶，

84、不，则须根据待纯化样品来选用胶，不过，如果使用低排阻极限的胶过，如果使用低排阻极限的胶Sephadex G-75Sephadex G-75，那么，那么，所需要获得的组分可较早地流出，而且有助于提高回收所需要获得的组分可较早地流出，而且有助于提高回收率和减少稀释，同时这类胶的硬度也较好，可得到较大率和减少稀释，同时这类胶的硬度也较好，可得到较大的流速。的流速。 至于胶粒大小，不同凝胶有各自的规格。以至于胶粒大小，不同凝胶有各自的规格。以Sephadex G-Sephadex G-为例，它有四种等级：为例，它有四种等级：超细、细、超细、细、中粗和粗中粗和粗。 随着胶粒变细。分离效果随着胶粒变细。分

85、离效果( (即分辨率即分辨率) )也升高；也升高；但是若按层析的流速，粗粒级为好。但是若按层析的流速，粗粒级为好。 通常实验室工作中通常实验室工作中: : 族分族分: :可用中粗或粗级胶粒可用中粗或粗级胶粒; ; 常规的分级分离常规的分级分离: :则一般用细级胶粒则一般用细级胶粒 分析性的工作分析性的工作：超细级胶粒多用于。超细级胶粒多用于。(2) 柱层析的基本过程与要求n 柱层析是十分常用的纯化方式柱层析是十分常用的纯化方式n 柱层析一般包括如下柱层析一般包括如下环节环节：n 层析介质的平衡、层析介质的平衡、n 装柱、装柱、n 加样、加样、n 扩展扩展( (包括洗涤和洗脱包括洗涤和洗脱) )

86、 n 以及与此同时进行的以及与此同时进行的流出液成分流出液成分( (蛋白质或酶活性蛋白质或酶活性) )的检测和的检测和分部收集分部收集。n 柱层析的结果通常以柱层析的结果通常以洗脱曲线洗脱曲线的形式表示，即以流出液中的蛋白质的形式表示，即以流出液中的蛋白质浓度浓度( (如如A280)A280)或酶活力相对洗脱或酶活力相对洗脱( (液液) )体积体积(Ve)(Ve)的图形的图形( (图图4 42)2)表示。表示。45柱层析洗脱曲线柱层析洗脱曲线(A) (A) 洗脱体积洗脱体积(Ve)(Ve)的确定方法的确定方法(B)(B)46(4) (4) 其他有关问题其他有关问题n 样品样品：n 胶过滤胶过滤

87、( (层析层析) )法与样品浓度没有太大的关系，即使是在蛋白浓度法与样品浓度没有太大的关系，即使是在蛋白浓度达到达到75mg/ml75mg/ml的情况下也无明显影响。但样品中如含有粘性成分，则的情况下也无明显影响。但样品中如含有粘性成分，则分离效果可能改变。分离效果可能改变。n 扩展洗脱液扩展洗脱液：n 洗脱液组成一般不直接影响胶过滤的分辨率。通常，不带电荷的洗脱液组成一般不直接影响胶过滤的分辨率。通常，不带电荷的物质可用蒸馏水洗脱；荷电溶质可用物质可用蒸馏水洗脱；荷电溶质可用Tris-HClTris-HCl、磷酸盐之类的缓冲液，、磷酸盐之类的缓冲液，离子强度应控制在离子强度应控制在0.02m

88、ol/L0.02mol/L左右，左右，pHpH由酶的稳定性及溶解度决定。由酶的稳定性及溶解度决定。如果层析产品接下来要进行冰冻干燥，则可采用挥发性的缓冲液，如如果层析产品接下来要进行冰冻干燥，则可采用挥发性的缓冲液，如醋酸铵、重碳酸铵和乙二胺醋酸盐等。醋酸铵、重碳酸铵和乙二胺醋酸盐等。n 47n胶的再生与保存胶的再生与保存：n 胶过滤在每个分离过程结束后，由于胶本身没有什么变化，一胶过滤在每个分离过程结束后，由于胶本身没有什么变化，一般不需要特殊的再生处理，经过蒸馏水、稀盐或缓冲液洗涤后又可般不需要特殊的再生处理，经过蒸馏水、稀盐或缓冲液洗涤后又可继续使用；继续使用；n 如有尘粒污染可用反向上

89、行法漂洗；如有尘粒污染可用反向上行法漂洗；n 如有微量的非专一性的交换或吸附，则可先用如有微量的非专一性的交换或吸附，则可先用0.1N HCl0.1N HCl或或O.1N O.1N NaOHNaOH处理，然后再用蒸馏水洗至中性。处理，然后再用蒸馏水洗至中性。n 为防止微生物污染，可用为防止微生物污染，可用0.02% NaN0.02% NaN3 3流洗，但应注意到流洗，但应注意到NaNNaN3 3；可能对某些酶有抑制作用。洗净的胶，通常可以膨润状态置于冷室可能对某些酶有抑制作用。洗净的胶，通常可以膨润状态置于冷室中长时间保存。中长时间保存。几种常用脱盐方法的比较胶过滤有三类应用胶过滤有三类应用：

90、 浓缩浓缩已于前一节讨论；已于前一节讨论； 族分族分，主要是脱盐，脱盐也是酶的分离纯化工作常需解决的问题，主要是脱盐，脱盐也是酶的分离纯化工作常需解决的问题，表表4.64.6列举和对比了几种脱盐方法，从中可以看出，胶过滤法在各个方面都列举和对比了几种脱盐方法，从中可以看出，胶过滤法在各个方面都略胜一筹，略胜一筹， 但是，胶过滤法主要的应用还是但是，胶过滤法主要的应用还是分级分离纯化分级分离纯化。胶过滤法特点是胶过滤法特点是： 不受不受pHpH、盐和温度等的影响，操作条件温和、简便，而且勿需特殊的、盐和温度等的影响，操作条件温和、简便，而且勿需特殊的再生处理，适于各种分子的分离。再生处理，适于各

91、种分子的分离。48 3 3筛膜分离法筛膜分离法n 筛膜分离法，即超过滤分离法筛膜分离法，即超过滤分离法(ultrafiltration)(ultrafiltration)，这是利用这是利用微孔超滤膜微孔超滤膜仅能选择性地透过一定大小的分子而仅能选择性地透过一定大小的分子而达到分离目的的一类方法。达到分离目的的一类方法。n 此法操作简单，条件也温和，但是只能达到此法操作简单，条件也温和，但是只能达到粗分粗分的要的要求。求。n 494 4超离心分离法超离心分离法(ultracentrifusion)(ultracentrifusion)n 这是利用样品中大小不同的分子在相对离这是利用样品中大小不同

92、的分子在相对离心力场达心力场达8000080000250000 g250000 g条件下分布不同而条件下分布不同而进行的一种分离纯化方法。进行的一种分离纯化方法。n 但是，此法主要用于病毒、细胞颗粒体等但是，此法主要用于病毒、细胞颗粒体等的制备，对于的制备，对于分子量较小的酶或蛋白质分离效分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳，分辨率不高而且费时果一般不佳，分辨率不高而且费时。（1）离心机的种类和用途）离心机的种类和用途（2）沉降系数）沉降系数 S（3）离心方法的选择）离心方法的选择 差速离心差速离心 密度梯度离心密度梯度离心 等密度离心等密度离心（4）离心条件的确定）离心条件的确定 离心力离

93、心力 离心时间离心时间 离心温度和离心温度和pH值值梯度离心梯度离心密密度度梯梯度度在在离离心心管管内内的的分分布布是是管管底底的密度最大的密度最大,向上逐渐减小向上逐渐减小蔗蔗糖糖便便宜宜，纯纯度度高高，浓浓溶溶液液（60，w/w）密度可达）密度可达1.28g/cm3。聚聚蔗蔗糖糖的的商商品品名名是是Ficoll，它它是是由由蔗蔗糖糖和和1- 氯氯-2,3-环环氧氧丙丙烷烷合合成成的的高聚物，高聚物，Mr 约约400000。 需需要要高高密密度度和和低低渗渗透透压压的的梯梯度度时，可用时，可用Ficoll代替蔗糖。代替蔗糖。三三. . 建立在电学解离性质进行的纯化建立在电学解离性质进行的纯化

94、1、吸附法、吸附法（1）物理吸附法）物理吸附法 （2）羟基磷灰石法）羟基磷灰石法 （3）离子交换吸附法）离子交换吸附法-离子交换色谱法离子交换色谱法2 2 、电泳法电泳法（1 1）区带电泳）区带电泳（2 2）等点聚焦电泳）等点聚焦电泳（3 3）粉末电泳）粉末电泳3 3聚焦层析聚焦层析4.4.快速液相层析快速液相层析5.5.疏水层析疏水层析501 1吸附交换吸附交换( (层析层析)(adsorption)(adsorption)分离法分离法n 这也是最常用的一类纯化方法。原理如图这也是最常用的一类纯化方法。原理如图4.54.5所示，它是利用样品所示，它是利用样品中待纯化分子和杂质分子与吸附剂间的

95、吸附能力与解吸性质不同而建立中待纯化分子和杂质分子与吸附剂间的吸附能力与解吸性质不同而建立的分离纯化方法。这类分离或以静态方式进行，或以层析方式进行。的分离纯化方法。这类分离或以静态方式进行，或以层析方式进行。n 但不管采用什么方式，一般都包括但不管采用什么方式，一般都包括三个基本环节三个基本环节：n加样吸附、加样吸附、n洗涤洗涤n洗脱洗脱n 实际上，其中每一个环节都包含着目的蛋白质实际上，其中每一个环节都包含着目的蛋白质( (或酶或酶) )和杂蛋白的分和杂蛋白的分离，因此是一种十分有效的纯化方法。离，因此是一种十分有效的纯化方法。吸附交换分离法原理示意图 根据吸附机制的不同，吸附剂可分为根据

96、吸附机制的不同，吸附剂可分为三种类型三种类型：“传统传统”物理吸附剂物理吸附剂羟基磷灰石吸附剂羟基磷灰石吸附剂离子交换吸附剂离子交换吸附剂51(1) (1) 物理吸附物理吸附(physical adsorption)(physical adsorption)n 传统的传统的物理吸附物理吸附剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙胶等。剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙胶等。n其中其中白土白土是具有强吸附力的一类粘土，以硅酸铝为主要成分，包括皂是具有强吸附力的一类粘土，以硅酸铝为主要成分，包括皂土、高岭土和活性白土等；土、高岭土和活性白土等；n 氧化铝氧化铝根据制备方法不同有多种成品，用得较多的是根据制备方法

97、不同有多种成品，用得较多的是CrCr胶；胶；n 磷酸钙胶磷酸钙胶可从氧化钙和磷酸三钠直接制备。可从氧化钙和磷酸三钠直接制备。n n 物理吸附的物理吸附的机制机制不很清楚，一般认为它是通过吸附剂分子和样品分不很清楚，一般认为它是通过吸附剂分子和样品分子间的界面子间的界面范德华力范德华力相互作用引起的，因而选择性不强，预见性较小，相互作用引起的，因而选择性不强，预见性较小，往往需要试验才能确定。这类吸附剂应用很早，但没有得到更大的发展，往往需要试验才能确定。这类吸附剂应用很早，但没有得到更大的发展，原因可能也就在于此。原因可能也就在于此。n 52n 物理吸附通常以物理吸附通常以静态静态方式方式进行

98、、吸附剂需要经过预先洗涤和活化进行、吸附剂需要经过预先洗涤和活化处理，然后在低盐浓度、弱酸性或近中性条件下进行吸附，处理，然后在低盐浓度、弱酸性或近中性条件下进行吸附，n 例如，采用例如，采用0.0050.0050.01mol0.01molL L、PH 5.0PH 5.06.56.5的磷酸缓冲液作为的磷酸缓冲液作为吸附介质。在吸附后，如果被吸附的酶不能被水或吸附介质洗脱下来，吸附介质。在吸附后，如果被吸附的酶不能被水或吸附介质洗脱下来，则可将吸附了酶的吸附剂直接分散在水中或上述介质中，进行洗涤以则可将吸附了酶的吸附剂直接分散在水中或上述介质中，进行洗涤以除去杂质。除去杂质。n 物理吸附的酶一般

99、可在物理吸附的酶一般可在弱碱弱碱性条件下，例如用性条件下，例如用pH7.6pH7.6的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液将它洗脱下来；如果此时酶仍不能洗下，那么可用更高离子强度的溶将它洗脱下来；如果此时酶仍不能洗下，那么可用更高离子强度的溶液，液，n 例如，含例如，含3030硫酸铵硫酸铵pH 7.6pH 7.6的磷酸缓冲液。洗脱液量不宜过大，的磷酸缓冲液。洗脱液量不宜过大，最好不超过吸附剂的体积。操作时，通常少量分批式的洗脱比一次洗最好不超过吸附剂的体积。操作时，通常少量分批式的洗脱比一次洗脱效果要好。脱效果要好。n 操作时，为了使纯化的效果好些，可先加适量的吸附剂吸附杂蛋操作时，为了使纯化的效果好些，可

100、先加适量的吸附剂吸附杂蛋白，这种情况下加入的吸附剂白，这种情况下加入的吸附剂( (用量用量) )甚至甚至容许有容许有5 5-l0%-l0%左右的酶损左右的酶损失失。除去这份吸附剂后，再加入一定量新鲜吸附剂吸附酶，此时吸附。除去这份吸附剂后，再加入一定量新鲜吸附剂吸附酶，此时吸附剂用量应该少些，同样也容许在溶液中保留剂用量应该少些，同样也容许在溶液中保留10%10%左右的酶，以免大量左右的酶，以免大量杂蛋白跟着吸附下来。杂蛋白跟着吸附下来。n 物理吸附也可以物理吸附也可以柱层析柱层析方式进行，但是方式进行，但是, ,用凝胶作为吸附剂时，由用凝胶作为吸附剂时，由于它的粒于较柱细，直接用它装柱流速往

101、往太慢。于它的粒于较柱细，直接用它装柱流速往往太慢。n 为此，通常总是以为此，通常总是以1 1份胶加份胶加3 35 5份纤维素粉混匀后装柱，并在适于份纤维素粉混匀后装柱，并在适于吸附的条件进行平衡；待酶吸附后，再以梯度方式或阶梯方式改变缓吸附的条件进行平衡；待酶吸附后，再以梯度方式或阶梯方式改变缓冲液的冲液的pHpH或盐浓度进行洗涤或洗脱。或盐浓度进行洗涤或洗脱。(2) (2) 羟基磷灰石吸附羟基磷灰石吸附n 羟基磷灰石羟基磷灰石(hydroxylapatite,HA)(hydroxylapatite,HA)在在5050年代未年代未开始应用于酶的纯化，但直到开始应用于酶的纯化，但直到19731

102、973年才解决了该年才解决了该吸附剂的吸附剂的高均一高均一、高流速高流速和和高吸附容量高吸附容量的大量制的大量制备，使它的应用日益普及。备，使它的应用日益普及。n 53n 羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；n 在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；洗脱时提高离子强度；n 多采用柱层析方式进行。多采用柱层析方式进行。 (3) (3) 离子交换离子交换(ion exchange)(

103、ion exchange)吸附吸附 利用带电荷的离子交换剂为载体，利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。定条件下洗脱下来。 54又叫离子交换色谱法又叫离子交换色谱法n 这类吸附是通过蛋白质的解离基团与这类吸附是通过蛋白质的解离基团与离子交换剂的解离基团之间的相互作用离子交换剂的解离基团之间的相互作用完成的。由于各种蛋白质和离子交换剂完成的。由于各种蛋白质和离子交换剂在不同条件下有相应不同的解离状态，在不同条件下有相应不同的解离状态，因此选择适当的交换剂、控制交换和洗因此选择适当的交换剂、控制交换和洗脱条件，就可能将酶

104、和杂蛋白分离开来。脱条件，就可能将酶和杂蛋白分离开来。n 离子交换剂包括两个部分：离子交换剂包括两个部分：n 母体（高分子支持介质）和离子交母体（高分子支持介质）和离子交换基（功能基团）。换基（功能基团）。n 作为母体的有：树脂、纤维素和凝胶作为母体的有：树脂、纤维素和凝胶等。等。n 离子交换树脂离子交换树脂 离子交换树脂是以离子交换树脂是以聚苯乙烯树脂聚苯乙烯树脂等为母体，再导等为母体，再导入相应的解离基团而成，具有疏水的基本骨架，易导入相应的解离基团而成，具有疏水的基本骨架，易导致蛋白变性，交换容量也低，一般只有以羟基为解离致蛋白变性，交换容量也低，一般只有以羟基为解离基团的弱酸性树脂，如

105、基团的弱酸性树脂，如 Amberlite IRC-50 Amberlite IRC-50、国产的、国产的724724树脂等用于某些碱性蛋白的纯化。树脂等用于某些碱性蛋白的纯化。 个别对酸碱较稳定的酶也曾用强酸型或强碱型的个别对酸碱较稳定的酶也曾用强酸型或强碱型的交换树脂，但很少。交换树脂，但很少。 近年来近年来大孔型交换树脂大孔型交换树脂出现，应用面可能扩大。出现，应用面可能扩大。离子交换纤维素离子交换纤维素 离子交换纤维素离子交换纤维素是目前酶的纯化工作中用得较多的交是目前酶的纯化工作中用得较多的交换剂，它是以亲水的纤维素为母体，引入相应的交换基团换剂，它是以亲水的纤维素为母体，引入相应的交

106、换基团后制成的。后制成的。交换容量较大交换容量较大( (一般一般0.20.21.0 1.0 毫克当量克干毫克当量克干胶胶) )，交换速度也较高交换速度也较高； 缺点缺点是易随交换介质的是易随交换介质的pHpH、离子强度改变而发生膨胀、离子强度改变而发生膨胀、收缩，同时粒子较细收缩，同时粒子较细, ,柱层析时流速小。柱层析时流速小。 离子交换凝胶离子交换凝胶 离子交换凝胶以葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为母体，离子交换凝胶以葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为母体，导入相应的交换基团后制成。导入相应的交换基团后制成。 它的应用日益增多，交换容量较交换纤维素还要它的应用日益增多，交换容量较交换纤维素还要大大(2.5(

107、2.54.5 4.5 毫克当量克干胶毫克当量克干胶) )，同时具有，同时具有分子筛分子筛的的作用；和纤维素一样，作用；和纤维素一样， 缺点缺点也是易随缓冲液也是易随缓冲液pHpH和离子强度的不同而改变其和离子强度的不同而改变其交换容量、容积和流速。交换容量、容积和流速。 Sepharose CL Sepharose CL、Bio-Gel Bio-Gel 无此缺点，而且有较无此缺点，而且有较均一的大均一的大小。小。离子交换层析过程：离子交换层析过程：离子交换剂的预处理离子交换剂的预处理平衡平衡装柱装柱加样吸附加样吸附洗脱洗脱洗脱液收集与相应检测洗脱液收集与相应检测离子交换剂的再生离子交换剂的再生

108、离子交换剂应满足下列要求：离子交换剂应满足下列要求：n（1）有高度的不溶性有高度的不溶性，即在各种溶剂中进行，即在各种溶剂中进行交换时，交换剂不发生溶解交换时，交换剂不发生溶解n（2）有疏松的多孔结构或巨大的表面积有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换n（3）有较多的交换基团有较多的交换基团n（4）有稳定的物理化学性质有稳定的物理化学性质，在使用过程中，在使用过程中，交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。解和变形等现象。n离子交换剂的离子交换剂的3 3种类型种类

109、型根据高分子支持介质的性质根据高分子支持介质的性质离子交换树脂离子交换树脂离子交换纤维素离子交换纤维素离子交换球型多糖离子交换球型多糖( (如葡聚糖凝胶如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等和琼脂糖凝胶等) )。 离子交换基是交换剂表现功能的基础，它的性质决定着离子交换基是交换剂表现功能的基础，它的性质决定着交换剂的类型与强弱。带阳电荷解离基的交换剂在离子交换交换剂的类型与强弱。带阳电荷解离基的交换剂在离子交换过程中能吸附荷阴电的离子，故称为过程中能吸附荷阴电的离子，故称为阴离子交换剂阴离子交换剂；反之，；反之，带阴电荷解离基的交换剂可对付荷阳电的离子，称为带阴电荷解离基的交换剂可对付荷阳电的离子，称为阳

110、离子阳离子交换剂交换剂。常用的交换基如表所示。常用的交换基如表所示。55进行离子交换吸附时，应考虑以下因素：进行离子交换吸附时，应考虑以下因素：n选择适当的离子交换剂选择适当的离子交换剂n第一，究竞选择阳离子交换剂、还是选择阴离子交换剂第一，究竞选择阳离子交换剂、还是选择阴离子交换剂? ?n 一般一般规律规律是：是：na a如果目的酶在低于其如果目的酶在低于其PI(PI(等电点等电点) )的的pHpH条件下稳定，可选用条件下稳定，可选用阳离子交换剂；阳离子交换剂；nb b如果目的酶在高于其如果目的酶在高于其PIPI的的pHpH条件下稳定，宜采用阴离子交条件下稳定，宜采用阴离子交换剂；换剂；nc

111、 c如果目的酶在高于和低于其如果目的酶在高于和低于其pIpI的的pHpH条件下都稳定，那么两条件下都稳定，那么两种交换剂都可。种交换剂都可。56第二，究竞选择强型交换剂，还是弱型交第二，究竞选择强型交换剂，还是弱型交换剂换剂? ?n一般规律是：一般规律是：na a如果目的酶既可应用强型交换剂，也可以应用弱型，如果目的酶既可应用强型交换剂，也可以应用弱型，那么应优先考虑选弱型。那么应优先考虑选弱型。nb b如果目的酶如果目的酶pIpI偏向极端偏向极端pH(6pH(9)9)，则一般应考虑，则一般应考虑强型交换剂因强型交换基能在广泛的强型交换剂因强型交换基能在广泛的pHpH范围内保持范围内保持完全解

112、离状态，而弱型交换基的解离程度及相关的交完全解离状态，而弱型交换基的解离程度及相关的交换容量，因换容量，因pHpH条件而显著不同；弱型的阳离子交换剂条件而显著不同；弱型的阳离子交换剂在在pH6pH 9pH 9时不带电荷，时不带电荷，失去交换能力。失去交换能力。第三：交换容量第三：交换容量n n 交换容量有两方面的交换容量有两方面的含义含义：一为总交换容量；一为实效：一为总交换容量；一为实效交换容量。前者是指交换容量。前者是指每克干离子交换剂上带有的总交换基数每克干离子交换剂上带有的总交换基数，其中包括潜在的交换基；后者是指其中包括潜在的交换基；后者是指特定的实验条件下实际可特定的实验条件下实际

113、可用于交换的交换基数用于交换的交换基数。n 实效交换容量和介质的实效交换容量和介质的pHpH、离子与离子强度、以及温度、离子与离子强度、以及温度等密切相关，也因目的蛋白质分子或酶分子的大小而显著不等密切相关，也因目的蛋白质分子或酶分子的大小而显著不同。一般地说，同。一般地说，离子交换纤维素交换容量小于凝胶离子交换纤维素交换容量小于凝胶。 57第四：流速第四：流速n 纤维素柱的流速一胶低于凝胶，而凝胶中又以为纤维素柱的流速一胶低于凝胶，而凝胶中又以为Sephadex A-25Sephadex A-25或或G-25G-25者为好者为好,Sepharose,Sepharose交换剂兼有高交换剂兼有高

114、流速和高交换容量的流速和高交换容量的优点优点。交换剂的处理交换剂的处理n 离子交换剂在使用前都必须进行预处理，以除去各种离子交换剂在使用前都必须进行预处理，以除去各种可溶性杂质，并将交换基团变成适当的交换型：新交换剂可溶性杂质，并将交换基团变成适当的交换型：新交换剂应先在蒸馏水中充分搅拌膨润，然后，再用酸、碱反复处应先在蒸馏水中充分搅拌膨润，然后，再用酸、碱反复处理。理。 n 离子交换吸附或以静态方式，或以柱层析方式进行，离子交换吸附或以静态方式，或以柱层析方式进行，不过一般多用后一种方式，不管用什么方式，吸附前，预不过一般多用后一种方式，不管用什么方式，吸附前，预处理好的交换剂一定要用扩展缓

115、冲液充分平衡。处理好的交换剂一定要用扩展缓冲液充分平衡。n 平衡的目的平衡的目的是要使整个系统保持恒定的是要使整个系统保持恒定的pHpH和离子强度。和离子强度。 58 离子交换吸附法在应用上是目前仅次于盐析的一种纯化离子交换吸附法在应用上是目前仅次于盐析的一种纯化方法方法。它的适用面广，几乎所有的蛋白都可用此法分离；其。它的适用面广，几乎所有的蛋白都可用此法分离；其次，它具有很高的分辨率。次，它具有很高的分辨率。59离子交换吸附层析离子交换吸附层析 离子交换柱层析所用的柱床高度可比胶过滤小些，一离子交换柱层析所用的柱床高度可比胶过滤小些，一般的分离般的分离20 cm20 cm已足，较复杂的样品

116、可以稍长些。已足，较复杂的样品可以稍长些。2 2电泳分离法电泳分离法n 这是根据各种蛋白质在解离、电学性质上的差异，利用它们在电场这是根据各种蛋白质在解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化的一类方法。荷电物质在电中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化的一类方法。荷电物质在电场中的场中的迁移速度迁移速度( (或泳动率或泳动率) )符合下述规律：符合下述规律：n n 为迁移速度，为迁移速度，O O为荷电物质所带的净电荷，为荷电物质所带的净电荷，y y为分子半径，为分子半径，为介为介质粘度。因此，电泳分离法除了取决于目的物质酌解离电学性质与分子质粘度。因此，电泳

117、分离法除了取决于目的物质酌解离电学性质与分子大小以外，也和电泳介质的大小以外，也和电泳介质的pHpH、离子和离子强度、离子和离子强度( (最适离子强度为最适离子强度为0.020.020.2)0.2)等有密切关系。等有密切关系。60 电泳方法可以达到很高的分辨效果，但在实验放大和样品回收方面电泳方法可以达到很高的分辨效果，但在实验放大和样品回收方面电泳方法可以达到很高的分辨效果，但在实验放大和样品回收方面电泳方法可以达到很高的分辨效果，但在实验放大和样品回收方面有一定困难，因此目前有一定困难，因此目前有一定困难，因此目前有一定困难，因此目前主要用于蛋白质的分析和小规模制备主要用于蛋白质的分析和小

118、规模制备主要用于蛋白质的分析和小规模制备主要用于蛋白质的分析和小规模制备。常用的电泳可大体分为以下几种类型常用的电泳可大体分为以下几种类型n (1) (1)自由界面电泳自由界面电泳(free electrophoresis)(free electrophoresis)n 这是这是TiseliusTiselius最早发明的、在胶体溶液与溶剂最早发明的、在胶体溶液与溶剂间形成界面的一种电泳，但是需要复杂的设备，故间形成界面的一种电泳，但是需要复杂的设备，故现在仅用于纯酶的均一性鉴定。现在仅用于纯酶的均一性鉴定。n (2) (2)区带电泳区带电泳(zone electrophoresis)(zone

119、 electrophoresis)n 这是在惰性支持物上进行的一类电泳分离、分这是在惰性支持物上进行的一类电泳分离、分析法。和前一类电泳相比，它具有简便灵活，无对析法。和前一类电泳相比，它具有简便灵活，无对流扩散，因而可达到完全分离的优点。流扩散，因而可达到完全分离的优点。n n 63(2)(2)区带电泳区带电泳n膜电泳膜电泳n 最简单的区带电泳是膜电泳最简单的区带电泳是膜电泳，以滤纸、醋酸纤维，以滤纸、醋酸纤维素薄膜等为支持物，简易快速，但分离量很低，只能素薄膜等为支持物，简易快速，但分离量很低，只能用于蛋白质分析。用于蛋白质分析。n 它的一种衍生形式称为它的一种衍生形式称为连续电泳连续电泳

120、，可用来进行小，可用来进行小规模分离，只要保持恒定的液流速度与电压就能达到规模分离，只要保持恒定的液流速度与电压就能达到稳定的分离效果。稳定的分离效果。粉末电泳粉末电泳 第二种区带电泳是粉末电泳常用的支持物为淀粉、纤第二种区带电泳是粉末电泳常用的支持物为淀粉、纤维素。维素。 淀粉通常做成糊状在淀粉通常做成糊状在水平槽水平槽中进行电泳，然后染色定带，中进行电泳，然后染色定带，最后切下相应的区带，洗脱回收。最后切下相应的区带，洗脱回收。 纤维粉则往往装柱进行纤维粉则往往装柱进行垂直电泳垂直电泳，电泳完毕后再以取代，电泳完毕后再以取代方式连续洗下各成分。方式连续洗下各成分。 粉末电泳有一定的分辨率和

121、分离量，但是上述支持物都粉末电泳有一定的分辨率和分离量，但是上述支持物都有不同程度的可溶性，因而常给酶的回收带来麻烦；同时它有不同程度的可溶性，因而常给酶的回收带来麻烦；同时它们还有一定程度的电渗性，也会降低电泳分离效果。们还有一定程度的电渗性，也会降低电泳分离效果。 近年来有人企图用聚乙烯氯与近年来有人企图用聚乙烯氯与SephadexSephadex分别取代淀粉和分别取代淀粉和纤维素。纤维素。 胶电泳胶电泳(gel electrophoresis)(gel electrophoresis) 这种电泳兼具这种电泳兼具分子筛分子筛效应，因而可达到很高的分效应，因而可达到很高的分辨率。辨率。 常用

122、的有聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的有聚丙烯酰胺凝胶电泳(plyacrylamide (plyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，PAGE)PAGE)。 聚丙烯酰胺胶电泳常以聚丙烯酰胺胶电泳常以不连续不连续方式进行，也就是电方式进行，也就是电泳的胶与缓冲系统都具有不连续性。泳的胶与缓冲系统都具有不连续性。不连续电泳示意图不连续电泳示意图discdisc电泳的突出优点电泳的突出优点n 具有极高的具有极高的灵敏度灵敏度和和分辨率分辨率，因此，是一种十分，因此，是一种十分理想的蛋白质分析方法。理想的蛋白质分析方法。n 但是，在但是，在disdi

123、s电泳中，蛋白质的迁移率由多种因素电泳中，蛋白质的迁移率由多种因素决定，如蛋白质的静电荷、大小、分子形状等。决定，如蛋白质的静电荷、大小、分子形状等。n 为了进一步提高这种电泳的分辨率，又发展了为了进一步提高这种电泳的分辨率，又发展了SDS-SDS-聚丙烯酰胺胶电泳聚丙烯酰胺胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)等。等。SDS(SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠) ) SDS( SDS(十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠) )是一种是一种阴离子去垢剂阴离子去垢剂，它能与蛋，它能与蛋白质结合，破坏蛋白质分子内部和分子间以及与其他物质白质结合，破坏蛋白质分子内部和分子间以及与其他物质间的次级键

124、联系，使间的次级键联系，使蛋白变性蛋白变性； 由于通常由于通常每克蛋白质约能结合每克蛋白质约能结合1.41.4克克SDSSDS，从而使蛋白质，从而使蛋白质所带的负电荷远超过蛋白质原有电荷数，这样就消除不同所带的负电荷远超过蛋白质原有电荷数，这样就消除不同蛋白原有的电荷差异；再加上结合了蛋白原有的电荷差异；再加上结合了SDSSDS的蛋白质都是椭圆的蛋白质都是椭圆状，没有大的形状差异，因此，蛋白质电泳迁移率状，没有大的形状差异，因此，蛋白质电泳迁移率仅取决仅取决于蛋白质的于蛋白质的分子量分子量。 所以，所以，SDS-SDS-聚丙烯酰胺胶电泳能用于，而且主要用于聚丙烯酰胺胶电泳能用于，而且主要用于蛋

125、白质的纯度分析和分子量测定。蛋白质的纯度分析和分子量测定。64(3) (3) 等电聚焦电泳等电聚焦电泳( (isoelectric focusing) 这是利用两性电解质载体这是利用两性电解质载体( (商品称为商品称为Ampholine)Ampholine)，在电，在电场作用下能形成连续平滑的场作用下能形成连续平滑的pHpH梯度，而待分离样品中各组梯度，而待分离样品中各组分在电泳过程中，又能按照各自的等电点聚焦到相应的分在电泳过程中，又能按照各自的等电点聚焦到相应的pHpH梯度位置上从而达到分离目的的一类方法。梯度位置上从而达到分离目的的一类方法。 等电聚焦的等电聚焦的第二个发展第二个发展是和

126、胶电泳相结合，即以聚丙是和胶电泳相结合，即以聚丙烯酰胺胶或葡聚糖胶作为支持物进行聚焦胶电泳。其优点烯酰胺胶或葡聚糖胶作为支持物进行聚焦胶电泳。其优点是分离量可以增大，而且简便快速，缺点是纯化组分的回是分离量可以增大，而且简便快速，缺点是纯化组分的回收率较为费事。这种方法的另一发展是进行所谓区带对流收率较为费事。这种方法的另一发展是进行所谓区带对流聚焦电泳。聚焦电泳。 等电聚焦电泳的等电聚焦电泳的第三个发展第三个发展则是和层析技术相结合形则是和层析技术相结合形成聚焦层析。成聚焦层析。653 3聚焦层析聚焦层析( (chromatofocusingchromatofocusing)n 聚焦层析是根

127、据蛋白质的等电点差别进行层析分离的聚焦层析是根据蛋白质的等电点差别进行层析分离的纯化方法；它不需要特殊的聚焦电泳装置，却兼具等电聚纯化方法；它不需要特殊的聚焦电泳装置，却兼具等电聚焦电泳的高分辨率和柱层析的简便性两种优点。焦电泳的高分辨率和柱层析的简便性两种优点。 n 聚焦层析的聚焦层析的原理原理是：当用特种的多缓冲液滴定和淋洗是：当用特种的多缓冲液滴定和淋洗填装在层析柱中的特种多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液填装在层析柱中的特种多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，就会在层析柱中自上而下地建立起连续的的扩展，就会在层析柱中自上而下地建立起连续的pHpH梯度；梯度；将待纯化样品加入该层析柱，其中

128、的蛋白质组分就将随多将待纯化样品加入该层析柱，其中的蛋白质组分就将随多缓冲液的扩展按各自的等电点聚焦于相应的缓冲液的扩展按各自的等电点聚焦于相应的pHpH区段，并随区段，并随扩展过程中扩展过程中pHpH梯度的逐渐下移而下降，最后分别从层析柱梯度的逐渐下移而下降，最后分别从层析柱先后流出，达到分离纯化的目的。先后流出，达到分离纯化的目的。664 4快速液相层析快速液相层析( (fast-flow liquid fast-flow liquid chromatoraphy,FPLC)chromatoraphy,FPLC)n 这也是一种离子交换层析，它的这也是一种离子交换层析，它的特点特点是：是：n

129、 所用的离子交换剂是所用的离子交换剂是单扩散型单扩散型的，有大的孔径的，有大的孔径, ,排排阻相对分子量达到阻相对分子量达到10107 7；高的结合能力和小的非专一吸；高的结合能力和小的非专一吸附；颗粒的大小均一，预装柱中约有附；颗粒的大小均一，预装柱中约有4040的空体积，的空体积，因此有较低的回压和快的流速，是一般离子交换层析因此有较低的回压和快的流速，是一般离子交换层析的的2525100100倍；稀释度小，洗脱峰的蛋白浓度是普通离倍；稀释度小，洗脱峰的蛋白浓度是普通离子交换的子交换的1010倍左右倍左右。675 5疏水层析疏水层析( (hydropholichydropholic chr

130、omatography)n 根据目的酶和杂蛋白在解离电学性质上的差别，根据目的酶和杂蛋白在解离电学性质上的差别，开发了吸附分离法、电泳法和聚焦层析法。基于蛋白开发了吸附分离法、电泳法和聚焦层析法。基于蛋白质在水溶液中总有一定比例的表面残基是非极性的，质在水溶液中总有一定比例的表面残基是非极性的，例如，有人观察到，在例如，有人观察到，在1313种随机选择的蛋白质中就有种随机选择的蛋白质中就有1111种可以吸附到带有疏水基的琼脂糖吸附剂上，人们种可以吸附到带有疏水基的琼脂糖吸附剂上，人们于是发展了疏水层析法。于是发展了疏水层析法。n 疏水层析的基础疏水层析的基础是疏水基间的是疏水基间的非极性作用非

131、极性作用，这种，这种作用力随温度、盐离子作用力随温度、盐离子( (如硫酸铵、磷酸钠如硫酸铵、磷酸钠) )及其浓度及其浓度而改变，而改变，盐析层析也可认为是疏水层析盐析层析也可认为是疏水层析。68四、利用专一亲和作用进行的纯化四、利用专一亲和作用进行的纯化n 亲和层析法是根据生物亲和层析法是根据生物分子间某种特有的亲和力分子间某种特有的亲和力而建立的一种纯化而建立的一种纯化方法。方法。n 例如，酶和它的底物例如，酶和它的底物( (包括辅助因子包括辅助因子) )、底物类似物或竞争性抑制、底物类似物或竞争性抑制剂等剂等( (通称为配基，通称为配基，Ligand)Ligand)通常都具有较高的生物亲和

132、力，能专一而可通常都具有较高的生物亲和力，能专一而可逆地形成酶逆地形成酶- -配基络合物。配基络合物。n 因此，如果将这类配基偶联固定于载体作成亲和层析吸附剂，那么，因此，如果将这类配基偶联固定于载体作成亲和层析吸附剂，那么，在将它和含有待纯化酶的样品混合时，它就能迅速而有选择性地将相应在将它和含有待纯化酶的样品混合时，它就能迅速而有选择性地将相应的酶分子从溶液中的酶分子从溶液中“抓抓”出来，达到和其他杂蛋白分离的目的，这就是出来，达到和其他杂蛋白分离的目的，这就是亲和吸附。亲和吸附。n 如果再设法洗涤除去吸附过程中非专一附着的杂质，则又可得到一如果再设法洗涤除去吸附过程中非专一附着的杂质，则

133、又可得到一次纯化。最后还可用亲和力更强的配基，或促进层析系统的解吸条件选次纯化。最后还可用亲和力更强的配基，或促进层析系统的解吸条件选择地将酶从亲和吸附剂上择地将酶从亲和吸附剂上“拉下来拉下来”，进行亲和洗脱，这样又可得到一，进行亲和洗脱，这样又可得到一次纯化，故而分辨率很高。次纯化，故而分辨率很高。69n1 1亲和层析法亲和层析法亲和分离原理示意图亲和分离原理示意图70(1) (1) 载体载体n 首先首先必须是必须是亲水的亲水的，而且必须结构疏松，便于待纯化，而且必须结构疏松，便于待纯化分子自由地与配基接触；分子自由地与配基接触；n 其次其次必须具有大量可以和配基进行偶联反应的基团；必须具有

134、大量可以和配基进行偶联反应的基团；n 第三第三最好是惰性的，不和杂蛋白分子产生非专一吸附，最好是惰性的，不和杂蛋白分子产生非专一吸附，n 同时同时还要经得起偶联、吸附、洗脱等过程各种还要经得起偶联、吸附、洗脱等过程各种pHpH、离、离子强度、温度变化的考验，子强度、温度变化的考验，n 甚至甚至经得起变性剂如脲、盐酸胍等的反复处理，并在经得起变性剂如脲、盐酸胍等的反复处理，并在装柱后有良好的流体力学性质。装柱后有良好的流体力学性质。71n 要求要求：一种适宜的载体：一种适宜的载体琼脂糖琼脂糖n 琼脂糖，它无论在亲水性、反应性能以及机械强琼脂糖，它无论在亲水性、反应性能以及机械强度等各个方面都比较

135、理想，并经得起度等各个方面都比较理想，并经得起0.1mol0.1molL L 酸、酸、碱，碱，7 mol7 molL L 脲等较长时间的处理；脲等较长时间的处理；n 更重要的还在于其结构疏松、能让相对分子质量更重要的还在于其结构疏松、能让相对分子质量达百万的大分子也能自由通过、而且极少非专一性吸达百万的大分子也能自由通过、而且极少非专一性吸附。在酶的分离中用得最多的是琼脂糖附。在酶的分离中用得最多的是琼脂糖4B4B，和葡聚糖，和葡聚糖一样，它的偶联基团是羟基。一样，它的偶联基团是羟基。(2) (2) 配基配基n 亲和层析不限于酶的纯化，也可用于抗原与抗体、亲和层析不限于酶的纯化，也可用于抗原与

136、抗体、核酸以及糖蛋白等的分离，因此所对应的配基也各核酸以及糖蛋白等的分离，因此所对应的配基也各种各样。表为亲和层析中某些可用的配基物质。种各样。表为亲和层析中某些可用的配基物质。72亲和层析中常用作配基的物质亲和层析中常用作配基的物质732 2亲和电泳法亲和电泳法n 亲和电泳法是将亲和层析与聚丙烯酰胺凝胶电泳结合亲和电泳法是将亲和层析与聚丙烯酰胺凝胶电泳结合在一起进行的高分子分离方法。在一起进行的高分子分离方法。n 它的它的原理原理是，当相应的亲和配基共价偶联于电泳胶上是，当相应的亲和配基共价偶联于电泳胶上以后，待分离分析的成分将与配基发生亲和作用，在电泳以后，待分离分析的成分将与配基发生亲和

137、作用，在电泳过程中不移动，而其他成分将按各自的电泳淌度而分离开过程中不移动，而其他成分将按各自的电泳淌度而分离开来。进行亲和电泳时需要制备由来。进行亲和电泳时需要制备由三部分三部分组成的聚丙烯酰胺组成的聚丙烯酰胺胶：胶：n 74(1)(1)浓缩成层胶，由厚度约浓缩成层胶，由厚度约5mm5mm的大孔胶组成，它的作用的大孔胶组成，它的作用和圆盘电泳一样，能将样品浓缩成狭窄的薄层。和圆盘电泳一样，能将样品浓缩成狭窄的薄层。(2)(2)亲和胶，由共价偶联了亲和配基的胶构成，也是约亲和胶，由共价偶联了亲和配基的胶构成，也是约5mm5mm的大孔胶。的大孔胶。(3)(3)分离胶，由不带配基的小孔胶组成，长约

138、分离胶，由不带配基的小孔胶组成，长约5 56cm6cm。 电泳方法及程序和圆盘电泳相似。电泳方法及程序和圆盘电泳相似。 亲和电泳法的分离量很小，主要用于分析，特别亲和电泳法的分离量很小，主要用于分析，特别是用于进行解离常数的测定。是用于进行解离常数的测定。3 3融合蛋白亲和分离法融合蛋白亲和分离法(fusion purification(fusion purification)n 亲和分离法专一、简使快速，它同样也可应用于重组亲和分离法专一、简使快速，它同样也可应用于重组DNADNA表达产物的纯化，这就是融合蛋白亲和分离法，也称表达产物的纯化，这就是融合蛋白亲和分离法，也称“Biosepara

139、tionBioseparation”。这种方法的关键是在构建融合基因。这种方法的关键是在构建融合基因时，目的基因的时，目的基因的5-5-端或端或3-3-端要添加一段编码持殊多肽端要添加一段编码持殊多肽或蛋白质的或蛋白质的DNADNA，使其表达产物带上一段纯化用的特殊标，使其表达产物带上一段纯化用的特殊标签签(purification tap)(purification tap)或亲和标签或亲和标签(affinity tap(affinity tap或或 tail)tail)，通过标签和相应配基的相互作用，从而达到纯化，通过标签和相应配基的相互作用，从而达到纯化的目的。的目的。754 4其他相关

140、的亲和分离法其他相关的亲和分离法n除了上述典型的亲和分离法外，还有一些相关或相似的方除了上述典型的亲和分离法外，还有一些相关或相似的方法。法。n (1) (1)金属螯合层析金属螯合层析(chelate chromatography)(chelate chromatography)n 这是基于某些蛋白对重金属离子具有亲和性而发展起这是基于某些蛋白对重金属离子具有亲和性而发展起来的一种方法，主要用于含咪唑基和巯基蛋白质的分离纯来的一种方法，主要用于含咪唑基和巯基蛋白质的分离纯化。常用金属离子的吸附能力大致有如下顺序：化。常用金属离子的吸附能力大致有如下顺序：CuCu2+2+ZnZn2+2+NiNi

141、2+2+MnMn2+2+。咪唑基和巯基在中性条件如。咪唑基和巯基在中性条件如pH 6pH 68 8时，能与它们形成相当稳定的络合物；但是，在碱性时，能与它们形成相当稳定的络合物；但是，在碱性pHpH中，中，其他氨基酸侧链也能与之反应，因而降低亲和专一性。其他氨基酸侧链也能与之反应，因而降低亲和专一性。n 醋酸盐和磷酸缓冲液有利于吸附，而胺、醋酸盐和磷酸缓冲液有利于吸附，而胺、EDTAEDTA等螯合等螯合剂则常用于洗脱。剂则常用于洗脱。n 76(2)(2)共价层析法共价层析法(covalent chromatgraphy)(covalent chromatgraphy) 这种方法的原理是：待分离

142、的分子在一定条件下这种方法的原理是：待分离的分子在一定条件下能和配基形成可能和配基形成可“逆转逆转”的共价结合。的共价结合。 该方法该方法适用于适用于含含巯基的蛋白质或酶巯基的蛋白质或酶，因为它们能，因为它们能和活化的巯基化载体发生疏基和活化的巯基化载体发生疏基- -二硫基交换反应二硫基交换反应(thiol-(thiol-disulfide interchange reaction)disulfide interchange reaction)，并能通过加入小分子，并能通过加入小分子巯基化合物如巯基化合物如DTTDTT和和2-2-巯基乙醇还原为二硫键而使结合巯基乙醇还原为二硫键而使结合的酶或蛋

143、白质的酶或蛋白质“逆转逆转”释放。释放。五、高效液相层析五、高效液相层析n 高效液相层析高效液相层析( (high performance liquid chromatographyhigh performance liquid chromatography, , HPLC)HPLC)又称高压液相层析又称高压液相层析(high pressure liquid chromatography(high pressure liquid chromatography),),它是近年来层析技术上的一大进展。此法它是近年来层析技术上的一大进展。此法最初最初用于用于非水溶剂非水溶剂中小分子有机化合物的分离中

144、小分子有机化合物的分离，但很快地发展到用于水溶性生，但很快地发展到用于水溶性生物分子的分离；大孔径载体的开发，使它又成了蛋白质和核物分子的分离；大孔径载体的开发，使它又成了蛋白质和核酸纯化的有力工具。酸纯化的有力工具。n HPLCHPLC实际上是胶过滤、离子交换层析、疏水层析和亲和实际上是胶过滤、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等技术应用上的一个发展新阶段层析等技术应用上的一个发展新阶段，它一方面以这些层析，它一方面以这些层析的原理为基础，但是有更高的效率、更高的分辨与更快的速的原理为基础，但是有更高的效率、更高的分辨与更快的速度。度。77六、根据稳定性差别建立的纯化六、根据稳定性差别建立的纯

145、化n 酶的活性以酶分子具有特定活性构象为基础，因酶的活性以酶分子具有特定活性构象为基础，因此在分离纯化过程中一般应避免使用过于此在分离纯化过程中一般应避免使用过于激烈激烈的方法的方法与条件以防止酶的与条件以防止酶的变性变性、失效失效。n 选择性变性法是根据酶和杂蛋白在某种条件下稳选择性变性法是根据酶和杂蛋白在某种条件下稳定性的差别，而采取的一类可一举除去大量杂蛋白的定性的差别，而采取的一类可一举除去大量杂蛋白的简便纯化方法。简便纯化方法。78方法方法n 1 1选择性热变性选择性热变性(selective heat denaturation)(selective heat denaturatio

146、n)n 2 2选择性酸碱变性法选择性酸碱变性法n 3 3表面变性法表面变性法791 1选择性热变性选择性热变性(selective heat denaturation)(selective heat denaturation)n 如果待分离的如果待分离的酶相当耐热酶相当耐热，就可采用这一方法，即在，就可采用这一方法，即在严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到某一温度严格控制的条件下，将酶溶液迅速升温到某一温度( (如如6565)，并保温一定时间，并保温一定时间( (如如10 min)10 min)，而后迅速冷却，这，而后迅速冷却，这样，大量不耐热的杂蛋白就将变性析出，离心除去后，酶样，大量不耐热

147、的杂蛋白就将变性析出，离心除去后，酶的比活力可能大大上升，而总活力损失可很少损失，或者的比活力可能大大上升，而总活力损失可很少损失，或者根本不损失，有时还可能有所提高。根本不损失，有时还可能有所提高。n 例如，从酵母中分离醇脱氢酶，就可采用热变性处理例如，从酵母中分离醇脱氢酶，就可采用热变性处理法。个别酶对热特别稳定，如胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、法。个别酶对热特别稳定，如胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶等在酸性条件下甚至可加热到溶菌酶等在酸性条件下甚至可加热到9090而不破坏，这一而不破坏，这一方法则更为有利。方法则更为有利。80 为了使选择性热变性法有更大的适用范围，可在为了使选择性热变性法有更

148、大的适用范围，可在酶溶液进行热处理前，加入该酶的底物、辅酶、竞争酶溶液进行热处理前，加入该酶的底物、辅酶、竞争性抑制剂、保护巯基的还原剂，也可加除去金属的螯性抑制剂、保护巯基的还原剂，也可加除去金属的螯合剂等，以增大酶和杂蛋白间的耐热性差别，例如，合剂等，以增大酶和杂蛋白间的耐热性差别，例如，D-D-氨基酸氧化酶在抑制剂存在时，耐热性会显著上升。氨基酸氧化酶在抑制剂存在时，耐热性会显著上升。 在应用选择性热变性方法时，应该注意严格控制在应用选择性热变性方法时，应该注意严格控制溶液的溶液的pHpH和保温时间。在样品溶液有蛋白酶污染的情和保温时间。在样品溶液有蛋白酶污染的情况下，应用此法应特别谨慎

149、。况下，应用此法应特别谨慎。2 2选择性酸碱变性法选择性酸碱变性法n 如果在一定温度下，将酶溶液严格控制在酶的稳定如果在一定温度下，将酶溶液严格控制在酶的稳定pHpH范围内，应用酸、碱处理一定时间，进行选择性变性，范围内，应用酸、碱处理一定时间，进行选择性变性，同样可达到有效的纯化。但条件控制十分重要。同样可达到有效的纯化。但条件控制十分重要。 n 例如，从麦芽中分离例如，从麦芽中分离-淀粉酶，在淀粉酶，在pH 3pH 3时，只有时，只有-淀粉酶失效，但是，在淀粉酶失效，但是，在pH3pH3以下，则两种淀粉酶都会失效。以下，则两种淀粉酶都会失效。n 又如，细胞色素又如，细胞色素c c用用2.5

150、2.5的三氯乙酸处理，可使大量的三氯乙酸处理，可使大量杂蛋白沉淀，但是这种处理如果时间太长，细胞色素也杂蛋白沉淀，但是这种处理如果时间太长，细胞色素也会变性。会变性。n 和和选择性热变性相比，酸碱变性应用得不多选择性热变性相比，酸碱变性应用得不多，主要，主要原原因因可能在于操作较为复杂，而且纯化效果较差。可能在于操作较为复杂，而且纯化效果较差。81 3 3表面变性法表面变性法n 很早就有人利用酶溶液和惰性液体很早就有人利用酶溶液和惰性液体( (氯仿氯仿) )混合振荡，造成选择性表面混合振荡，造成选择性表面变性来制备过氧化氢酶、醇脱氢酶和变性来制备过氧化氢酶、醇脱氢酶和-淀粉酶等。淀粉酶等。n

151、振荡处理后通常振荡处理后通常分成三层分成三层；上层为未变性蛋白，第二层为乳浊状变性上层为未变性蛋白，第二层为乳浊状变性蛋白，下层为氯仿蛋白，下层为氯仿。n 这种处理时间通常不宜过长，否则将导致所有蛋白质变性。这种处理时间通常不宜过长，否则将导致所有蛋白质变性。n 利用利用泡沫形成泡沫形成也可达到选择性表面变性的目的，例如，通氯气到磷酸也可达到选择性表面变性的目的，例如，通氯气到磷酸核糖变位酶和核苷磷酸化酶的溶液中，可使变位酶表面变性而纯化磷酸化核糖变位酶和核苷磷酸化酶的溶液中，可使变位酶表面变性而纯化磷酸化酶。酶。n 以后又有人设计了一种以后又有人设计了一种表面变性泡沫分离器表面变性泡沫分离器

152、用于回收有效成分进行酶用于回收有效成分进行酶的纯化，例如，从发酵液中提取链激酶，在的纯化，例如，从发酵液中提取链激酶，在pH5.7pH5.7的条件下，该酶的回收的条件下，该酶的回收率可达率可达8080。n 82n 应用表面变性法时须控制的因素很多，除了泡沫大应用表面变性法时须控制的因素很多，除了泡沫大小以及泡沫形成的速度外，小以及泡沫形成的速度外，pHpH和温度十分重要。和酸碱和温度十分重要。和酸碱变性一样，它的应用面远不如选择性热变性。变性一样，它的应用面远不如选择性热变性。n 总之，选择性变性灵活性很大，如果发挥得当，可总之，选择性变性灵活性很大，如果发挥得当，可能极大地提高酶的纯度。能极

153、大地提高酶的纯度。成功的关键成功的关键在于严格控制条件，在于严格控制条件，除了所选用的主要因素外，还需注意其他因素，其中也除了所选用的主要因素外，还需注意其他因素，其中也包括蛋白浓度，包括蛋白浓度，蛋白浓度太低时一般不能应用此法蛋白浓度太低时一般不能应用此法。七、结晶七、结晶n 所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，规则且周期性排列的一种固体形式。规则且周期性排列的一种固体形式。n 由于不纯的蛋白溶液、变性的蛋白质不能和酶形成结由于不纯的蛋白溶液、变性的蛋白质不能和酶形成结晶，也由于各种分子形成结晶的条件不同，因此，晶，也由于各种分子形成结

154、晶的条件不同，因此，结晶既结晶既是一种酶是否纯净的标志是一种酶是否纯净的标志，也是一种分离纯化的手段也是一种分离纯化的手段。 83 结晶，也是利用结晶，也是利用酶和杂蛋白在溶解度酶和杂蛋白在溶解度上不同而进行的一上不同而进行的一种纯化方法，但是和其他利用溶解度降低的方法不同，它要种纯化方法，但是和其他利用溶解度降低的方法不同，它要求以极为缓慢的速度逐渐降低酶的溶解度，使之能从溶解状求以极为缓慢的速度逐渐降低酶的溶解度，使之能从溶解状态以特定的固体形式析出。态以特定的固体形式析出。n 也就是说，只有使酶溶液极为缓慢地接近结晶也就是说，只有使酶溶液极为缓慢地接近结晶的条件，才能使酶结晶析出，否则，

155、酶就可能以无的条件，才能使酶结晶析出，否则，酶就可能以无定形的形式直接沉淀出来。为此，通常进行结晶时，定形的形式直接沉淀出来。为此，通常进行结晶时，或是通过毛细管、或是借助透析方式缓慢地加入硫或是通过毛细管、或是借助透析方式缓慢地加入硫酸铵等沉淀剂，待溶液呈现微弱的浑浊后，再移入酸铵等沉淀剂，待溶液呈现微弱的浑浊后，再移入某一适宜温度下静候结晶出现，也可在加入相应的某一适宜温度下静候结晶出现，也可在加入相应的试剂后，再缓慢地改变试剂后，再缓慢地改变pHpH和温度，使之逐渐接近结和温度，使之逐渐接近结晶条件。结晶往往需要晶核，晶核可以依靠酶溶液晶条件。结晶往往需要晶核，晶核可以依靠酶溶液自身缓慢

156、形成，也可自外加入；自身缓慢形成，也可自外加入；n。形成结晶的时间形成结晶的时间n 结晶的过程是溶质分子移向晶核，使结晶逐渐长结晶的过程是溶质分子移向晶核，使结晶逐渐长大，因此，结晶需要的时间很不相同，从几小时到几大，因此，结晶需要的时间很不相同，从几小时到几天、几月，甚至要以年计；晶核多，结晶形成虽然较天、几月，甚至要以年计；晶核多，结晶形成虽然较快，但形成的晶体较小快，但形成的晶体较小为了获得纯净、粒大、收得率又高的结晶，还有为了获得纯净、粒大、收得率又高的结晶，还有两个很重要的因素应注意：两个很重要的因素应注意：n (1)(1)酶溶液应该达到相当的纯度酶溶液应该达到相当的纯度n 除了少数

157、例外，不纯的溶液通常不能得到结晶，因为除了少数例外，不纯的溶液通常不能得到结晶，因为晶核很快地为杂质所包围掩盖，无法长成晶体。究竟要达晶核很快地为杂质所包围掩盖，无法长成晶体。究竟要达到何种纯度才能着手进行结晶到何种纯度才能着手进行结晶? ?n 这个问题尚无确定标准，不过在很多情况下，酶溶液这个问题尚无确定标准，不过在很多情况下，酶溶液如果很纯的话，即使末结晶，也常可观察到某些可结晶的如果很纯的话，即使末结晶，也常可观察到某些可结晶的征候，如具有较大的密度、较高的闪烁性、较易分散、颗征候，如具有较大的密度、较高的闪烁性、较易分散、颗粒从球形趋向椭圆等。酶溶液如果一旦获得结晶，再结晶粒从球形趋向

158、椭圆等。酶溶液如果一旦获得结晶，再结晶一般是很容易成功的。一般是很容易成功的。n 84(2)(2)酶的浓度要恰到好处酶的浓度要恰到好处n 一般以一般以1 15 5为宣，最低不宜小于为宣，最低不宜小于0.20.2，浓度，浓度高虽然较易结晶，但如果接近过于饱和，结果往往只高虽然较易结晶，但如果接近过于饱和，结果往往只能获得大量微晶，难以形成大晶体。能获得大量微晶，难以形成大晶体。n 酶结晶形成以后，摇动酶溶液多可看到丝状闪烁，酶结晶形成以后，摇动酶溶液多可看到丝状闪烁，用用100100400400倍显微镜观察时，根据结晶的酶和结晶的倍显微镜观察时，根据结晶的酶和结晶的条件不同，形状也可能多种多样。

159、在偏振光显微镜下，条件不同，形状也可能多种多样。在偏振光显微镜下，多呈弱的多呈弱的双折射双折射。八、纯化方法的排列顺序八、纯化方法的排列顺序n 在上述的纯化方法中，过滤，沉淀法、吸附法、离子交换法和选择在上述的纯化方法中，过滤，沉淀法、吸附法、离子交换法和选择性变性法用得较多，而近年来，胶过滤法、亲和层析法和聚焦层析法应性变性法用得较多，而近年来，胶过滤法、亲和层析法和聚焦层析法应用日益广泛，用日益广泛， 至于方法的排列顺序，一般地说，选择性热变性由于能以至于方法的排列顺序，一般地说，选择性热变性由于能以很小的代价除去大量的杂蛋白，而且不需要引入其他物质，也不增加液很小的代价除去大量的杂蛋白，

160、而且不需要引入其他物质，也不增加液体的体积，所以可以放在最先进行。体的体积，所以可以放在最先进行。n 吸附法简便，很多情况下，吸附前不一定要求脱盐，吸附平衡后，吸附法简便，很多情况下，吸附前不一定要求脱盐，吸附平衡后，通常放置片刻就会澄清，用倾滗、虹吸等办法除去大量母液后，即能转通常放置片刻就会澄清，用倾滗、虹吸等办法除去大量母液后，即能转入小体积进行操作，因此亦可考虑安排在前面的步骤进行。结晶由于它入小体积进行操作，因此亦可考虑安排在前面的步骤进行。结晶由于它要求酶液有相当的纯度，无疑应放在较后的环节。至于其他方法则难以要求酶液有相当的纯度，无疑应放在较后的环节。至于其他方法则难以格言，要由

161、实验确定。格言，要由实验确定。85n 例如，吸附后常要用盐溶液洗脱，接着用盐析法似乎是有利例如，吸附后常要用盐溶液洗脱，接着用盐析法似乎是有利的，但盐析放在太前面，大液量的脱盐又是件麻烦事；有机溶剂的，但盐析放在太前面，大液量的脱盐又是件麻烦事；有机溶剂沉淀要求低温快速处理，如果酶液体积大，这种方法往往受设备沉淀要求低温快速处理，如果酶液体积大，这种方法往往受设备容量的限制，似不宜故在前面的步骤里，但另一方面，如果酶已容量的限制，似不宜故在前面的步骤里，但另一方面，如果酶已经很纯，稳定性也因之随着降低，此时再用有机溶剂处理又有变经很纯，稳定性也因之随着降低，此时再用有机溶剂处理又有变性之虞；其

162、他如离子交换法、胶过滤法、聚集层析法以及亲和分性之虞；其他如离子交换法、胶过滤法、聚集层析法以及亲和分离法等应用于大体积操作目前还存在一些问题，因此常放在稍后离法等应用于大体积操作目前还存在一些问题，因此常放在稍后的步骤。的步骤。n 但是也不尽然如此，近但是也不尽然如此，近2020年来纯化工作有一种趋年来纯化工作有一种趋向就是从一种原料出发，同时进行多种酶的综合分离。向就是从一种原料出发，同时进行多种酶的综合分离。例如，有人将例如，有人将DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、胶过葡聚糖凝胶、胶过滤和羟基磷灰石层析等方法组合起来，从大肠杆菌的滤和羟基磷灰石层析等方法

163、组合起来，从大肠杆菌的抽提液中同时综合分离了抽提液中同时综合分离了4040种以上的酶，而其起始的种以上的酶，而其起始的步骤就是应用步骤就是应用DEAE-DEAE-离子交换剂。离子交换剂。n 总之，酶的纯化工作应知己知被，并在掌握客观规总之，酶的纯化工作应知己知被，并在掌握客观规律酌基础上，机动灵活地加以应用。律酌基础上，机动灵活地加以应用。第四节 酶的纯度与产量n一、活力测定一、活力测定n二、纯化方法与条件的比较标准二、纯化方法与条件的比较标准n三、纯度的标准三、纯度的标准86 一、活力测定一、活力测定n 如何进行酶的活力测定如何进行酶的活力测定? ? 如果待分离的酶已有报道，可参如果待分离的

164、酶已有报道，可参考它所采用的测定方法和条件；如果需要另建新的测定系统，考它所采用的测定方法和条件；如果需要另建新的测定系统，那么就得先对该酶的作用、动力学性质等有所了解，据此来选那么就得先对该酶的作用、动力学性质等有所了解，据此来选择合适的底物和底物浓度、以及合适的反应择合适的底物和底物浓度、以及合适的反应pHpH和温度等，同时和温度等，同时确定一种相应的测定方法。确定一种相应的测定方法。n 但不管是哪一种情况，有但不管是哪一种情况，有两点很重要两点很重要：一是测定用的酶反一是测定用的酶反应时间应选择在酶反应的初速度范围内；二是测定用的酶量必应时间应选择在酶反应的初速度范围内；二是测定用的酶量

165、必须和测得的活性有线性关系须和测得的活性有线性关系。除此以外，。除此以外，87n纯化过程中的酶活力测定还应考虑纯化过程中的酶活力测定还应考虑三个问题三个问题：n由于测定工作量较大由于测定工作量较大。而且有时。而且有时“立等立等”结果，所以结果，所以要求测定方法快速、简便，而准确度在一定程度上比较要求测定方法快速、简便，而准确度在一定程度上比较次要，甚至可容许次要，甚至可容许5 51010的误差，故常用分光光度的误差，故常用分光光度法、电学测定法等测定；法、电学测定法等测定；n由于分离纯化过程可能丢失辅助因子由于分离纯化过程可能丢失辅助因子，因此有时需要，因此有时需要在反应系统中加入相应的物质在

166、反应系统中加入相应的物质，如煮沸过的抽提液、辅，如煮沸过的抽提液、辅酶、盐或半胱氨酸等；酶、盐或半胱氨酸等；n由于纯化过程中引入由于纯化过程中引入的某些物质可能对酶的反应和测的某些物质可能对酶的反应和测定有影响或干扰，故有时定有影响或干扰，故有时还应在测定前进行透析或加入还应在测定前进行透析或加入螯合剂等螯合剂等。n 酶的活力通常采用酶的活力通常采用国际酶委员会规定国际酶委员会规定的单位表示，但是的单位表示，但是在纯化工作中，为了方便，也可采用自行规定的单位。在纯化工作中，为了方便，也可采用自行规定的单位。n 如直接以如直接以光密度值光密度值表示。从酶的活力测定得到的直接结表示。从酶的活力测定

167、得到的直接结果是样品中酶的浓度，即单位数果是样品中酶的浓度，即单位数/ /毫升。但还要由此进一步毫升。但还要由此进一步算出样品中总的单位数，即算出样品中总的单位数，即总活力总活力，以及单位重量的蛋白，以及单位重量的蛋白质中酶的单位数，即质中酶的单位数，即比活力比活力，如单位数毫克蛋白，或单，如单位数毫克蛋白，或单位数毫克蛋白氮。要计算比活力还要同时测定酶溶液中位数毫克蛋白氮。要计算比活力还要同时测定酶溶液中的蛋白质含量。的蛋白质含量。88测定酶溶液中的蛋白质含量常用的方法有：测定酶溶液中的蛋白质含量常用的方法有：n紫外吸收法紫外吸收法，此法简便快速，此法简便快速, ,不损耗样品，但干扰因素很多

168、，所以不损耗样品，但干扰因素很多，所以在论文报道中不能用在论文报道中不能用A280A280表示；表示；n双缩脲法双缩脲法也很简单；也很简单；n酚试剂法酚试剂法虽较繁，但是灵敏度、准确度都比较高；虽较繁，但是灵敏度、准确度都比较高；n染料结合法，又称染料结合法，又称BradforddBradfordd法法，此法灵敏、简便、快速而且极少，此法灵敏、简便、快速而且极少干扰，是近年来常用的检测法。干扰，是近年来常用的检测法。n蛋白氮通常采用凯氏定氮法蛋白氮通常采用凯氏定氮法。n 一般地说，比活力愈高，酶的纯度也愈好，但是它不能说明一般地说，比活力愈高，酶的纯度也愈好，但是它不能说明实际的纯净程度是多少

169、实际的纯净程度是多少! ! 二、纯化方法与条件的比较标准二、纯化方法与条件的比较标准n 在酶的分离纯化过程中，总活力用于计算某一抽提在酶的分离纯化过程中，总活力用于计算某一抽提或纯化步骤后面的得率或回收率或纯化步骤后面的得率或回收率(y)(y)，而比活力用于计，而比活力用于计算某一纯化步骤后的纯化效果，即纯度算某一纯化步骤后的纯化效果，即纯度的提高的提高(e)。89酶纯化各步酶纯化各步“收支表收支表”n 在酶的纯化过程中，通常将各个步骤的测定结果列成在酶的纯化过程中，通常将各个步骤的测定结果列成“收支表收支表”以便进行总结、检查和改进。以便进行总结、检查和改进。90三、纯度的标准三、纯度的标准

170、n 纯度提高和回收率的检定能帮助我们选择纯化方法纯度提高和回收率的检定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，为了了解与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否所获得的样品是否均一纯净均一纯净还要进行纯度检定。酶均还要进行纯度检定。酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法。一纯净性的鉴定有以下几种方法。91方法方法n1 1溶解度法溶解度法n 这是老方法，由于所需样品量较大，已很少采用。这是老方法，由于所需样品量较大，已很少采用。n 2 2电泳法电泳法n 常用的有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺不连续胶常用的有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺不连续胶电泳和聚焦胶电泳，

171、特别是后两者有极高的分辨宰。有人电泳和聚焦胶电泳，特别是后两者有极高的分辨宰。有人认为，如果样品在聚丙烯酰胺胶电泳谱上是单一谱带，就认为，如果样品在聚丙烯酰胺胶电泳谱上是单一谱带，就可以看作是均一的了，但是应注意随电泳条件不同，可能可以看作是均一的了，但是应注意随电泳条件不同，可能出现不同的情况。聚焦胶电泳分辨率高，而且当有杂蛋白出现不同的情况。聚焦胶电泳分辨率高，而且当有杂蛋白存在时，从谱带位置还可了解杂蛋白的解离性质，有利于存在时，从谱带位置还可了解杂蛋白的解离性质，有利于采取进一步的纯化措施。采取进一步的纯化措施。n 92n3 3超离心法超离心法n 在高达在高达65000 rpm6500

172、0 rpm的离心力场情况下观测离心谱带，的离心力场情况下观测离心谱带，根据沉降峰带是否分裂、是否有根据沉降峰带是否分裂、是否有“肩肩”、是否对称等、是否对称等可以作出均一与否的判断。可以作出均一与否的判断。n4 4免疫学法免疫学法n 纯化的酶样品在琼脂胶上与相应的抗体进行免疫纯化的酶样品在琼脂胶上与相应的抗体进行免疫反应，根据得到的沉降线可以判断样品的纯度。如果反应，根据得到的沉降线可以判断样品的纯度。如果此法以免疫电泳的方式进行，则更为灵敏。此法以免疫电泳的方式进行，则更为灵敏。第五节第五节 酶的剂型与保存酶的剂型与保存n一、酶的剂型一、酶的剂型n二、酶的稳定性与保存二、酶的稳定性与保存93

173、一、酶的剂型一、酶的剂型n 为适应各种需要，并考虑到经济和应用效果，酶制剂常以为适应各种需要，并考虑到经济和应用效果，酶制剂常以四种剂型供应。四种剂型供应。n 1.1.液体酶制剂液体酶制剂n 这包括稀酶液和浓缩酶液。一般在除去菌体等杂质后，不这包括稀酶液和浓缩酶液。一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩，比较经济，但不稳定，而且成再纯化而直接制成或加以浓缩，比较经济，但不稳定，而且成分繁杂，只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用。分繁杂，只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用。n 942 2固体酶制剂固体酶制剂n 这类制剂有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成，这类制

174、剂有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成，有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成，有的则加有淀粉等有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成，有的则加有淀粉等填充料。填充料。n 这些制剂多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。这这些制剂多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。这类制剂中也有的是在发酵液或抽提液除去杂质，并经初步纯类制剂中也有的是在发酵液或抽提液除去杂质，并经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物等生产的酶制剂。用于加工化后制成，如用于洗涤剂、药物等生产的酶制剂。用于加工或生产某种产品的制剂，必须去掉其中起干扰作用的杂酶。或生产某种产品的制剂，必须去掉其中起干扰作用的杂酶。n 例如多核苷酸磷酸化酶例

175、如多核苷酸磷酸化酶(PNPase)(PNPase)通常用来合成各种多聚通常用来合成各种多聚核苷酸核苷酸(Poly I(Poly I，Poly c Poly c 等等) )，如果在酶制剂中仍含有核酸，如果在酶制剂中仍含有核酸酶或磷酸酯酶，就会破坏多核苷酸链的合成，影响产品质量。酶或磷酸酯酶，就会破坏多核苷酸链的合成，影响产品质量。n 固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。 3 3纯酶制剂纯酶制剂n 这包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，这包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。要求有较高的纯度。n 用作分析工

176、具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位重量的酶制剂中酶活性达到一定单位数。外，还要求单位重量的酶制剂中酶活性达到一定单位数。n 用作基因工程的工具酶则要求不含非专一性的核酸酶，用作基因工程的工具酶则要求不含非专一性的核酸酶，或完全不含核酸酶。作为蛋白质结构分析对象的酶必须或完全不含核酸酶。作为蛋白质结构分析对象的酶必须“绝绝对的对的”纯净，而注射用的医用酶则应设法除去热源物质。纯净，而注射用的医用酶则应设法除去热源物质。n 热源是染菌后细菌分泌出来的一类类毒素，带有这类物热源是染菌后细菌分泌出来的一类类毒素，带有这类物质的制剂注射到

177、动物体后，能引起体温升高。热源物质属于质的制剂注射到动物体后，能引起体温升高。热源物质属于糖蛋白，相对分子质量在糖蛋白，相对分子质量在1010万以上，因细菌来源不同有小的万以上，因细菌来源不同有小的差异。差异。n 95n 热源物质对热相当稳定，往往要通过长时间高温作用，例如，经热源物质对热相当稳定，往往要通过长时间高温作用，例如，经180180。220220、两小时以上的处理才会分解；同时很耐酸，不过在碱中，、两小时以上的处理才会分解；同时很耐酸，不过在碱中，例如例如pHpH1010，48h48h的作用下会逐渐破坏；热源物质对氧化剂十分敏感，的作用下会逐渐破坏；热源物质对氧化剂十分敏感，在新鲜

178、配制的洗液中一小时就可将它除去。除了上述办法外，为了解决在新鲜配制的洗液中一小时就可将它除去。除了上述办法外，为了解决热源问题还可采取以下措施：热源问题还可采取以下措施：n (1) (1)吸附。例如，可用吸附。例如，可用DEAEDEAE纤维素等阴离子交换剂、磷酸钙、氧化纤维素等阴离子交换剂、磷酸钙、氧化铝凝胶等吸附除去这类物质，也可用活性炭，但它的专一性不高。铝凝胶等吸附除去这类物质，也可用活性炭，但它的专一性不高。n (2) (2)亲和分离。例如，有人已分离出热源抗体，将它做成亲和吸附亲和分离。例如，有人已分离出热源抗体，将它做成亲和吸附剂可用以专一地除去热源物质，另外也可用凝集素做成的亲和

179、柱将它吸剂可用以专一地除去热源物质，另外也可用凝集素做成的亲和柱将它吸附除去。附除去。n (3) (3)选择适宜的纯化方法。热源物质具有亲有机溶剂的特点，因此选择适宜的纯化方法。热源物质具有亲有机溶剂的特点，因此通过有机溶剂纯化获得的产品，热源物质比例较高，而用盐折法纯化的通过有机溶剂纯化获得的产品，热源物质比例较高，而用盐折法纯化的产品则少些。产品则少些。4 4固定化酶制剂固定化酶制剂n 固定化酶制剂是一种有利于保存和应用的固定化酶制剂是一种有利于保存和应用的剂型，将在下一章进行讨论。剂型，将在下一章进行讨论。二、酶的稳定性与保存二、酶的稳定性与保存 获得酶制剂后，进一步的问题是：如何提高酶

180、的稳定性，获得酶制剂后，进一步的问题是：如何提高酶的稳定性，延长其有效期。延长其有效期。 1 1影响酶的稳定性因素影响酶的稳定性因素 影响酶的稳定性有以下影响酶的稳定性有以下几种因素几种因素： (1) (1)温度温度。大多数酶可在低温条件下。大多数酶可在低温条件下(0 (0 4 )4 )使用、处理使用、处理和保存。但是有些酶，它的高级结构的稳定性与疏水键有关，和保存。但是有些酶，它的高级结构的稳定性与疏水键有关，如粗糙链孢杆菌的谷氨酸脱氢酶、鸡肝线粒体内的丙酮酸羧化如粗糙链孢杆菌的谷氨酸脱氢酶、鸡肝线粒体内的丙酮酸羧化酶等，则应慎重。许多酶可在液酶等，则应慎重。许多酶可在液N N2 2或或-8

181、0-80中冻结保存如微球中冻结保存如微球菌核酸酶、血清碱性磷酸配酶等；特别是加入菌核酸酶、血清碱性磷酸配酶等；特别是加入2525 5050的甘的甘油或多元醇时这种保护作用更明显，甚至也可用于冷敏的酶。油或多元醇时这种保护作用更明显，甚至也可用于冷敏的酶。冰冻干燥冰冻干燥(lyophilization)(lyophilization)是一种好的有效办法，但要注意某是一种好的有效办法，但要注意某些酶在冻干过程有可能失效。些酶在冻干过程有可能失效。n 96n(2)(2)pHpH和缓冲液和缓冲液。大多数酶仅在各自特定的。大多数酶仅在各自特定的pHpH范围内稳定，超越此范范围内稳定，超越此范围则迅速失效

182、。但是少数低分子量的酶如溶菌酶、核糖核酸酶等在酸围则迅速失效。但是少数低分子量的酶如溶菌酶、核糖核酸酶等在酸性性pHpH条件下相当稳定。缓冲液的种类有时也会影响酶的稳定性，如条件下相当稳定。缓冲液的种类有时也会影响酶的稳定性，如Tris-HClTris-HCl缓冲液在缓冲液在pH7.5pH7.5以下除了缓冲能力较弱外，还可能抑制某些以下除了缓冲能力较弱外，还可能抑制某些酶的活性。此外，有些酶在磷酸缓冲液中冻结也会引起失活，值得注酶的活性。此外，有些酶在磷酸缓冲液中冻结也会引起失活，值得注意。意。n(3)(3)酶蛋白浓度酶蛋白浓度。酶的稳定性虽因酶性质和纯度而异，但是一般情况。酶的稳定性虽因酶性

183、质和纯度而异，但是一般情况下，酶蛋白在高浓度时较为稳定，而在低浓度时则易于解离、吸附下，酶蛋白在高浓度时较为稳定，而在低浓度时则易于解离、吸附甚至易发生表面变性而失效。甚至易发生表面变性而失效。 (4) (4)氧氧。某些酶为巯基酶，可能由于巯基氧化而在空气中逐渐失活。某些酶为巯基酶，可能由于巯基氧化而在空气中逐渐失活。这种情况下加入这种情况下加入1mmol1mmolL EDTAL EDTA或或DTTDTT等有助于增加其稳定性。等有助于增加其稳定性。n 为了保证有较高的稳定性，除了应避免上述不适宜的条件外，最为了保证有较高的稳定性，除了应避免上述不适宜的条件外，最常用的办法是加入某些稳定试剂。常

184、用的办法是加入某些稳定试剂。 2 2稳定酶的某些办法稳定酶的某些办法n (1)(1)添加底物、抑制剂和辅酶添加底物、抑制剂和辅酶。这是现在广泛采用的办。这是现在广泛采用的办法，例如，添加法，例如，添加L-L-谷氨酸常可稳定谷氨酸常可稳定N-N-甲基谷氨酸合成酶，甲基谷氨酸合成酶，添加柠檬酸可稳定顺乌头酸酶，添加竞争性抑制剂安息香添加柠檬酸可稳定顺乌头酸酶，添加竞争性抑制剂安息香酸钠或辅基酸钠或辅基FADFAD可稳定可稳定D-D-氨基酸酶等。它们的作用可能是通氨基酸酶等。它们的作用可能是通过降低局部的能级水，使处于不稳定状态的扭曲部分转入过降低局部的能级水，使处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态

185、。稳定状态。n (2) (2)添加添加SH-SH-保护剂保护剂。如谷胱甘肽、二巯基乙醇。如谷胱甘肽、二巯基乙醇( (但易自但易自动氧化动氧化) )和和DDTDDT等。等。n (3) (3)其他其他。添加某些低分子无机离子。添加某些低分子无机离子。97n 例如例如CaCa2+2+能保护能保护-淀粉酶，淀粉酶，MnMn2+2+能稳定溶菌酶，能稳定溶菌酶，ClCl- -能稳定透明质能稳定透明质酸酶等，它们的作用机理可能是防止酶的肽链伸展。其次是表面活性酸酶等，它们的作用机理可能是防止酶的肽链伸展。其次是表面活性剂，例如，许多酶配制于剂，例如，许多酶配制于1 1的苯烷水溶液中，即使在室温条件下其的苯烷

186、水溶液中，即使在室温条件下其催化活力也能维持相当长的时间。还有高分子化合物如血清白蛋白、催化活力也能维持相当长的时间。还有高分子化合物如血清白蛋白、多元醇，特别是甘油和蔗糖等是近年来常用的低温保存添加剂。此外，多元醇，特别是甘油和蔗糖等是近年来常用的低温保存添加剂。此外，在某些情况下，丙酮、乙醇等有机溶剂也显示一定的稳定作用。最后，在某些情况下，丙酮、乙醇等有机溶剂也显示一定的稳定作用。最后，为了防止微生物污染，可加入甲苯、苯甲酸和百里酚等，它们对大多为了防止微生物污染，可加入甲苯、苯甲酸和百里酚等，它们对大多数酶通常没有不良影响；当然也可以通过细菌漏斗过滤低温保存。数酶通常没有不良影响；当然

187、也可以通过细菌漏斗过滤低温保存。n 固体酶制剂稳定性一般较高固体酶制剂稳定性一般较高，它们含水量非常低，有的可在暗冷，它们含水量非常低，有的可在暗冷处保存数月甚至一年以上而不损失活力。热敏性酶多用冷冻干操法，处保存数月甚至一年以上而不损失活力。热敏性酶多用冷冻干操法，例如注射用酶等通常都用此法；耐热性酶则往往用喷雾干燥法；至于例如注射用酶等通常都用此法；耐热性酶则往往用喷雾干燥法；至于盐析沉淀和结晶产品或者直接加入固体盐作成盐析沉淀和结晶产品或者直接加入固体盐作成“糊糊”，如，如“硫酸铵糊硫酸铵糊”或在沉淀析出后置于大量冷丙酮中，使之松散，然后抽滤干燥。或在沉淀析出后置于大量冷丙酮中，使之松散，然后抽滤干燥。n 作成固定化酶也是另一种提高酶稳定性的好方法。作成固定化酶也是另一种提高酶稳定性的好方法。98