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1、12.10层析技术层析技术u历史和概念u分类u常用的层析技术u薄层层析法u气相色谱技术u高效液相色谱技术u固相萃取技术22.10.1历史和概念历史和概念层析层析Chromatography1903, Tsweett M. 茨维特茨维特碳酸钙碳酸钙石油醚洗脱石油醚洗脱层析法，最早层析法，最早用于有色物质用于有色物质分离，因此也分离，因此也叫色谱法，色叫色谱法，色层法层法3层析技术的发展历程层析技术的发展历程u1931年Kuhn等在氧化铝和碳酸钙柱上制备性的分离了,-胡萝卜素u1941年，Martin和Synge采用水分饱和的硅胶为固定相，以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸，建立了分配层析u
2、1951年，Martin和James报道了用自动滴定仪作检测器分析脂肪酸，创立了气-液色谱法，促进了色谱理论的形成u1958年，Golay首先提出了分离效能极高的毛细管柱气相色谱法u1960年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代4概念概念uu层析法层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相为流过固定相的气体或液体，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离
3、的目的。5u固定相固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。u流动相流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂洗脱剂，薄层层析时称为展层剂展层剂。6u吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。例如以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。这些作用的强度依次为：成盐作用成盐作用配位作用
4、配位作用氢键作用氢键作用偶极作用偶极作用范德华力作用范德华力作用有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。789石油醚石油醚环己烷环己烷四氯化碳四氯化碳苯苯氯仿氯仿乙醚乙醚乙酸乙酯乙酸乙酯丙酮丙酮吡啶吡啶乙醇乙醇甲醇甲醇水水乙酸乙酸各种展开剂对极性有机物的溶解能力各种展开剂对极性有机物的溶解能力对极性有机物的溶对极性有机物的溶对极性有机物的溶对极性有机物的溶解能力增强解能力增强解能力增强解能力增强10根据层析分离机制柱层析薄层层析纸层析薄膜层析吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析分配层析分配层析分配层析分配层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析凝胶层析亲和层析亲
5、和层析亲和层析亲和层析气相(气-液;气-固)层析液相(液-液;液-固)层析根据两相所处状态根据操作形式不同2.10.2层析法分类层析法分类112.10.3各种层析技术各种层析技术吸附层析吸附层析u吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。u主要吸附力：吸附能（化学吸附、物理吸附）u吸附剂吸附剂：常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。u水分、粒度、吸附物分子大小、极性、特殊化学基团等对各种吸附剂吸附力有影响12纤维素，淀粉纤维素，淀粉纤维素，淀粉纤维素，淀粉硅酸镁硅酸镁硅酸镁硅酸
6、镁硫酸钙硫酸钙硫酸钙硫酸钙硅胶硅胶硅胶硅胶佛罗里硅土佛罗里硅土佛罗里硅土佛罗里硅土氧化镁氧化镁氧化镁氧化镁中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝中性氧化铝活性炭活性炭活性炭活性炭对极性有机物的对极性有机物的吸附作用增强吸附作用增强13u对极性生物碱在硅胶上死吸附特别严重，可采用哪些途径调节实验？14吸附层析代表之一吸附层析代表之一活性炭层析活性炭层析u非极性吸附剂（C-C键为主体），一般用于纯化、分离一般用于纯化、分离水溶性物质水溶性物质（也可用于非极性和弱极性），如甙类、氨基酸类、糖类u前处理：一般先过筛，用稀盐酸洗涤，稀碱洗涤，其次用乙醇洗，再以水洗净，于120干燥45h后即可u颗粒活性炭or粉末
7、活性炭？u作为非极性吸附剂，水溶液中吸附强，有机溶剂中吸附弱u活性炭的内表面可高达1000m2/g硅胶600m2/g15u研究认为，分子量在5003000是活性炭可能吸附的范围，并随分子量的增大，吸附容量减小芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物在疏水性相当的条件下，对极性基团多的化合物在疏水性相当的条件下，对极性基团多的化合物在疏水性相当
8、的条件下，对极性基团多的化合物在疏水性相当的条件下，对极性基团多的化合物吸附强于极性基团少的（与活性炭极性基团及表吸附强于极性基团少的（与活性炭极性基团及表吸附强于极性基团少的（与活性炭极性基团及表吸附强于极性基团少的（与活性炭极性基团及表面水膜有关）面水膜有关）面水膜有关）面水膜有关）161718u纤维活性炭新型的高性能活性炭吸附材料u它是利用超细纤维如黏胶丝、酚醛纤维或腈纶纤维等制成毡状、绳状、布状等，经高温(1200K以上)炭化，用水蒸气活化后形成的。u纤维活性炭的表面积大，高达1700m2/g，密度小(515kg/m3)，微孔多而均匀，绝大多数为0.00150.0030m的小孔和中孔，
9、因而吸附容量大，吸附和脱附速率高，残留量少，使用寿命长.u吸附能力比一般的活性炭高出110倍，特别是对于一些恶臭物质的吸附量比颗粒活性炭要高40倍左右。19吸附层析代表之二吸附层析代表之二氧化铝柱层析氧化铝柱层析u酸性氧化铝pH约为44.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5（仍属于碱性吸附剂范畴），用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为910，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物分离生物碱、胺和其它碱性化合物等有独特的优势。u醛、酮、酸、内酯等类型不易采用中性、碱性氧化铝分离u粒度：100160目20u氧化铝的吸附活性与含水量关系极大，一般在200左右加温46h活化
10、，然后按照下表加入一定量水来定等级，层析用氧化铝通常为级。u氧化铝价格便宜，吸附量强于硅胶，对杂质吸附能力强于硅胶活性加入水量（%）036101521用氧化铝柱分离长春碱和长春新碱的范例用氧化铝柱分离长春碱和长春新碱的范例长春花碱(抗肿瘤药物)，英文vinblastine，用于何杰金氏病，淋巴细胞瘤，组织细胞淋巴瘤，组织细胞增生症X，晚期睾丸肿瘤，对其它化药物耐受的绒癌及乳腺癌。长春花HerbaCatharanthirosei，别名别名：雁来红、日日新、日日春、天天开天天开，为夹竹桃科植物长春花Catharanthus roseus(L.)G.Don的全草22长春花总碱溶于甲醇长春花总碱溶于甲
11、醇长春花总碱的硫酸盐沉淀长春花总碱的硫酸盐沉淀长春花总碱的硫酸盐水溶液长春花总碱的硫酸盐水溶液氯仿萃取长春花总碱氯仿萃取长春花总碱氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干氯仿液用无水硫酸钠干燥后减压蒸干23长春花总碱浸膏长春花总碱浸膏1g上上30g氧化铝柱（氧化铝柱（级级），柱内径），柱内径柱长柱长=110重蒸的苯和氯仿混合溶液（比重重蒸的苯和氯仿混合溶液（比重1.3）洗脱）洗脱分段收集并采用氧化铝薄层色谱进行检测分段收集并采用氧化铝薄层色谱进行检测合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶合并相同流分，蒸干后溶于乙醇，制成硫酸盐析出结晶长春碱和长春新碱在1%硫酸铈铵的磷酸溶液下显紫红和灰蓝色氯
12、仿-乙醚-石油醚(10:10:1v/v)为展层剂24u通常所说的硅胶层析之一为吸附硅胶层析，载体硅胶具有多孔性的硅氧环（mSiO2nH2O）。u硅醇基显较弱的酸性。u在甲醇和水中溶解度为在甲醇和水中溶解度为0.01%，pH大于大于9时溶解度急时溶解度急剧上升剧上升。吸附层析代表之三吸附层析代表之三硅胶层析硅胶层析25u硅胶活化：110下烘干12h，其吸附性也随着水分的增加而降低，超过超过12%，吸附力极弱，不能，吸附力极弱，不能用作吸附层析用作吸附层析，只能作为分配层析的载体。u硅胶能吸附极性、非极性，饱和、不饱和分子，具有吸附层析和分配层析的双重特性。u硅胶是中性偏酸性颗粒，且制备中接触强酸
13、，常带酸性，又是弱酸性阳离子交换剂。u前处理：检查水浸膏pH（不低于5），否则水洗至中性，110下烘干24h。特殊要求下需要经过6mol/L盐酸及氯仿等预洗。26u干装和湿装u干装时，先在柱底塞上少许玻璃纤维，再加入一些细粒石英砂石英砂，然后将准备好的吸附剂用漏斗慢慢加入干燥的色谱柱中，边加入边敲击柱身，务必使吸附剂装填均匀，不能有空隙。吸附剂用量应是被分离混合物量的3040倍，必要时可多达100倍。加够以后，在吸附剂上覆盖少许石英砂。u湿装时，将准备好的吸附剂用适量展开剂调成可流动的糊，如干装时一样准备好色谱柱，将吸附剂糊小心地慢慢加入柱中（提前放一半柱体积的展开剂），加入时不停敲击柱身，务
14、必使吸附剂装填均匀，不能有气泡和裂隙，还必须使吸附剂始终被展开剂覆盖。一般柱层析步骤一般柱层析步骤1）装柱装柱272）洗柱）洗柱u干柱在使用前要洗柱，目的是排除吸附剂间隙中的空气，使吸附剂填充密实。洗柱时从柱顶由滴液漏斗加入所选的展开剂，适当放开柱下端的旋塞。加入时先快加，再放慢滴加速度，使吸附剂始终被展开剂覆盖。洗柱时也要轻敲柱身，排出气泡。283）上样和洗脱）上样和洗脱u上样也分为干法和湿法u干法为用比填料颗粒大的干燥硅胶加入待上样的溶液中，搅拌吸附样品后干燥成均匀的粉末后上样u将待分离的混合物用最小量洗脱液溶解，小心加入柱中。待混合物溶液液面接近吸附剂上的石英砂时，旋开滴液漏斗旋塞，滴加
15、展开剂。滴加速度以12滴/秒为适度。整个过程中，应使展开剂始终覆盖吸附剂。29正确选择层析柱，正确使用层析柱正确选择层析柱，正确使用层析柱30313233吸附层析代表之四吸附层析代表之四大孔吸附树脂大孔吸附树脂u大孔吸附树脂是一种不含交换基团不含交换基团的、具有大孔结构大孔结构的高分子吸附剂高分子吸附剂，也是一种亲脂性物质，它可以有效从很低浓度的溶液中吸附各种类型化合物（亲脂键、偶极离子、氢键等吸附方式，还有分子筛作用）。u装柱、上样、洗脱都比较简单，吸附量大，吸附速度快，选择性好，机械强度高，解吸附容易。按基团的极性可分为极性、非极性、中极性。u大孔吸附树脂的代表：三菱大孔吸附树脂三菱大孔吸
16、附树脂HP20；国产；国产D101大孔吸附树脂大孔吸附树脂34CD180丙烯酸系丙烯酸系用于提取分离丁胺卡那霉素等氨基糖苷类半合成抗生素860021苯乙烯系苯乙烯系主要用于甜菊糖苷、人参皂苷的提取精制，有机物的分离LK-002脲醛系列脲醛系列主要用于银杏黄酮、山楂黄酮、大豆异黄酮等的吸附提取LK-001乙烯吡啶乙烯吡啶主要用于甜菊糖甙等的吸附提取DM131改进型树脂改进型树脂苯乙烯系苯乙烯系主要用于银杏黄酮、人参皂甙、茶多酚等物的天然药提取和精制，具有吸附量大、二乙烯苯残留量低的优点，符合FDA的药用要求3536大孔吸附树脂应用举例大孔吸附树脂应用举例u氨基糖甙样品脱盐：氨基糖甙样品脱盐：将含
17、盐的氨基糖甙，通过大孔吸将含盐的氨基糖甙，通过大孔吸附树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速通过树脂柱，附树脂，氨基糖甙被吸附，而盐溶液快速通过树脂柱，去盐后可用去盐后可用(10-20)%的含水醇或丙酮洗脱吸附物的含水醇或丙酮洗脱吸附物u冬虫夏草有效成分的吸附分离冬虫夏草有效成分的吸附分离：H-103吸附树脂对核吸附树脂对核苷类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳苷类化合物和芳香性氨基酸吸附，从而与糖类和非芳香性氨基酸分离。香性氨基酸分离。37巯基纤维素巯基纤维素巯基棉纤维是将巯基巯基棉纤维是将巯基(HS-)连接在棉花的连接在棉花的大分子链上而制成。大分子链上而制成。巯基棉纤维对各种金属元素
18、的结合能力有着明显的巯基棉纤维对各种金属元素的结合能力有着明显的差异，其强弱顺序基本上符合差异，其强弱顺序基本上符合软硬酸碱原则软硬酸碱原则38uPt（）-Pd（）Au（）-Se（）Te（）As（）Hg（）-Ag（）Sb（）Bi（）Sn（）CH3HgIn（）-Pb（）Cd（）Zn（）u巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（巯基棉对碱金属、碱土金属无亲和性（亲石元素亲石元素）；）；而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫的金属成分可与而对亲硫元素吸附性能好。各种亲硫的金属成分可与较高浓度的较高浓度的K、Na、Mg2、Ca2、Sr2、Fe3、Mn2、Cr3分离。分离。39巯基纤维素的应用举例巯基纤维素的应用举
19、例u化学发光测定水、血液和矿石中CouHg（）、Bi（）、Pb（）、Cu（）干扰Co的化学发光测定，如何去除？u在pH4条件下，让试液流过巯基棉，干扰离子被吸附，流出液可直接测定。40还有哪些吸附材料？还有哪些吸附材料？u聚氨酯泡沫塑料聚氨酯泡沫塑料u纳米分离富集材料纳米分离富集材料u壳聚糖壳聚糖u磁微球磁微球u412.10.4分配层析分配层析u分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠涂布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。u吸附层析往往吸附过于强烈，
20、分配层析则避免了这一缺陷。u纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相（12%20%的水），有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。42分配层析之一分配层析之一纸层析纸层析影响纸层析的几大因素：物质的分子量物质的极性物质的电荷展开用的溶剂种类温度展开方式使用滤纸的种类其它43上行法上行法44下行法下行法45滤纸的选用对纸层析的影响滤纸的选用对纸层析的影响型号标重(g/m2) 厚度(mm)吸水性灰分(%)性能1900.17150-1200.08快速2900.16120-91
21、0.08中速3900.1590-600.08慢速41800.34151-1210.08快速51800.32120-910.08中速61800.3090-600.08慢速46双向纸层析双向纸层析1、两相常为酸碱差异的两相如乙酸乙酯、95%乙醇、6mol/LHCl（8：1：1V/V）为第一相，苯、丙酸、水（100：70：1V/V）为第二相；2、第一相展开后，取出挥发有机溶剂至干，然后可直接放入第二相中层析。举例：大豆异黄酮双向举例：大豆异黄酮双向纸层析分析方法的研究纸层析分析方法的研究47薄层层析技术薄层层析技术一一一一 、概述、概述、概述、概述薄层色谱法（薄层色谱法（ThinLayerChrom
22、atographyThinLayerChromatography，TLCTLC）是把吸附剂平铺在一种载体上成一薄层）是把吸附剂平铺在一种载体上成一薄层作固定相，以不同的溶剂作流动相，靠吸附剂的作固定相，以不同的溶剂作流动相，靠吸附剂的毛细现象，沿着一定方向移动，使样品中的各组毛细现象，沿着一定方向移动，使样品中的各组分，在薄层中的吸附剂和展开剂之间，由于吸附分，在薄层中的吸附剂和展开剂之间，由于吸附与解吸的性质差异而得以相互分离。与解吸的性质差异而得以相互分离。48495051Cabinet喷雾抽气箱525354薄层层析优点薄层层析优点设备简单，操作方便设备简单，操作方便设备简单，操作方便设备
23、简单，操作方便，消耗溶剂和吸附剂小，是，消耗溶剂和吸附剂小，是一种经济的分离方法。一种经济的分离方法。分离操作时间短。分离操作时间短。分离操作时间短。分离操作时间短。一个薄板展开只需十几分钟，一个薄板展开只需十几分钟，而且可以多个样品或不同条件的薄板同时展开，工而且可以多个样品或不同条件的薄板同时展开，工作效率高。作效率高。薄层制作技术简单薄层制作技术简单薄层制作技术简单薄层制作技术简单，根据实验的要求可以方便的，根据实验的要求可以方便的更换吸附剂和制成大小、厚度不一的各种薄层。更换吸附剂和制成大小、厚度不一的各种薄层。适应的样品范围宽适应的样品范围宽适应的样品范围宽适应的样品范围宽，从从ng
24、ng级的微量检出到几十毫级的微量检出到几十毫克的制备量皆很容易实现。样品的性质从极性大到克的制备量皆很容易实现。样品的性质从极性大到非极性化合物皆可适用。非极性化合物皆可适用。55流动相的更换方便流动相的更换方便，各种多元混合溶剂皆可选作展开剂，比高效被相色谱法所能选用的溶剂的范围宽。可充分利用样品中各组分在多元混合溶剂中的分配系数差异，实现高效率分离。一个普通TLC理论板数可达到几百块，有利于一些复杂样品的分离。展开操作技术丰富多样展开操作技术丰富多样，如双向展开、圆形展开、多次展开、旋转展开等，以适用于各种复杂体系样品的分离与制备。56薄层色谱法缺点薄层色谱法缺点（1）实验的重现性差。不同
25、的实验室，不同的操作者，甚至同一操作者的实验条件和结果很难完全重现，定量误差一般510。（2）实验条件和数据的可比性较差。引起误差的原因较多，如薄板的制作技术不良引起的薄层的厚度不均一；薄板的活化，贮放条件不严格引起的板的活度不规范；样品体系复杂等等，展开过程中展开剂的组成变化也是影响展开结果的因素之一。57吸附剂的选择吸附剂的选择硅胶硅胶这是最常用的吸附剂，要求表面孔径在80100，粒度在2040m。硅胶硅胶H为不含粘合剂的硅胶；硅胶硅胶G含13-15的锻石膏(CaSO4.1/2H2O)；硅胶硅胶GF254是在硅胶中加入石膏和荧光指示剂，在波长为254nm的紫外光激发下发出黄绿色荧光，有紫外
26、吸收的物质显色更清晰。0.5的羧甲基纤维素的羧甲基纤维素(CMC)58u氧化铝应当注意氧化铝是一种具有催化活性的吸附刑，有可能引起试样发生一些化学反应，如引起酯水解，醛酯水解，醛酯水解，醛酯水解，醛酮缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮的烯醇异构化酮缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮的烯醇异构化酮缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮的烯醇异构化酮缩合，双键位置迁移，脱氯化氢，酮的烯醇异构化等。所以氧化铝薄板的应用比硅胶板少。59u聚酰胺（腈纶、尼龙）聚酰胺（腈纶、尼龙）把聚酰胺粉铺成薄层板，可用于分离易生成氢键的极性化合物，如酚类（鞣质）、黄酮、酸类（核苷酸、氨基酸）、醇类、醛、酮等。60uDNS-氨基
27、酸的双向聚酰胺薄膜层析氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析u第一向：苯第一向：苯-冰乙酸体系冰乙酸体系u第二向：甲酸第二向：甲酸-水体系水体系u显色：黄绿色荧光（显色：黄绿色荧光（DNS-氨基酸）氨基酸）61u络合薄层络合薄层硝酸银薄层u主要机理是由于C=C键能与硝酸银形成络合物，而饱和的C-C键则不与硝酸银络合。因此在硝酸银薄层上，化台物可由于饱和程度不同而获得分离，如碳原子相近的不饱和醇、酸；u饱和化合物由于吸附最弱而Rf最高，含一个双键的较含两个双键的Rf值高，含一个三键的较含一个双键的Rf值高。u顺式的与硝酸银络合较反式的易于进行，可用来分离顺反异构体。62u薄层板的制作：手工、半自动、全自动、
28、直接购买取硅胶G10g加30ml0.5CMC-Na水溶液，调成均匀糊状物，铺层于空气中晾干后，移至110烘箱活化30min（1051h），置于燥器中备用（可铺可铺成成10cm20cm10cm20cm的板的板8 8块块）6364展开剂的选择方法展开剂的选择方法ABCABCDD四元体系四元体系65uA组分组分通常为展开剂中极性小，比例大，它对样品不溶或微溶，在展开剂中主要是对样品起“输送剂输送剂”的作用。如单独使用，不能使样品的斑点移动。uB组分组分极性比A组分大，能使样品中各组分充分溶解，在展开过程中起“分配剂分配剂”作用。uC组分组分的极性介于A与B溶剂之间，是展开剂的“极极性调节剂性调节剂”
29、，使A和B能够互溶。66uD组分是组分是为改进样品中某些极性特别大的组分在展开中斑点拖尾或在原点不动，而加入强极性溶剂，如酸、碱等。其作用主要是“薄板的活性调节剂薄板的活性调节剂”。在展开剂中，D组分占的比例较小，必须严格控制加入量的准确性。67点样与展开点样与展开u点样时要控制点样量和点样次数。点样时要控制点样量和点样次数。一般：分析时几一般：分析时几到几十到几十微克，制备时几到几十毫克几到几十毫克u点样时，（点样时，（1）样品溶液必须是均一体系，应避免将）样品溶液必须是均一体系，应避免将非均相的混浊溶液点到纸或板上非均相的混浊溶液点到纸或板上。（2）溶液的浓度）溶液的浓度应在应在1左右左右
30、，太稀对加样体积增加，引起斑点扩散。（3）配制样品溶液的溶剂尽量选用易挥发、极性较）配制样品溶液的溶剂尽量选用易挥发、极性较小的溶剂，小的溶剂，样品溶液太稀时可分多次加样。6869（1）展开装置应密闭；（2）保持展开槽内展开剂的蒸气充分饱和，以消除“边边缘效应缘效应”边缘效应边缘效应(edgedffect)：点于同一薄层上同一物质的斑点，在色谱展开过程中，靠近薄层边缘处斑点的Rf值与中心区斑点的Rf值有所不同，此种现象称为边缘效应。70薄层层析的定位薄层层析的定位对展开后的薄板进行定性与定量分析的前提是确认板上各组分的色班或色带的位置，通常称显色。常用的显色方法有紫外荧光法、蒸气显色法和化学显
31、色法等。71薄层色谱显色剂薄层色谱显色剂显色剂显色剂：有硫酸、碘的氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸有硫酸、碘的氯仿溶液、碱性高锰酸钾溶液、磷钼酸等通用显色剂，等通用显色剂，也有根据化合物分类，或特殊官能团设计的专属性显色剂。1碘蒸气对很多化合物显黄棕色。20.5碘的氯仿溶液对很多化合物显黄棕色。3碘碘化钾溶液对很多化合物显黄棕色。碘0.2g，碘化钾0.4g，加水到100m1。45磷钼酸乙醇溶液喷后120烤，还原性物质（多羟基、烯烃、炔烃、醛类等）显蓝色，再用氨水熏，背景变为无色。7273u荧光薄层：u有些化合物本身无色，在紫外灯下也不显荧光或较弱，又无适当的显色剂时u吸附剂中加入荧光物质制成
32、荧光薄层进行层析，薄层板本身显荧光，样品斑点不显，但吸收紫外光形成暗斑。u254nm紫外光激发下显出荧光的，如锰激化的硅酸锌；365nm紫外光激发下发出荧光的，如银激化的硫化锌硫化镐74薄层层析的定性薄层层析的定性薄层色谱分离后的薄层色谱分离后的薄层色谱分离后的薄层色谱分离后的定性分析最可靠的方法定性分析最可靠的方法定性分析最可靠的方法定性分析最可靠的方法还是还是还是还是将样品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有将样品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有将样品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有将样品斑点从吸附剂上洗脱下来，除去溶剂后用有机波谱分析法进行结构分析。机波谱分析法进行结构分析
33、。机波谱分析法进行结构分析。机波谱分析法进行结构分析。75薄层色谱定量分析薄层色谱定量分析u（1）溶剂洗脱）溶剂洗脱分光光度测定法，分光光度测定法，方法的误差在5以内，已成为国内外许多工业产品质量控制的标准化方法。u（2）在板上原位直接定量测定法）在板上原位直接定量测定法。即测定斑点的面积法，误差较大，一般1015之间；或测定斑点光密度法，误差较小，一般510。76薄层层析在天然药物化学中的应用薄层层析在天然药物化学中的应用u1证实两个天然化合物相同或同类；证实两个天然化合物相同或同类；u2测定混合物中组分的数目；测定混合物中组分的数目；u3决定适用于柱层析分离用的溶剂；决定适用于柱层析分离用
34、的溶剂；u4监控柱层析、萃取等分离过程；监控柱层析、萃取等分离过程；u5监控一个反应的进程。监控一个反应的进程。77应用举例：文字色料的薄层色谱检验应用举例：文字色料的薄层色谱检验u确定种类、鉴定成分以确定产地、销售范围u民事案件：伪造、变造文书78圆珠笔油的染料成分检验圆珠笔油的染料成分检验不同种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图不同种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图不同种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图不同种类蓝色圆珠笔油样品薄层色谱图正丁醇正丁醇-乙醇乙醇-水水-36%乙酸乙酸体系体系79第四章常用书写字迹色料的薄层色谱分析第四章常用书写字迹色料的薄层色谱分析第一节薄层色谱分析法概述第二节对纯蓝墨水字
35、迹的薄层色谱分析第三节对蓝黑墨水字迹的薄层色谱分析第四节对红墨水字迹的薄层色谱分析第五节对黑墨水字迹的薄层色谱分析第六节对碳素墨水字迹的薄层色谱分析第七节对签字笔字迹的薄层色谱分析第八节圆珠笔油墨的薄层层析分析第九节黑色签字笔十年发展变化研究第十节黑色笔迹与文件鉴定80分配层析之分配层析之反相硅胶层析反相硅胶层析u所谓反相是指用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。如在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，如甲醇和水的混合物。则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。u以2040 m无定形硅胶（或球形硅胶）为载体，与十十八烷基三氯硅烷八
36、烷基三氯硅烷进行键合制备出C18反相硅胶键合相（也称ODS柱），它可完成高效液相色谱7080的分析任务。此外还有C8、C4、苯基、氰基等。u流动相通常为甲醇/水体系或乙腈/水体系。81C18、C8、ODS、ODS2、RP18填料填料u硅胶基质；高聚物小球基质；氧化铝；氧化锆uODS：Octadecylsilane，十八烷基硅烷u碳载量：色谱柱键全固定相的含碳量。一般碳载量高的，柱容量大，分离极性差异较小的比较好u孔径、比表面积82ODS填料选择指南填料选择指南8384亲水基团疏水基团858687882.10.5离子交换层析离子交换层析u离子交换剂是一种不溶性的高分子化合物，其分子（或其通过化学
37、反应引进）具有解离性离子交换基团，当一定量的水溶液通过交换柱时，能与存在溶液中的阳离子或阴离子物质起交换作用，而这种交换是可逆的。u强（弱）酸型阳离子交换剂SO3H，COOHu强（弱）碱型阴离子交换剂N-(CH3)3X，NH2u亲水性离子交换剂（凝胶离子交换）可用于蛋白、多糖、生物碱的分离。89去离子水是如何制得的？去离子水是如何制得的？90样品样品强酸型阳离子强酸型阳离子酸性、中性化合物酸性、中性化合物强碱性阴离子强碱性阴离子中性化合物中性化合物吸附碱性化合物吸附碱性化合物及两性化合物及两性化合物稀NaOH洗脱酸性化合物酸性化合物912.10.6凝胶层析和亲和层析凝胶层析和亲和层析u亲和层析
38、：亲和层析：是利用生物大分子之间有专一的亲和力专一的亲和力而达到分离纯化的层析方法优点优点：1.纯化过程简单、迅速纯化过程简单、迅速2.分离效率高分离效率高3.实验条件温和实验条件温和缺点缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件吸附剂和建立相应的实验条件2.配基的选择及其与基质的共价结合需配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤要烦琐的操作步骤9293具有专一性亲和力的生物分子对具有专一性亲和力的生物分子对：酶酶底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅酶因子）酶因子）特异性抗原特异性抗原抗体抗体激素激素受体
39、受体DNA互补的互补的DNA或或RNA凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白94应具备的特性：应具备的特性：1.有丰富的可供活化的化学基团，并在温有丰富的可供活化的化学基团，并在温和条件下能与配基共价结合。和条件下能与配基共价结合。2.惰性的，非专一性吸附无或足够小。惰性的，非专一性吸附无或足够小。3.多孔网状结构。多孔网状结构。4.良好的机械性能，具有好的液体流动性。良好的机械性能，具有好的液体流动性。5.有较好的物理和化学稳定性。有较好的物理和化学稳定性。载体的选择载体的选择琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶95应具备的特性：应具备的特性：1.对于欲纯化的生物物质应
40、具有专一亲和性对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性2.必须具备能被修饰的功能基团必须具备能被修饰的功能基团固相化技术：固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于水的固相将配基以共价键连接于不溶于水的固相基质上制成固相化吸附剂基质上制成固相化吸附剂配基的选择配基的选择96亲和法举例亲和法举例亲和层析法分离豌豆凝集素u 原理原理 亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝亲和层析技术利用豌豆凝集素可与葡聚糖凝胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌胶发生特异性结合，再用含葡萄糖的氯化钠溶液将豌豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红豆凝集素洗脱下来。比较豌豆凝集素和杂蛋白对兔红细胞凝集作用的差
41、异来进行鉴定。细胞凝集作用的差异来进行鉴定。 器材器材 1.1.层析柱层析柱2.2.恒温孵育箱恒温孵育箱3.3.反应板反应板971 1）亲和层析分离）亲和层析分离 SephadexG-50装柱，用1mol/LNaCl洗脱液平衡5分钟,加样6滴。加样后立即开始收集洗脱液，每管收集3ml，控制流速1015滴/分钟，待杂蛋白洗脱后，开始换0.2mol/L葡萄糖NaCl洗脱液进行洗脱，每管收集3ml。收集约10管后，用1mol/LNaCl洗脱液平衡柱5分钟，此柱即可再生。982 2）豌豆凝集素生物活性测定）豌豆凝集素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收集
42、液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置37保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结果。99各种层析分离原理及应用领域各种层析分离原理及应用领域层析分类层析分类分离原理分离原理应用领域应用领域吸附色谱吸附能、氢键各种有机化合物的分离、制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分离亲和色谱生化特异亲和力蛋白、抗体、酶分离，生物和医药分析手性色谱立体效应手性异构体分离、药物纯化100各种层析方法分离效能的比较各种层析方法分离效能的比较类型填充剂颗粒直径（um）N有效/t一般气相填
43、充柱毛细管气相层析柱经典柱层析薄层层析不规则硅胶微粒层析柱多孔硅胶微球1300.20.5150755103610250.020.2211231012.10.7 2.10.7 气相色谱气相色谱 GCGC 惰性气体作为流动相，利用分配系数差异，组分在两相间多次（103-106）分配，由于固定相对组分保留能力不同，经过一定的柱长后彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰 。102103可替代可替代Porakak系列系列104105106107108109110111112113固定液的发展带动毛细管柱和气相色谱的发展固定液的发展带动毛细管柱和气相色谱的发
44、展u十二烷基苯磺酸铝u非高聚物，产品稳定u分离范围广,不但可分离弱极性的烷烃、芳烃、酯、酮,尤其对极性较强的有机羧酸有独特的分离能力,可不经衍生直接进样分析u耐老化114GC的优点的优点、高灵敏度：可检出10mg-10克的物质，可作超纯气体、高分子单体的痕迹量杂质分析和空气中微量毒物的分析。、高选择性：可有效地分离性质极为相近的各种同分异构体和各种同位素。、高效能：可把组分复杂的样品分离成单组分。、速度快：一般分析、只需几分钟几十分钟即可完成。、应用范围广：即可分析低含量的气、液体，亦可分析高含量的气、液体，可不受组分含量的限制。、所需试样量少：一般气体样用几毫升，液体样用几微升或几十微升。、
45、设备和操作比较简单仪器价格便宜。115 气相色谱仪气相色谱仪gaschromatographicinstruments岛津GC2010气相色谱仪116气相色谱结构流程气相色谱结构流程1-1-载气钢瓶；载气钢瓶；2-2-减压阀；减压阀；3-3-净化干燥管；净化干燥管；4-4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计; 6-; 6-压力表；压力表；4-4-针形阀；针形阀；5-5-流量计流量计; 6-; 6-压压力表；力表；9-9-热导检测器；热导检测器；10-10-放大放大器；器；11-11-温度控制器；温度控制器；12-12-记录仪；记录仪；载气系统载气系统进样系统进样系统色谱柱色谱柱检测系统检测系
46、统温控系统温控系统117载气系统载气系统u作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯作为气相色谱载气的气体，要求要化学稳定性好；纯度高；价格便宜并易取得；能适合于特定的检测器。度高；价格便宜并易取得；能适合于特定的检测器。u常用的载气有氢气、氮气、氩气、常用的载气有氢气、氮气、氩气、氦气氦气、二氧化碳气、二氧化碳气等等。等等。u载气为什么要净化？应如何净化（净化器）？载气为什么要净化？应如何净化（净化器）？除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质除去载气中的一些有机物、微量氧，水分等杂质不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，不纯净的气体作载气，可导致柱失效，样品变化，氢焰色谱可导致
47、基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定氢焰色谱可导致基流噪音增大，热导色谱可导致鉴定器线性变劣等。一般均采用化学处理的方法除氧，如器线性变劣等。一般均采用化学处理的方法除氧，如用活性铜除氧；采用分子筛、活性碳等吸附剂除有机用活性铜除氧；采用分子筛、活性碳等吸附剂除有机杂质；采用硅胶，分子筛等吸附剂除水分。杂质；采用硅胶，分子筛等吸附剂除水分。118色谱柱色谱柱(分离柱分离柱)色谱柱色谱柱: :色谱仪的核心部色谱仪的核心部件。件。柱材质柱材质: :不锈钢管或玻璃，不锈钢管或玻璃，内径内径3-63-6毫米。长度可根毫米。长度可根据需要确定。据需要确定。柱填料柱填料: :粒度为粒度为60-8060-80或
48、或80-10080-100目的色谱固定相。目的色谱固定相。119120u固定相：固定相：ATSE-30,ATOV-1组成：组成：100%甲基聚硅氧烷甲基聚硅氧烷极性：非极性极性：非极性应用：碳氢化合物应用：碳氢化合物同类型号：同类型号：DB(HP)-1、AC1、SPB-1、CPSIL5、DM-1、RT-1使用温度：使用温度：50300u固定相：固定相：ATXE-60组成：组成：25%氰乙基甲基聚硅氧烷氰乙基甲基聚硅氧烷极性：中极性极性：中极性应用：酯、硝基化合物应用：酯、硝基化合物同类型号：同类型号：DB(HP)-225、AC225使用温度：使用温度：0280固定液使用固定液使用121u固定相
49、：固定相：ATFFAP组成：聚乙二醇组成：聚乙二醇TPA改性改性极性：极极性：极性性应用：酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油应用：酸、醇、醛、酯、腈、酮、基油同类型号：同类型号：DB(HP)FFAP、SP-1000、Supecl-NUKOL、AC20使用温度：使用温度：50250u固定相固定相:AT农残农残号号AT农残农残号号组成：组成：极性：极性：应用：六六六、应用：六六六、DDT等含氯农药拟除虫菊酯类、含磷类农药等含氯农药拟除虫菊酯类、含磷类农药同类型号：同类型号：SPB-608、HP-608使用温度：使用温度：25300122123毛细管柱内径毛细管柱内径u0.53mm具有近似填充柱的负荷量，
50、总柱效则远远超过填充柱。具有近似填充柱的负荷量，总柱效则远远超过填充柱。达到同样的分离度时，达到同样的分离度时，0.53mm大口径柱的分析时间显著快于填大口径柱的分析时间显著快于填充柱。可方便的采用柱上进样或直接进样技术，适合于分析不充柱。可方便的采用柱上进样或直接进样技术，适合于分析不太复杂的样品，是填充柱理想的替代柱。太复杂的样品，是填充柱理想的替代柱。0.32mm柱效稍低于柱效稍低于0.25mm常规柱，负荷量大于常规柱的常规柱，负荷量大于常规柱的60%，用特制注射针可做柱上进样。，用特制注射针可做柱上进样。0.25mm最常用的内径规格。有较高的柱效，负荷量较低，必最常用的内径规格。有较高
51、的柱效，负荷量较低，必须分流进样或无分流进样。用于复杂多组份样品分析。须分流进样或无分流进样。用于复杂多组份样品分析。0.20mm柱效高柱效高,负荷量低，流失较小，适合与负荷量低，流失较小，适合与质谱质谱等灵敏检测等灵敏检测器联用。器联用。124毛细管柱长度毛细管柱长度u512m短柱：分离少于短柱：分离少于10个组份（不包含难分离物个组份（不包含难分离物质对）的简单样品。质对）的简单样品。2530m中长柱：分离中长柱：分离1050个组份的样品。个组份的样品。50m长柱：分离大于长柱：分离大于50个组份或包含有难分离物质对个组份或包含有难分离物质对的复杂样品。的复杂样品。125膜膜厚厚u0.10
52、.2um薄液膜薄液膜低负荷量，高温下流失较小，适合于高沸点化合物的低负荷量，高温下流失较小，适合于高沸点化合物的分析，适于配高灵敏检测器。分析，适于配高灵敏检测器。0.250.33um标准标准液厚液厚一般商品柱的标准液膜。一般商品柱的标准液膜。0.55.0um厚液膜厚液膜较高的样品负荷量，在高温下流失较大，适于分析低较高的样品负荷量，在高温下流失较大，适于分析低沸点样品。沸点样品。126检测器检测器127u热导池检测器的检测原理是基于不同组分与载气之间有不同的热导系数。u当经色谱柱分离后的组份被载气带入热导池中由于组份和载气的热传导率不同，因而使热敏元件温度发生变化，并导致电阻发生变化导致电阻
53、发生变化，从而导致电桥不平衡，输出电压信号，此信号的大小与被测组份的浓度成函信号的大小与被测组份的浓度成函数关系数关系，再由记录仪或色谱数据处理机进行换算并记录下来。热导池检测器的工作原理（热导池检测器的工作原理（TCD）128热敏电阻丝R参热敏电阻丝R测载气+组份参比池测量池纯载气构造灵敏度低灵敏度低（不小于（不小于3000mvml/mg）常用于填充柱和浓度较大时常用于填充柱和浓度较大时129氢焰电离检测器的工作原理（氢焰电离检测器的工作原理（FID） 目前认为火焰中的电离不是热电离而是化学电离，即有机物目前认为火焰中的电离不是热电离而是化学电离，即有机物在火焰中发生自由基反应而被电离。在火
54、焰中发生自由基反应而被电离。 化学电离产生的正离子化学电离产生的正离子( CHO+、H3O+)和电子和电子(e)在外加在外加150300v直流电场作用下向两极移动而产生微电流。经放大后，直流电场作用下向两极移动而产生微电流。经放大后，记录下色谱峰。记录下色谱峰。 氢火焰电离检测器对大多数的有机化合物有很高的灵敏度。氢火焰电离检测器对大多数的有机化合物有很高的灵敏度。但对在氢火焰中不电离的无机化合物例如但对在氢火焰中不电离的无机化合物例如CO、CO2、SO2、N2、NH3等和电离差的有机化合物等和电离差的有机化合物CCl4则不能检测。则不能检测。130气相色谱为什么常要进行程序升温？气相色谱为什
55、么常要进行程序升温？u提高柱温可以提高传质速率，提高柱效，但柱温过高提高柱温可以提高传质速率，提高柱效，但柱温过高又会使组分间分离度减小。又会使组分间分离度减小。u柱温的变化影响柱的选择性和柱效。柱温的变化影响柱的选择性和柱效。u宽沸程混合物，选用程序升温法宽沸程混合物，选用程序升温法u可以通过升温控制物质分离效果，例如维持低温使易可以通过升温控制物质分离效果，例如维持低温使易挥发物先进入柱子，再逐渐升温使难挥发物进入柱子，挥发物先进入柱子，再逐渐升温使难挥发物进入柱子，从而达到两类物质的有效分离。从而达到两类物质的有效分离。131132为什么要对气相色谱柱进行为什么要对气相色谱柱进行“老化老
56、化”？u目的有两个，一是为了彻底除去填充物中的残余溶剂（包括水）目的有两个，一是为了彻底除去填充物中的残余溶剂（包括水），和某些挥发性杂质。二是促进固定液均匀的、牢固分布在担，和某些挥发性杂质。二是促进固定液均匀的、牢固分布在担体的表面上体的表面上u一般一段时间不用柱子，再用时，均要对柱子进行老化，根据一般一段时间不用柱子，再用时，均要对柱子进行老化，根据个人习惯和需要老化个人习惯和需要老化224h（一般（一般20h，极性长，极性长/非极性短）。非极性短）。u频繁老化柱子，对柱子寿命有影响。频繁老化柱子，对柱子寿命有影响。133气相色谱检测中样品的衍生化有何目的？气相色谱检测中样品的衍生化有何
57、目的？u举例：脂肪酸衍生化：高沸点脂水解或皂化，然后脂肪酸或脂肪酸盐再与甲醇或乙醇反应u降低沸点降低沸点u增加高温稳定性增加高温稳定性u减少损失和保留减少损失和保留134气相色谱我们还必须掌握的细节气相色谱我们还必须掌握的细节u载气为什么要净化？u稳压阀用途？u先通载气还是先加热柱子？u混合气体平均沸点和进样汽化温度控制？u气相色谱仪要放置在通风环境？u135Agilent7890A/5975C气质联用仪谱库：NIST05标准谱库19万张，化学结构式库：16万张136裂解气相色谱红外光谱联用仪裂解器：PYROJECTORII气相色谱：Agilent6890红外光谱：Nicolet5700澳大利
58、亚SGE公司美国安捷伦公司美国热电公司137气相色谱在挥发油成分分析中的应用气相色谱在挥发油成分分析中的应用138挥发油含量检测挥发油含量检测139挥发油指纹图谱建立挥发油指纹图谱建立140141气质联用鉴定玛咖挥发油中的主要成分气质联用鉴定玛咖挥发油中的主要成分1421432.10.8HighPerformanceLiquidChromatography2.10.8HighPerformanceLiquidChromatography，HPLCHPLC144高效液相色谱法高效液相色谱法145高效液相色谱最典型的特征：高效液相色谱最典型的特征：使用内径使用内径28mm的细口径不锈钢色谱柱，的细
59、口径不锈钢色谱柱，平均直径小于平均直径小于50um的各类型填充颗粒均匀填的各类型填充颗粒均匀填充，使分离效率提高；采用很高的入口压力充，使分离效率提高；采用很高的入口压力（150400大气压），使流动相的速度增高，大气压），使流动相的速度增高，线速度一般在线速度一般在0.15cm/s(0.01100ml/min)之之间，甚至更高一些；并通过各种高灵敏度的检间，甚至更高一些；并通过各种高灵敏度的检测器在线检测（紫外检测器可达测器在线检测（紫外检测器可达0.01ng），以），以达到高速高效分离分析或制备纯化各种化合物达到高速高效分离分析或制备纯化各种化合物的液相柱层析方法。的液相柱层析方法。146
60、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：与经典液相色谱相比有以下优点：u速度快通常分析一个样品在1530min，有些样品甚至在5min内即可完成。u分辨率高可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。u灵敏度高紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。u色谱柱可反复使用用一根色谱柱可分离不同的化合物。u样品量少，容易回收样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分。147进样口检测器色谱图色谱柱溶剂泵混合器148149150WatersACQUITYUPLC系统系统151高效液相的基本操作步骤高效液相的基本操作步骤u1.过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。u2.对抽滤后的流动相进行
61、超声脱气10-20分钟(250ml)。u3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。u4.进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。152u5.有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。u6.调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过200bar。选用合适的流速和所需波长，走基线，观察基线的情况u7.进样和进样后操作。进样，所有的样品均需过滤；全部样品内成分在流动相下出峰后，继续走一段基线，用10%甲醇和纯甲醇分别洗掉柱内杂质。u8关机时，先关计算机，再关液相色谱。u9.登记。153气
62、相色谱气相色谱PK高效液相色谱高效液相色谱1.分子量应用范围：气相分子量应用范围：气相11001000；液相；液相1005000100002.2.几乎所有不能用气相分析的样品；以及气相可以分析的部分样品几乎所有不能用气相分析的样品；以及气相可以分析的部分样品3.3.液相色谱流动相多样，可以通过选择流动相和固定相使样品得到液相色谱流动相多样，可以通过选择流动相和固定相使样品得到良好的分离良好的分离4.4.比气相更方便制备，尤其是那些热敏的活性物质比气相更方便制备，尤其是那些热敏的活性物质1.液相条件的摸索比较复杂液相条件的摸索比较复杂2.2.液相所需流动相比较贵，而且也不环保液相所需流动相比较贵
63、，而且也不环保3.3.高效液相色谱价格较贵，操作要更加规范，技术要求更高高效液相色谱价格较贵，操作要更加规范，技术要求更高154高效液相色谱的家当高效液相色谱的家当1、过滤时为什么滤膜光面向上？2、HPLC中滤膜的选择155u亲水性样品：选用亲水膜片，对水有亲和力，适合过滤水为基质的溶液。可用的滤膜有：混合纤维素酯（MCE）、聚醚砜（PES）、亲水PVDF(聚偏氟乙烯）、亲水PTFE（聚四氟乙烯）、尼龙66等。u强腐蚀性有机溶剂：一般采用疏水性膜，如PTFE、聚丙烯（PP）等材质的滤膜。u蛋白溶液：低蛋白吸附的滤膜，如PVDF滤膜。u离子色谱：通常认为PES滤膜比较适合低无机离子的溶液的过滤。
64、156u如果选择针式过滤器，还要考虑样品的体积u通常样品量小于2ml时，选用4mm直径的微型过滤器；u样品量在2-10ml之间，选用13mm直径的过滤器；u当样品量大于10ml时，选用25mm直径的针式过滤器。u不要使用小于10cc的注射器，因为小体积柱管可能会使压力超过上限，导致滤膜的破坏或者人身伤害。u仅限于实验室专用,一次性使用，不可再生。u应弃去部分开头的滤液，体积约为过滤器的死体积，以25mm为例，大概弃去前1ml滤液；或者用1至2ml的溶液预清洗过滤器。157通用型在线脱气机蓝盖瓶HPLC专用超声波清洗器158针头过滤器159160161自动进样自动进样100100样品盘样品盘/
65、/机器手机器手/ /自动洗针自动洗针机械手样品盘162琳琅满目的液相色谱柱，我们如何选择？琳琅满目的液相色谱柱，我们如何选择？分析还是制备？分析还是制备？极性如何？极性如何？样品数量？样品数量？分离难度？分离难度？重现性要求？重现性要求？pH值要求如何？值要求如何？有无前人的经验？有无前人的经验？口袋里面的钱有多少？口袋里面的钱有多少？163类型性质色谱分离方式烷基烷基C8、C4非极性非极性反相、离子对反相、离子对烷基烷基C18非极性非极性反相、离子对反相、离子对苯基苯基非极性非极性反相反相芳硝基芳硝基弱极性弱极性反相或正相反相或正相氰基氰基极性极性正相（反相）正相（反相）氨基氨基极性极性正相
66、（反相、阴离子交换）正相（反相、阴离子交换）164Protein-PakTM高分辨离子交换柱高分辨离子交换柱Protein-PakTMHR离子交换柱:填料:刚性亲水性的聚甲基丙烯酸酯孔径:1000（100纳米，0.1m）优点:非特异性吸附小，扩散小165166HPAEu高效阴离子交换色谱测定蜂蜜中葡萄糖和果糖的研究高效阴离子交换色谱测定蜂蜜中葡萄糖和果糖的研究uCarboPacTMPAl0(4mm250mm)阴离子交换分离柱u脉冲安培检测器：电解池内有电解反应的发生u选择18mmol/LNaOH为淋洗液u单糖在碱性条件下阴离子化单糖在碱性条件下阴离子化异构化(烯醇化反应)u流速1.0mL/mi
67、nu总时间20minu能较好地分离葡萄糖、果糖和蔗糖。天然蜂蜜中蔗糖含量非常少，利用此方法可以鉴别天然蜂蜜的真伪。167分析柱、半制备柱、制备柱流速转化分析柱、半制备柱、制备柱流速转化uspeed=制备柱内(半)径的平方/分析柱内(半)径的平方1分析柱填料的粒径/制备柱填料的粒径1.5*1.5/0.23*0.23*1ml/min*5um/10um=21.2ml/min168柱温箱色谱试剂169170让人流口水的一台让人流口水的一台HPLC高效液相色谱仪高效液相色谱仪-配备三个检测器，分别是紫外检测器、电导检测器、示差折光检测器。此外有二极管阵列检测器、荧光检测器、电化学检测器、蒸发激光散射检测
68、器171u紫外检测器是紫外检测器是高压液相色谱仪常用的一种检测器。利用试样组分吸收紫外线，依据紫外线吸收光谱进行分析。有两种类型的紫外检测器，一是固定波长（254nm）紫外检测器，一是可变波长紫外检测器。用这种检测器时，流动相必须在所使用的波长处无吸流动相必须在所使用的波长处无吸收收。紫外检测器主要用于检测芳烃，含共轭双键和生检测芳烃，含共轭双键和生色团的试样组分色团的试样组分。由于结构简单、操作方便、灵敏度高（10-9g/ml），且不受温度、流量等因素的影响，并能用于梯度洗脱，因而在液相色谱中被广泛采用。是是HPLC的主要耗材之一，有时间限制！的主要耗材之一，有时间限制！价格较贵！价格较贵！
69、172PDA二极管阵列检测器二极管阵列检测器u光电二极管阵列检测器(Photo-DiodeArray)检测器或DAD(DiodeArrayDetector)检测器，上世纪80年代发展起来的新型紫外检测器。u紫外检测器只能用单波长检测,而二极管能同时进行全波长检测。也就是说紫外检测器的谱图是二维的,而二极管检测器的谱图是三维的。u分析物质中有多个化合物共存，且紫外特征差异较大，PDA就更有优势。173174175示差检测器示差检测器u示差检测器是连续检测样品流路与参比流路间液体折光指数差值的检测器，是根据折射原理设计的u示差折光检测器对高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等都能够检测。在凝胶色谱中示差折
70、光检测器是必不可少的。另外在制备色谱中也经常用到。还适用于流动相紫外吸收本底大，不适于紫外吸收检测的体系。u示差检测器属于通用性检测器，如果选择合适的溶剂，几乎所有的物质都可以进行检测。u不能用于梯度洗脱，灵敏度低，检测限1mg/ml0.1mg/ml176u电导检测器（electrolyticconductivitydetector,ELCD）：基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。电导检测器是离子色谱中必备的检测器。u荧光检测器（fluorescencedetector，FD）：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和
71、波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。有的有机化合物可与发荧光物质反应衍生化后检测。灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。177蒸发光散射检测器（蒸发光散射检测器（evaporativelight-scatteringdetector,ELSD）u色谱柱流出液导入雾化器，被载气色谱柱流出液导入雾化器，被载气雾化成微细液滴，液滴通过加热漂雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射上产生光散射，
72、光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。光并通过光电倍增管转变成电信号。u因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。178179进样器高压泵流动相色谱柱检测器数据处理化学工作站化学工作站180何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？同之处？在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成或浓度配比，称为梯度洗提是改进液相色谱分离的重要手段梯度洗提与气相色谱中的程序升温类似，
73、但是前者连续改变的是流动相的极性、pH或离子强度，而后者改变的温度。程序升温也是改进气相色谱分离的重要手段181柱子柱压高，被污染了怎么办？柱子柱压高，被污染了怎么办？1、清洗（依据柱子的耐受程度）：甲醇、乙腈、5%甲醇、水、25%异丙醇异丙醇-乙腈溶液乙腈溶液、异丙醇（粘度大、低流速）、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷；DMF-二甲基甲酰胺或DMSO-二甲基亚砜与水1:1；10%甲醇水（含0.1%磷酸）、90%甲醇水（含0.1%磷酸）；10%、50%、100%酸性乙腈182柱子柱压高，被污染了怎么办？柱子柱压高，被污染了怎么办？2、预制柱：更换、清洗、超声1min（接在柱后洗脱）3、反冲
74、：低速4、拆柱：拆掉、刮掉、补上新填料、压实5、换柱（配备预制柱）183实用高效液相色谱法的建立实用高效液相色谱法的建立美美L.R.森德森德尔尔LloydR.Snyder等著；张玉奎等译等著；张玉奎等译HPLC方法的建立方法的建立184掌握要分析的化合物的基本性质掌握要分析的化合物的基本性质185如何根据化合物的pKa值来选择流动相的pH值？uC18柱，较强保留u如果是酸性化合物的话，建议pH值大于pKa值2左右，保证目标化合物为离子状态，更容易被洗脱。当然了，这跟化合物的性质有很大关系，有些化合物本来在C18上面保留不是很强，这时不调pH值也没关系。u如果是碱性化合物的话，pH值应小于pKa
75、2左右。uC18，保留较弱。调节pH在pKa值附近，尽量让化合物呈分子状态。186分离前要考虑很多问题！分离前要考虑很多问题！u定量分析？u一种不希望发现物质的检出？u未知样品组分的确认？u是否有必要检测出所有样品的化学成分？u实验室有哪些HPLC设备？色谱柱能否恒温？能否做梯度洗脱？该设备上建立的方法能否得到推广和认可？u分离方法是不是还要应用到液质检测？187样品的预处理！样品的预处理！很多样品在进很多样品在进HPLC前要经过预分离，除前要经过预分离，除去干扰物，浓缩样品，或消除去干扰物，浓缩样品，或消除“柱杀手柱杀手”188首次首次HPLC分离的较好试验条件分离的较好试验条件189主要主
76、要HPLC方法的特性方法的特性190u离子对试剂是将一种（或多种）与溶质离子电荷相反将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子的离子（对离子 或反离子）加到流动相中使其与溶质或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配之间进行分配。u一般适用所有色谱固定相，流动相含水至少达10，否则就有产生沉淀的危险（特别是在使用乙腈的情况下）。u当使用长链的离子对试剂时，如十六烷基硫酸铵或十二烷基硫酸钠，色谱柱将选用反相色谱柱。191较离子交换色谱，离子对色谱的优点在于：u缓冲液制备简单；u碳链长度选择众多，可
77、用于增加保留时间、改善分离性质，提高分离效率；u同时分离离子化和非离子化分析物；u分析结果重现性极好；u改善峰形192193u酸碱物质在高效液相中的保留性能u消除硅醇基-碱作用的三乙胺等保护剂u缓冲溶液的使用u高pH值对高效液相色谱柱寿命影响较大u封端色谱柱对生物碱保留的影响194举例：高效液相色谱方法的应用举例：高效液相色谱方法的应用蜜柑草蜜柑草槲皮素（黄酮类化合物）槲皮素（黄酮类化合物）195岛津岛津LC-20AT紫外检测器紫外检测器196ODS柱柱甲醇甲醇-0.4%磷酸磷酸检测波长检测波长360197简单的样品前简单的样品前处理！处理！198标准曲线标准曲线稳定性试验稳定性试验精密度试验
78、精密度试验199重现性试验重现性试验回收率试验回收率试验200u精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用相相对标准偏差对标准偏差表示（即RSD）。精密度包含重复性、中间精密度和重现性。u重复性：在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度，称为重复性。取同一批次样品，同一方法平行制备6份，分别测定含量计算6份的RSD（一般要求（一般要求5%）。）。u中间精密度：在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同时间由不同分析人员用不同设备不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。操作方法：取三批样品，在同一试验室，与不同日期，不同人员，不同仪
79、器分别检测含量，三批样品分别对比检验结果的RSD。u重现性：在不同实验室，不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。法定标准采用的分析方法，进行重现性试验。故我们在进行药品质量研究时不需验证。201相对标准偏差（相对标准偏差（RSD）=标准偏差（标准偏差（SD）/计算结计算结果的算术平均值（果的算术平均值（X）*100%202uA、B两组各有6位学生参加同一次语文测验:uA组的分数为95、85、75、65、55、45uB组的分数为73、72、71、69、68、67u这两组的平均数都是70，但A组的标准差为18.71分，B组的标准差为2.36分，说明A组学生之间的差距要比B组学生之间的差距大
80、得多。203u检测限：3倍噪音u定量限：10倍噪音，定量限范围做精密度试验u线性范围、标准曲线、线性相关系数999u目标浓度204三、生化分离介质三、生化分离介质u生化分离介质应具备的基本条件u粒度适宜及粒径分布均匀的微球生化专用5350m大孔吸附150590m琼脂糖45165m聚苯乙烯系列530m粒径过细，增加柱压，影响流速；粒径均匀，分辨率高，重复性好，分离峰对称205生化分离介质应具备的基本条件生化分离介质应具备的基本条件u介质要具有与生物大分子的相容性，而无非特异性吸附尤其对于常用的分子筛型凝胶过滤保持介质的高分离容量，延长使用寿命206生化分离介质应具备的基本条件生化分离介质应具备的
81、基本条件u具有适当的孔径及孔分布：利于传质u具有优良的化学稳定性：稳定的功能基团和食品、药品安全u优良的物理机械稳定性：清洗、消毒和再生207生化分离介质应具备的基本条件生化分离介质应具备的基本条件u要有比较宽放的pH稳定范围SephadexG10pH操作范围：213SephadexG200pH操作范围：210Sepharose6BpH操作范围：49SepharoseCL-2BpH操作范围：313208与生化分离介质相关的概念与生化分离介质相关的概念u交联剂和交联度含两个以上功能基团的单体氯代环氧丙烷二乙烯基苯209生化分离介质的分类生化分离介质的分类u天然多糖类纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖
82、、魔芋葡甘聚糖等壳聚糖、魔芋葡甘聚糖等丰富的羟基丰富的羟基水溶性、种类繁多、回收率高水溶性、种类繁多、回收率高较软，受压力影响大，通透性差。较软，受压力影响大，通透性差。u合成高聚物类：苯乙烯、丙烯酸系列；聚乙烯醇系列u无机物类：多孔硅胶、多孔玻璃、金属氧化物210魔芋葡甘聚糖魔芋葡甘聚糖u以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化以魔芋葡甘聚糖凝胶为载体亲和层析分离纯化猪血猪血SODu魔芋葡甘聚糖作为铜金属螯合亲和层析的载体u与sephadexG200比较抗碱性稍差u魔芋葡甘聚糖魔芋葡甘聚糖DEAE阴离子交换介质阴离子交换介质uDEAE:二乙胺基乙基，弱碱性叔胺基团，中心N原子带有正电荷，可以
83、吸附负离子，具有离子交换性能。211葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G系列系列SephadexGu经典的葡聚糖和环氧丙烷偶联介质，拥有极高的流速u多种不同的分离范围，提供了广泛的选择性。212琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶Sepharose2B/4B/6Bu偶联琼脂糖介质，非特异性吸附低，回收率高；偶联琼脂糖介质，非特异性吸附低，回收率高；u分离范围广泛；分离范围广泛；u适合分离分子量大小差异大，而对分辨率要求不高的适合分离分子量大小差异大，而对分辨率要求不高的样本。样本。213SephadexLH-20交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶u葡聚糖凝胶是通过表氯醇（葡聚糖凝胶是通过表氯醇（氯代环氧丙烷氯代环氧丙烷）交联多个
84、）交联多个葡聚糖得到的（葡聚糖凝胶葡聚糖得到的（葡聚糖凝胶G系列）。通过羟丙基化系列）。通过羟丙基化将葡聚糖凝胶将葡聚糖凝胶G转化为可在有机溶剂中溶胀的葡聚糖转化为可在有机溶剂中溶胀的葡聚糖凝胶。这时的产品为葡聚糖凝胶凝胶。这时的产品为葡聚糖凝胶LH-20或或LH-60。214SephadexLH-20作用机理作用机理u以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用(在反相溶在反相溶剂中剂中)。u凝胶过滤作用：大分子的化合物保留弱，先被洗脱下凝胶过滤作用：大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。来，小分子的化合物保留强，最后出柱。u使用
85、反相溶剂洗脱，葡聚糖凝胶使用反相溶剂洗脱，葡聚糖凝胶LH-20对化合物还起对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。u使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。215SephadexLH-20特点特点1、适合用有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济地大、适合用有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济地大规模制备各种天然产物；规模制备各种天然产物；2、兼具过滤、分配色谱及吸附层析的特性，分离结构非、兼具过滤、分配
86、色谱及吸附层析的特性，分离结构非常相近的分子；常相近的分子；3、载量高达、载量高达300mg/ml，极少需要再生，分离效果十几，极少需要再生，分离效果十几年不变。年不变。216SepharoseCL-2B交联琼脂糖凝胶交联琼脂糖凝胶u性状：白色微球,无嗅、无味凝胶类型：反复交联(2%交联度琼脂糖，2,3二溴丙醇)，化学与物理性质更加稳定，特别适合含有机溶剂的特别适合含有机溶剂的分离，能承受较强的在位清洗，分离，能承受较强的在位清洗，可以高温灭菌可以高温灭菌，流速，流速明显高于传统的琼脂糖凝胶。明显高于传统的琼脂糖凝胶。粒径：60-200m工作pH值：3-13操作温度：4-40分离范围：70,0
87、00-401070,000-40106 6 保存条件：4-8应用：蛋白、大分子复合物、病毒、核酸、多糖、DNADNA、核糖体及亚基、核糖体及亚基、核糖体及亚基、核糖体及亚基的分离、分子量测定等217218快流速琼脂糖凝胶快流速琼脂糖凝胶Sepharose4FF/6FFu高度偶联的琼脂糖凝胶，大大加强了机械性能，快流高度偶联的琼脂糖凝胶，大大加强了机械性能，快流速，适合工业规模生产；速，适合工业规模生产；u经去电荷处理，非特异性吸附极低，样品回收率高；经去电荷处理，非特异性吸附极低，样品回收率高；u极高的化学稳定性，可用多种促溶剂、有机溶剂操作极高的化学稳定性，可用多种促溶剂、有机溶剂操作和和1
88、-2mol/LNaOH在位清洗在位清洗219离子交换葡聚糖凝胶离子交换葡聚糖凝胶DEAESephadexA-25等等u葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物。网状结构和离子交换功能基团的多糖衍生物。u亲水性强、不会引起生物分子的变性与失活，母链对亲水性强、不会引起生物分子的变性与失活，母链对蛋白质、核酸及其他生物分子的非特异吸附能力小的蛋白质、核酸及其他生物分子的非特异吸附能力小的特性。特性。u能引入大量活性基团而骨架不被破坏，交换容量很大，能引入大量活性基团而骨架不被破坏，交换容量很大，外形呈球形，装
89、柱后，流动相在柱内流动的阻力较小，外形呈球形，装柱后，流动相在柱内流动的阻力较小，流速理想。流速理想。220离子交换琼脂糖凝胶离子交换琼脂糖凝胶医药工业精细分离纯化医药工业精细分离纯化uQ-SepharoseH.P.uSP-SepharoseH.P.uQ/DEAE-SepharoseCL-6B弱阴离子交换剂弱阴离子交换剂uSP/CM-SepharoseCL-6B弱阳离子交换剂弱阳离子交换剂uQ/DEAE-SepharoseFFuSP/CM-SepharoseFF221疏水层析填料疏水层析填料u疏水作用层析（HIC）原理：根据分子表面疏水性差异来分离蛋白质、多肽等生物大分子。u蛋白质三维结构空间
90、排列很容易受到外界环境影响，从有序到无序，例如盐析可以让蛋白失活；222疏水层析填料疏水层析填料u适度疏水性介质+含盐的水溶液体系，可让蛋白等大分子吸附在疏水性介质上；u蛋白质的四级结构：亲水外表，疏水核心；u高盐破坏有序排列，疏水区域增加，与疏水性介质结合紧密；降低盐浓度，疏水作用减少，被洗脱；u不同蛋白，疏水作用有差异，用于分离目标蛋白和杂蛋白。223疏水层析介质种类？疏水层析优点？疏水层析介质种类？疏水层析优点？224亲和层析填料亲和层析填料产品应用Ni-SepharoseFF纯化可与金属作用的蛋白、肽类、纯化可与金属作用的蛋白、肽类、核苷酸核苷酸BlueSepharose6FF纯化干扰
91、素、纯化干扰素、2-巨球蛋白、凝血巨球蛋白、凝血因子、需要核苷酸辅助的酶因子、需要核苷酸辅助的酶Benzamidine-Sepharose6B 纯化尿激酶、胰蛋白酶纯化尿激酶、胰蛋白酶Trypsin-Sepharose4B纯化胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶纯化胰蛋白酶抑制剂、抑肽酶Glutathione-Sepharose4B羧端含谷胱甘肽羧端含谷胱甘肽S-转移酶重组融转移酶重组融合蛋白或依赖合蛋白或依赖S-转移酶或谷胱甘转移酶或谷胱甘肽的蛋白肽的蛋白Heparin-SepharoseFF纯化抗凝血酶纯化抗凝血酶、凝血因子、脂、凝血因子、脂蛋白、脂酶、蛋白合成因子、激蛋白、脂酶、蛋白合成因子、激素、干扰素素、干扰素225学习动物精神学习动物精神u11、机智应变的猴子：工作的流程有时往往是一成不变的，新人的优势在于不了解既有的做法，而能创造出新的创意与点子。一味 地接受工作的交付， 只能学到工作方法 的皮毛，能思考应 变的人，才会学到 方法的精髓。 226学习动物精神学习动物精神u12、善解人意的海豚：常常问自己：我是主管该怎么办才能有助于更好的处理事情的方法。在工作上善解人意， 会减轻主管、共 事者的负担，也 让你更具人缘。227
