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1、- 1 -非小细胞肺癌基因检测非小细胞肺癌基因检测肿瘤二科肿瘤二科 刘丽珠刘丽珠- 2 -前言前言随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗已进入到个体化治疗的时代。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。EGFR突突变检测中需要明确的几个基本概念中需要明确的几个基本概念2、基因突、基因突变是指是指DNA发生碱基序列的改生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋
2、白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。体体细胞突胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1、EGFR突突变为体体细胞突胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。要尽可能取到足量的要尽可能取到足量的肿瘤瘤细胞胞进行行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。- 4 -EGFREGFR基因突变检测概念基因突变检测概念EGFR突变检测指肿瘤组织中编码EGFR基因的DNA突变状态检测并不是：EGFR基因DNA拷贝数的检测（FISH法）EGFR蛋白表达量
3、的检测（IHC法）。EGFR检测检测检测物质检测物质部位部位方法方法基因突变DNA细胞核测序法、ARMS法等拷贝数DNA细胞核荧光原位杂交法（FISH）蛋白表达蛋白质细胞膜免疫组化法（IHC）RNA表达RNA细胞核RT-PCRX- 5 -Nature Review 2007, 7:169NSCLCNSCLC中中EGFREGFR酪氨酸激酶区突变酪氨酸激酶区突变种类种类- 6 - 7 -标本采集及病理评估DNA抽提及质控检测报告EGFR突变检测ARMS测序法其它方法EGFR 突突变检测流程流程- 8 -EGFREGFR突变检测中的相关角色突变检测中的相关角色患者患者临床医生临床医生胸外科医师胸外科
4、医师内镜医师内镜医师收集肺癌组织标本收集肺癌组织标本病理科医生病理科医生准备样本准备样本实验操作及结果分析实验操作及结果分析实验室人员实验室人员报告结果给临床医生报告结果给临床医生-肿瘤科医生肿瘤科医生-放疗科医生放疗科医生-呼吸科医生呼吸科医生ANNUALBUSINESSREVIEW用于用于EGFR突变检测的标本突变检测的标本肿瘤组织肿瘤组织目前最可靠的标本；目前最可靠的标本；其它样本： 外周血（血浆、血清） 细胞学 （胸水、痰液细胞学） 支气管刮取物仍需进一步研究确定这些样本在临床实践及诊断中的应用- 10 -标本问题标本问题l石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本。石蜡切片：含肿瘤细胞越多
5、越好（50%以上）；组织部位面积约6mm x 6mm以上；包埋组织：组织块不小于0.50.50.5（cm）。l新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR实验更有利，但一定要经病理学确认。含有肿瘤组织50%以上；重量10g（约米粒大小以上），经PBS或生理盐水冲洗干净。取癌组织的中心位置组织块（避开坏死区域），固定于10%中性福尔马林溶液中，尽快送病理科。l细胞学标本：可用l原发灶与复发灶：只要能获得足够的癌细胞，均可；但对于复发的患者，再次活检不仅可确诊，还可以获得分子标志物的进一步信息。- 11 -标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-肿瘤组织特点肿瘤
6、组织特点-遗传异质性遗传异质性 对检测方法敏感度有较高要求对检测方法敏感度有较高要求正常细胞混杂正常细胞混杂- 12 -标本因素标本因素对对EGFR突变检测的影响突变检测的影响-组织标本种类组织标本种类- 对检测方法有对检测方法有相应相应要求要求，组织标本及，组织标本及DNADNA质控尤其重要质控尤其重要冰冻新鲜组织冰冻新鲜组织固定包埋组织固定包埋组织-外科手术标本完整，量多广泛-小活检标本完整，量少受限-外科手术标本片段化，量多受限-小活检标本片段化，量少极度受限DNA质与量质与量适用方法适用方法- 13 -图4. EGFR基因检测使用的临床样本及其操作。基因检测使用的临床样本及其操作。A.
7、被切成被切成10微米的石蜡包埋标本。微米的石蜡包埋标本。B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净（悬浮），可以就这样冷冻保存，C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于AL缓冲液，缓冲液，此状态此状态可以室温保存。可以室温保存。 - 14 -肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本的采集及病理评估肿瘤组织标本病理学评估组织切片非小细胞性肺癌诊断及类型肿瘤细胞比例肿瘤细胞总数标识肿瘤丰富的区域富集肿瘤细胞H&E染色片用于病理评估白片用于提取DNA建议最少切片数：-手术标本，5mX4-小活检
8、标本，5mX8 组织标本来源组织标本来源手术标本支气管下活检经皮穿刺活检 标本处理及贮存标本处理及贮存新鲜冻存：液氮或-80CFFPE- 15 -检测方法检测方法目前EGFR基因突变的检测方法很多DNA直接测序法应用广泛，可检测已知的突变和未知的突变，但对标本的肿瘤细胞含量要求较高，一般要求标本中肿瘤细胞的比例在50%以上，至少不低于30%。基于实时荧光定量PCR基础上的方法（如ARMS法）较直接测序法更加敏感，可检测样品中1.0%0.1%的突变基因，更适合用于肿瘤细胞含量较少的小标本检测。ARMS方法操作简单，是目前临床上较常用的方法之一，但只能检测已知的突变，且标本需进行预处理，检测费用较
9、高。- 16 -直接测序法直接测序法流程及数据分析流程及数据分析PCR*纯化纯化测序反应测序反应测序仪毛细管电泳测序仪毛细管电泳纯化纯化数据分析数据分析EGFR deletionEGFR L858R电泳质控电泳质控组织标本组织标本DNA*PCR是关键：是关键：-特异性-产物长度-必要时巢式-建议通用测序引物- 17 -DNAARMS反应反应实时定量实时定量 PCRARMS法法操作流程及数据解操作流程及数据解读数据分析数据分析内参信号内参信号 (HEX)突变突变信号信号:+ -内参内参信号信号:+ +标本1（突变阳性突变阳性）标本2（突变阴性）突变信号突变信号 (FAM)组织标本组织标本内参信号
10、内参信号 (HEX)- 18 -测序法与测序法与ARMSARMS法比较法比较测测序法序法ARMS敏感度20-30%1%FFPE标本成功率低高检测流程复杂慢长简单快速数据分析要求高低假阳性机会(交叉污染)多少假阴性机会多少仪器成本高低商用试剂盒无有试剂成本低略高- 19 -小结：小结：了解你的标本-新鲜/冰冻组织FFPE组织-手术标本小活检标本选择合适的方法-ARMS是目前较敏感快速方法，且容易开展是目前较敏感快速方法，且容易开展-测序是传统的方法，但敏感度有限，过程复杂，不易普及做好组织标本及DNA质控是关键非肿瘤组织标本的有效利用-在无肿瘤组织情况下，外周血cfDNA、胸水及细针穿刺等细胞学
11、标本均可用于检测EGFR突变，但其确切的敏感度与特异性尚需进一步探索-必须选择足够敏感的方法- 20 -EGFR激酶抑制剂的耐药性激酶抑制剂的耐药性作为临床上的最大问题，吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在缺失或L858R等的敏感性突变的基础上，又发生了第790位密码子苏氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。在EGFR-TKI治疗前很少存在T790M（13%22），这种情况下TKI难以有效。另外50%患者中，其中大约一半患者的耐药性是由MET基因扩增引起的，EGFR-TKI抗药性出现时再进行基因检测，可以选择与其耐药机制相对应的治疗方法。即在一个患者的各种临床情况中，掌
12、握EGFR与相关基因的信息，以期进一步改善临床疗效。- 21 -EGFR激酶抑制剂耐药的处理原则激酶抑制剂耐药的处理原则对于缓慢进展的患者，建议继续使用原来的EGFR-TKI治疗或EGFR-TKI联合化疗；对于快速进展的患者，推荐停用EGFR-TKI，改用化疗；于局部进展且原有病灶控制良好的患者，建议继续使用EGFR-TKI并联合局部治疗。- 22 -EGFR激酶抑制剂耐药研究进展激酶抑制剂耐药研究进展第一代EGFR抑制剂Gefitinib(易瑞沙,Iressa)和Erlotinib(特罗凯,Tarceva)随着其在临床上的广泛应用，耐药问题日益突出。其中，EGFR-T790M突变约占临床耐药
13、病人的60%以上。第二代EGFR抑制剂Afatinib(阿法替尼)。于2013年9月FDA批准上市，于2014年1月在3期临床研究中以失败告终。Afatinib在体外对EGFR-T790M突变有活性，但临床仍然未能克服T790M突变产生的耐药性。第三代EGFR抑制剂。国外多个制药公司和研究机构都在开展对T790M突变的小分子抑制剂研究，其中包括克洛维斯肿瘤公司的CO-1686和阿斯利康的AZD9291,但还没有针对该突变的药物上市。- 23 -ALK融合基因是新发现的NSCLC驱动基因，其中棘皮动物微管相关类蛋白4（EML4）基因与ALK（间变性淋巴瘤激酶）的融合（EML4-ALK）为最常见类
14、型。ALK融合基因主要出现在不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者，且通常与EGFR基因突变不同时存在于同一患者。NSCLC患者中ALK融合基因的发生率约为5%，而在EGFR、KRAS、HER2或TP53等基因无突变的NSCLC患者中，ALK融合基因阳性率达25%；我国EGFR和KRAS均为野生型的腺癌患者中ALK融合基因的阳性率高达30%42%。病理形态学研究提示在含印戒细胞的粘液型或实性腺癌中，ALK的发生率高于其他类型的肺腺癌（46.2%vs8%）ALK阳性的NSCLC虽然仅占全部NSCLC的5%，但是每年新发病例数在中国仍接近30,000例ALK融合基因概念融合基因概念- 24 -目前检测ALK融
15、合基因的常用方法主要有荧光原位杂交技术（FISH）、基于PCR扩增基础上的技术和免疫组织化学方法（IHC）。FISH目前仍是确定ALK融合基因的参照标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，尚不适用于ALK阳性患者的筛查。实时荧光定量PCR操作简便，敏感度高，但需要特定的试剂盒和仪器。IHC简便易行、价格便宜、操作方法成熟。VentanaALK融合蛋白IHC诊断试剂盒在不影响特异度的前提下，进一步提高了敏感度，与FISH结果的吻合率达到98.8%，可重复性达99.7%，已经获CFDA批准用于诊断ALK阳性的NSCLC患者。ALK融合基因检测方法融合基因检测方法- 25 -ALK融合基因阳性有效靶
16、向药物融合基因阳性有效靶向药物针对ALK靶点的小分子抑制剂克唑替尼（Crizotinib）是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。临床试验显示对于ALK阳性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3%4。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初，中国食品和药品监督管理总局（CFDA）已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者常见不良反应（发生率25%）包括视力障碍、恶心、腹泻、水肿及便秘等- 26 -总结总结NSCLC患者治疗前应尽量获取标本，进行EGFR基因突变检测；EGFR检测标本需要经过病理科医生进行质量控制，选用合适的检测方法进行检测，推荐采用高敏感度的检查方法，如ARMS法；对于没有EGFR基因突变的患者，建议进行ALK和ROS-1融合基因检测；建议有条件的单位同时进行EGFR基因突变、ALK和ROS-1融合基因检测。- 27 -谢谢！
