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1、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9系统基因修饰理论系统基因修饰理论与实战与实战1 基因表达研究方基因表达研究方法法u干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检干扰基因表达（过表达或低表达），或者表达突变体并检测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一；测其相关生理功能，是基因功能研究中最重要的方式之一；u 基因表达技术基因表达技术- 质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛运质粒转染，病毒转染等传统方法得到广泛运用，但同时其也存在缺点；用，但同时其也存在缺点；1 基因修饰的方法基因修饰的方法与各自优势与各自优势u质粒质粒- 瞬时转染瞬时转染 - 某些细胞效率偏低某些细胞效
2、率偏低 - 表达结果不稳定，有表达结果不稳定，有内源表达的干扰；内源表达的干扰；u质粒质粒- 稳定细胞稳定细胞 - 表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组表达结果不稳定，筛选效率不高，在重组插入基因组中可能干扰其它基因表达；插入基因组中可能干扰其它基因表达；u病毒病毒- 瞬时感染瞬时感染 - 表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过表达结果不稳定，质粒容易在细胞复制过程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达；程中丢失，随机插入基因组中可能会干扰其它基因表达；u 新一代的基因编辑技术新一代的基因编辑技术- 利用重组酶在基因组水平修饰基因，利用重组酶在基因组水平修饰基因，产生的遗传性质稳定，直接
3、作用于内源，减少表达干扰，目产生的遗传性质稳定，直接作用于内源，减少表达干扰，目前有成熟的技术如前有成熟的技术如CRISPR/Cas9；DNANHEJ and HDRDNA sequence disruptedNHEJ: Non-homologous end joining +donor DNADNA sequence replacedHDR: homology directed repairDNA修复的机制与修复的机制与基因编辑原理基因编辑原理非同源性末端接合修复机制(Non-homologous end joining, NHEJ)同源介导的修复机制(Homology-directed r
4、epair, HDR)5ZFN and TALENZFN与与TALEN基因基因编辑原理编辑原理6I: Genome modificationII: Genomic deletionLe C, F Ann R, David C, et al. 2013, Science, (6121):819-823.Genome Editing in Mammalian Cells7Dumpier nematodesZebrafish embryosFruit fliesPennisi E. 2013. Science, (6148):833-6.RiceModels generated by CRISPR/
5、Cas9 systemMonkey1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大学（年，日本大阪大学（Osaka University）在对一种细菌）在对一种细菌编码的碱性磷酸酶（编码的碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因进行研究时，）基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的片段，这些片段是由简单的重复序列组成的，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列。两端还存在一段不太长的特有的序列。u2013以后，研究者们在包括以后，研究者
6、们在包括science和和nature biotechnology等著名杂志上发表多篇文章介绍等著名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR-Cas系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确系统，并且已成功在人类、小鼠、斑马鱼等物种上实现精确的基因修饰。的基因修饰。1 CRISPR-Cas概述概述CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指导指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。蛋白对靶向基因进行修饰的技术。CRISPR-Cas主要由两部分组成：主要由两部分组成：识别识别切割切割1 CRISPR-Cas概述概述1.1 CRISPR结构结构CRI
7、SPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一个特殊的是一个特殊的DNA重复序列家族重复序列家族, 广泛分布于广泛分布于细菌和古细菌基因组中。细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守位点通常由短的高度保守的重复序列的重复序列(repeats) 组成组成, 重复序列的长度通常重复序列的长度通常 2148 bp, 重复序列之间被重复序列之间被 2672 bp 间隔序列间隔序列(spacer)隔开。隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行
8、识别。）与靶基因进行识别。1.1 CRISPR结构结构1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位点附近，是一种双链位点附近，是一种双链DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，是很多细菌和大部分古生菌的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行通过对入侵的病毒和核酸进
9、行特异性特异性的识别，利用的识别，利用Cas蛋白进蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫。行切割，从而达到对自身的免疫。2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现2 CRISPR-Cas系统的发现系统的发现 CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免特异性免疫疫, 而这种特异性是由间隔序列（而这种特异性是由间隔序列（spacer）决定的。在宿主）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌防御噬菌体攻击中，针对自然界中庞大的噬菌体种群，细菌进化了进化了CRISPR 介导的适应性免疫。这种免疫
10、功能的发挥是介导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（序列（spacer）来实现的。）来实现的。2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）为）为NGG。2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求 在人类基因组中，平均每在人类基因组中，平均每8bp就出现一个就出现一个NGG PAM。2 CRISPR-Cas系统靶向要求系统靶向要求3 CRISPR-Cas系统介导基因修饰系统介导基因修饰3.1
11、dual-RNA：Cas介导编辑模板替换介导编辑模板替换 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上发表的上发表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系统用设计好的统用设计好的DNA模板替换的相应基因来达到基因的定向模板替换的相应基因来达到基因的定向修饰。修饰。3.1 dual-RNA：Cas介导编辑模板替换介导编辑模板替换3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰 2013年年1月月29日在日在nature
12、biotechnology上发表的上发表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进行修饰。3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰3.2 sg-RNA：Cas介导基因修饰介导基因修饰Cas9sg-RNA 2013年年2月月15日在日在science上发表的上发表的Multiplex Genome
13、 Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的中，作者利用一个包含两个靶向不同基因的spacers的的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑。实现了同时对两个基因进行编辑。3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰介导双基因修饰 3.3 cr-RNA：Cas介导双基因修饰介导双基因修饰 4 CRISPR-Cas系统前景分析系统前景分析 这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有这是一项靶向基因修饰的革新技术，一项极具有可能获得诺贝尔奖技术。可能获得诺贝尔奖技术。4 CRISPR-Cas系统前景分析系统前景分析 2013年
14、年4月月12日在日在cell stem cell上发表的上发表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和和51%-79%。4 CRISPR-Cas系统前景分析系统前景分析 而且从实际应用的角度来说，而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比比TALENs更更容易操作，因为每一对容易操作，因为每一对
15、TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替换只需要替换20个核苷酸就行。个核苷酸就行。4 CRISPR-Casu只需合成一个只需合成一个sgRNA就能实现对基因的特异性修饰，就能实现对基因的特异性修饰，Cas蛋白不具特异性。蛋白不具特异性。u编码编码sgRNA的序列不超过的序列不超过100bp，因此比构建，因此比构建TALENs和和ZFNs更简单方便。更简单方便。u较短的较短的sgRNA序列也避免了超长、高度重复的序列也避免了超长、高度重复的TALENs编编码载体带来的并发症。码载体带来的并发症。技术优势5 我们的工作我们的工作利用利用CRISPR
16、-Cas9载体肿瘤基因载体肿瘤基因M在卵在卵巢癌细胞巢癌细胞HeLa的编辑与敲除的编辑与敲除流程流程- a.sgRNA的引物设计（4条）；b.px459-cas9载体构建 ，HeLa细胞上的转染与基因靶点筛选（1次）；c.母克隆的基因剪切的确定（2-3个母克隆）；d.单克隆筛选（2-3轮，100个子克隆）f. 单克隆的鉴定（Q-PCR以及WB检测）；母克隆8-31-M测序子克隆8-31-12-d-M测序5 我们的结果我们的结果成功获得了成功获得了M基因敲除的基因敲除的HeLa细胞系，细胞系，模板模板 CCCGGCAGGCTGGACAC-TTCGTGGAGGGCTCCAAAG11-5-1 CCC
17、GGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码）个碱基，移码）11-5-2 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失6个碱基，不移码）个碱基，不移码）11-5-3 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失6个碱基，不移码个碱基，不移码）11-5-5 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码）个碱基，移码）11-5-4 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码个碱基
18、，移码） 11-5-6 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码个碱基，移码）11-18-1 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码个碱基，移码）11-18-2 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码个碱基，移码）11-18-4 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG (插入插入1碱基，移码碱基，移码)11-18-6 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCA
19、AAG (缺失缺失2个碱基，移码）个碱基，移码）11-18-8 CCCGGCAGGCTGGACAC-TCGTGGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失2个碱基，移码）个碱基，移码）11-18-9 CCCGGCAGGCTGGACAC-GGAGGGCTCCAAAG (缺失缺失6个碱基，不移码）个碱基，不移码）11-18-5 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG (插入插入1碱基，移码碱基，移码)11-18-7 CCCGGCAGGCTGGACACTTTCGTGGAGGGCTCCAAAG (插入插入1碱基，移码碱基，移码)5 我们的结果我们的结果验证肿瘤增殖、迁移等功能受到影响；验证肿瘤增殖、迁移等功能受到影响；
