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1、血清谷丙转氨酶活性的测定（改良赖氏法）1丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n【目的要求】【目的要求】n n1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。n n2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。n n3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。2丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n【实验原理】【实验原理】n n血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37、pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：3丙氨酸氨基转移酶ALT测定生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的生成的丙酮酸可与起终止和显色作用的2,42,4二硝基苯肼发生加二硝基苯肼发生加成反应，生成丙酮酸成反应，生成
2、丙酮酸-2,4-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境中二硝基苯腙，进而在碱性环境中生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围生成红棕色的苯腙硝醌化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，亦即与内与丙酮酸的生成量，亦即与ALTALT活性的高低成正比关系。活性的高低成正比关系。据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过据此与同样处理的丙酮酸标准液相比较，便可算出或通过标准曲线查出血清中标准曲线查出血清中ALTALT的活性。的活性。4丙氨酸氨基转移酶ALT测定 尽管基质液中余下的尽管基质液中余下的a-a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测
3、定结果，但因其量不多，加之对硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。用连续监测法的单位使用赖氏法。19811981年全国常规生化检年全国常规生化检验方法学术
4、讨论会认为赖氏法测定验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALTALT活性较为合理，全活性较为合理，全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。 5丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n取干净试管取干净试管1212支，按下表所示标号，要求各支，按下表所示标号，要求各S S管和管和U U管进行双管平行操管进行双管平行操作。先做对照管和测定管，在作。先做对照管和测定管，在30min30min保温期间再做空白管和标准管。保温期间再做空白管和标准管。 6丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n【实验结果】【实验结果】【实验结果】【实验结果】n n1.1.赖氏法测定赖氏法测定ALTALT
5、的标准曲线的标准曲线( (即计量反应曲线即计量反应曲线) ) 在坐标纸上以上表中在坐标纸上以上表中AnAnA 0A 0之值为纵坐标，相应之值为纵坐标，相应的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏的酶活性的卡门氏单位为横坐标作图，即得赖氏法测定法测定ALTALT的标准曲线的标准曲线n n2.2.标本中标本中ALTALT活性结果活性结果n n查标准曲线查标准曲线 利用测定所得的吸光度结果利用测定所得的吸光度结果(AU(AUAB)AB)，便可从标准曲线上查得标本的，便可从标准曲线上查得标本的ALTALT结果结果n n计算计算 将实验测得的将实验测得的AUAUAB AB 、AS AS 代入下面计代入
6、下面计算公式，即可算得标本中算公式，即可算得标本中ALTALT活性活性n n 7丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n【方法评价【方法评价【方法评价【方法评价 】n nALTALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（活性测定主要有两类。一是卡门氏（KarmanKarman）分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如下：下： n n由于由于NADHNADH在波长在波长340nm340nm处有特异吸收峰，因此处有特异吸收峰，因此ALTALT的活性可通过的活性可通过NADHNADH的减少量，亦即通过的减少量，亦即通过340nm340nm吸光吸光度的减少量间接作出定量测
7、定。这一方法特异性、度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶准确性高。但是此法除要加入待测酶ALTALT的底物外，的底物外，还需要加入指示酶还需要加入指示酶LDHLDH及其辅酶及其辅酶NADHNADH，又需用紫外，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。8丙氨酸氨基转移酶ALT测定 二是比色测定法，如：金氏法（二是比色测定法，如：金氏法（KingKing法）、穆氏法（法）、穆氏法（Mohun Mohun 法）法）和赖氏法（和赖氏法（Reitman-FrankelReitman-Frankel法）。其原理、
8、试剂、操作步骤及作用温度法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：等完全相同。不同之处在于作用时间：KingKing法法60min 60min ，MohunMohun法和法和 Reiman Reiman法法30min30min。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。因此它们的单位定义和标准曲线制备也不同。KingKing法单位定义法单位定义是：每是：每1ml1ml血清在血清在3737条件下与底物作用条件下与底物作用60 min60 min，生成，生成1mol1mol丙酮酸称为丙酮酸称为一个单位。一个单位。 Mohun Mohun 法单位定义是：每毫升血清在法单位
9、定义是：每毫升血清在pH=7.4pH=7.4，3737条件下与条件下与底物作用底物作用30 min30 min，每生成，每生成2.52.5微克丙酮酸为微克丙酮酸为1 1单位。赖氏法没有制定自身的单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。1 1个卡门个卡门氏单位的定义是：在温度氏单位的定义是：在温度2525，pH7.4pH7.4，波长，波长340nm340nm，光径，光径1cm1cm的条件下，的条件下，1ml1ml血清使血清使NADHNADH的吸光度下降的吸光度下降0.0010.001的转氨酶活性。可
10、见卡门氏单位不是用的转氨酶活性。可见卡门氏单位不是用物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单物质的量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算位的定义条件代入国际单位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：关系：1 1卡门氏单位卡门氏单位=0.4821 IU/L(25)=0.4821 IU/L(25)，便可将卡门氏单位兑换成国际，便可将卡门氏单位兑换成国际单位。单位。9丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n改原赖氏法的反应温度改原赖氏法的反应温度(40(40改为改为37)37)和底物浓度和底物
11、浓度( (改为改为低浓度低浓度) )的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法色法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较为一致，能较好反映酶的真实活性。较为一致，能较好反映酶的真实活性。n n由于赖氏法设计的底物浓度由于赖氏法设计的底物浓度, ,如如a-a-酮戊二酸不足，反应速酮戊二酸不足，反应速度只能达到最大速度的度只能达到最大速度的65%65%；显色剂；显色剂2,4-2,4-二硝基苯肼的用二硝基苯肼的用量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温量只及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min30min
12、的酶促反应的酶促反应后，新生成的丙酮酸和未用完的后，新生成的丙酮酸和未用完的a-a-酮戊二酸存在着无法人酮戊二酸存在着无法人为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重为控制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。现性较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。10丙氨酸氨基转移酶ALT测定n n【临床意义】【临床意义】【临床意义】【临床意义】n n肝细胞中含肝细胞中含ALTALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，受损伤时，ALTALT即大量释放入血液，致使血清中即大量释放入血液，致使血清中ALTALT活
13、性增高。测定活性增高。测定ALTALT是检查肝功能的重要指标是检查肝功能的重要指标之一。之一。ALTALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、肝硬化、性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性黄慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。可引起转氨酶活性升高。n n【思考题】【思考题】【思考题】【思考题】n n 1. 1.血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？血清中谷丙转氨酶的测定有何临床意义？n n 2. 2.血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要血清谷丙转氨酶的测定有何注意点？为什么要避免溶血？避免溶血？11丙氨酸氨基转移酶ALT测定
