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1、医学微生物学实验二医学微生物学实验二 微生物学教研室：微生物学教研室：3029130 3029130 科教科：科教科：302994530299451医学微生物学实验二抗酸染 实验内容实验内容 1.1.实验一结果的观察和分析；实验一结果的观察和分析； 2. 2.细菌内毒素的检测技术；细菌内毒素的检测技术； 3. 3.抗酸染色；抗酸染色； 4. 4.实验考试。实验考试。2医学微生物学实验二抗酸染一、实验一结果的观察和分析一、实验一结果的观察和分析 空气中细菌空气中细菌 咽喉部细菌咽喉部细菌3医学微生物学实验二抗酸染二、内毒素的检测技术二、内毒素的检测技术（鲎试验）（鲎试验） 1.1.内毒素检测方法
2、内毒素检测方法 家兔发热法，鲎试验。家兔发热法，鲎试验。4医学微生物学实验二抗酸染2.2.鲎试验原理鲎试验原理3.3.材料材料 鲎试剂，鲎试剂， 内毒素试剂，内毒素试剂， 鲎试剂专用溶解水，鲎试剂专用溶解水， 无菌无热源质吸管无菌无热源质吸管 内毒素（内毒素（LPS）激激 活活 凝固蛋白原凝固蛋白原 凝固蛋白凝固蛋白 （溶解状态）（溶解状态） （凝胶状态）（凝胶状态）凝固酶原凝固酶原凝固酶凝固酶5医学微生物学实验二抗酸染4.4.方法步骤方法步骤（每（每4 4个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照）个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照）（1 1）取两支鲎试剂打开，分别加入）取两支鲎试剂打开，分
3、别加入0.1ml 0.1ml 鲎试剂鲎试剂 溶解水，使之溶解。溶解水，使之溶解。（2 2）其中一支加入）其中一支加入0.1ml0.1ml内毒素，标记上实验组，内毒素，标记上实验组， 另一支加入另一支加入0.1ml0.1ml溶解水，作为对照。溶解水，作为对照。（3 3）垂直放入）垂直放入3737温箱，温箱，20-30min20-30min观察结果。观察结果。5.5.结果及应用结果及应用 实验组出现凝固，对照组不出现凝固实验组出现凝固，对照组不出现凝固6医学微生物学实验二抗酸染三、抗三、抗 酸酸 染染 色色 Acid fast Acid fast stainstain7医学微生物学实验二抗酸染（一
4、）实验目的（一）实验目的 1.1.掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义。掌握分枝杆菌抗酸染色的操作方法和意义。 2. 2.熟悉抗酸染色的原理。熟悉抗酸染色的原理。（二）实验原理（二）实验原理 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色，同时分枝杆菌中的分枝菌酸与染和延长染色时间来促使其着色，同时分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色
5、，故名抗酸染色。 齐齐- -尼氏抗酸染色法尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用牢固结合成复合物，用3%3%盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。兰色。8医学微生物学实验二抗酸染 1.1.细菌：细菌：卡介苗卡介苗 （BCGBCG）。）。 2. 2.抗酸染液：抗酸染液：石炭酸复红液、石炭酸复红液、3%3%盐酸酒精、碱盐酸酒精、碱 性美兰溶液。性美兰溶液。 3. 3.其它：其它：接种环
6、、酒精灯、载玻片，玻片夹等。接种环、酒精灯、载玻片，玻片夹等。（三）实验材料（三）实验材料9医学微生物学实验二抗酸染（四）方法与步骤（四）方法与步骤1.1.细菌涂片的制备细菌涂片的制备 涂片涂片 干燥干燥 固定固定 2.2.染色染色1 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红石炭酸复红2 23 3 滴滴，在火焰高处（在火焰高处（2 2 10cm10cm）徐徐加热，）徐徐加热，切勿沸腾切勿沸腾，出现蒸出现蒸汽即暂时离开汽即暂时离开，加热加热3 3 5min5min，若染液蒸发减少，应再，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加染液，以免干涸，待标本冷却后用
7、水冲洗待标本冷却后用水冲洗。2 2）脱色：）脱色：3%3%盐酸酒精脱色盐酸酒精脱色30s30s1min1min；用水冲洗。；用水冲洗。3 3）复染：用）复染：用碱性美兰溶液复染碱性美兰溶液复染1min1min；用水冲洗。；用水冲洗。4 4）玻片用吸水纸吸干，油镜观察。）玻片用吸水纸吸干，油镜观察。10医学微生物学实验二抗酸染（五）实验结果（五）实验结果未染色未染色 初染后初染后 脱色后脱色后 复染后复染后初染初染脱色脱色复染复染石石炭炭酸酸复复红红盐盐酸酸酒酒精精碱碱性性美美兰兰红色为抗酸染色阳性；红色为抗酸染色阳性； 蓝色为抗酸染色阴性。蓝色为抗酸染色阴性。11医学微生物学实验二抗酸染 结核
8、杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长；背景及非抗酸性细菌呈兰色。状生长；背景及非抗酸性细菌呈兰色。12医学微生物学实验二抗酸染（六）注意事项（六）注意事项1.1.无菌操作；无菌操作；2.2.染色要充分，掌握好时间；染色要充分，掌握好时间；3.3.初染时加热勿使染液沸腾，干涸。初染时加热勿使染液沸腾，干涸。13医学微生物学实验二抗酸染 实验报告实验报告 1.内毒素的检测（鲎试验）原理，材料，方法及结果。内毒素的检测（鲎试验）原理，材料，方法及结果。 2.抗酸染色的原理，材料，方法和结果（画图）。抗酸染色的原理，材料，方法和结果（画图）。 实验考试实验考试14医学微生物学实验二抗酸染
