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1、1细细 胞胞 破破 碎碎;2生物分别过程的普通流程生物分别过程的普通流程本章内容;3常见的细胞壁构造细胞破碎技术包涵体的纯化方法本章的主要内容;4概述概述不同类型的细胞分泌目的产物的类型：不同类型的细胞分泌目的产物的类型：动物细胞多分泌到细胞外培育液动物细胞多分泌到细胞外培育液植物细胞多为胞内产物植物细胞多为胞内产物微生物细菌微生物细菌/酵母酵母/真菌胞内、胞外真菌胞内、胞外 对于胞内产物需求搜集菌体或细胞进展对于胞内产物需求搜集菌体或细胞进展破碎。破碎。;5概述概述(大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目的产物存在于发酵液中。及氨基酸等目
2、的产物存在于发酵液中。(有些目的产物存在于生物体中。有些目的产物存在于生物体中。(尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内堆积。细胞内堆积。(脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。;6概概 述述细胞破碎细胞破碎cell rupturecell rupture技术是指利用外力技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产物成分释放出来的技术。产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分别纯化细胞内合成的非分泌细胞破碎技术是分别纯化细胞内合成的非分泌型生化物质产品的根底。
3、型生化物质产品的根底。为了研讨细胞破碎，提高其破碎率，有必要了为了研讨细胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和构造。解各种微生物细胞壁的组成和构造。;715.1 15.1 细胞壁构造对破碎的影响细胞壁构造对破碎的影响微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受浸透压冲击而破碎，因此细通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受浸透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的构
4、造和组成不完全一样，故细胞壁的机械强度不同，不同细胞壁的构造和组成不完全一样，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。细胞破碎的难易程度也就不同。;8细菌细胞壁构造细菌细胞壁构造Z几几乎乎一一切切细细菌菌的的细细胞胞壁壁都都是是由由肽肽聚聚糖糖组组成成，它它是是难难溶溶性性的聚糖链；的聚糖链；Z相相邻邻聚聚糖糖链链上上的的短短肽肽又又交交叉叉相相联联，构构成成了了细细胞胞壁壁的的三三维维网状构造，包围在细胞周围；网状构造，包围在细胞周围；Z使使细细胞胞具具有有一一定定的的外外形形和和强强度。度。;9细菌细胞壁构造细菌细胞壁构造u破碎破碎细菌的主要阻力是来自于菌的主要阻力是来自于肽聚
5、糖的网状构造，聚糖的网状构造，其网构造的致密程度和其网构造的致密程度和强度取决于聚糖度取决于聚糖链上所存在上所存在的的肽键的数量和其交的数量和其交联的程度。的程度。u革革兰氏阴性菌的氏阴性菌的细胞壁构造与革胞壁构造与革兰氏阳性菌有很大氏阳性菌有很大不同。不同。 u革革兰氏阴性菌典型的生物是大氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，杆菌，经过这种种细胞消胞消费了很多了很多细胞重胞重组的的产物。物。药物名称药物名称宿主宿主用途用途胰岛素胰岛素大肠杆菌大肠杆菌治疗糖尿病治疗糖尿病人生长激素人生长激素大肠杆菌大肠杆菌治疗侏儒病治疗侏儒病- -干扰素干扰素大肠杆菌大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等治疗毛状细胞白血病等;
6、10u最最里里层层是是由由葡葡聚聚糖糖的的细细纤纤维维组组成成，它它构构成成了了细细胞胞壁壁的的刚刚性性骨骨架架，使使细细胞胞具具有有一一定定的的外形，外形，u上面的是一层糖蛋白，上面的是一层糖蛋白，u最最外外层层是是甘甘露露聚聚糖糖，由由1,6-1,6-磷磷酸酸二二酯酯键键衔衔接接成成网网状状。在在该该层层的的内内部部，有有甘甘露露聚聚糖糖- -酶酶的复合物。的复合物。u破破碎碎酵酵母母细细胞胞壁壁的的阻阻力力主主要要决决议议于于壁壁构构造造交交联联的的严严密密程程度和它的厚度。度和它的厚度。;11真菌的细胞壁真菌的细胞壁l真菌的真菌的细胞壁胞壁较厚，主要由多糖厚，主要由多糖组成，其次成，其
7、次还含有含有较少量的蛋白少量的蛋白质和脂和脂类。l不同的真菌，不同的真菌，细胞壁的胞壁的组成有很大的不同，成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚和葡聚糖构成，少数含糖构成，少数含纤维素。素。l与酵母和与酵母和细菌的菌的细胞壁一胞壁一样，真菌，真菌细胞壁的胞壁的强度和聚合物的网状构造有关，不度和聚合物的网状构造有关，不仅如此，如此，它它还含有几丁含有几丁质或或纤维素的素的纤维状构造，所状构造，所以以强度有所提高。度有所提高。;12l红面面包包霉霉菌菌细胞胞壁壁具具有有同同心心圆层状构造主要存在三种聚合物状构造主要存在三种聚合物l最最外外层(a)(a)
8、是是-和和-葡葡聚聚糖糖的的混混合物，合物，l第第2 2层(b)(b)是糖蛋白的网状构造是糖蛋白的网状构造l第第3 3层(c)(c)主要是蛋白主要是蛋白质，l最内最内层(d)(d)主要是几丁主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的构造表示图红面包霉菌细胞壁的构造表示图;13微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多
9、糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质细胞壁的组成和构造细胞壁的组成和构造微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10
10、-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-(30-40%)40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白
11、质细胞壁的组成和构造细胞壁的组成和构造;14植物细胞壁的构造植物细胞壁的构造l对于于已已生生长终了了的的植植物物细胞胞壁壁可可分分为初初生生壁壁和和次次生生壁两部分。壁两部分。l初初生生壁壁是是细胞胞生生长期期构构成成的的。初初生生壁壁普普通通较薄薄1 13m3m，富有，富有弹性。性。l由由多多糖糖和和蛋蛋白白质构构成成，多多糖糖主主要要成成分分为纤维素素、半半纤维素素和和果果胶胶类物物质。纤维素素是是长链D-D-葡葡聚聚糖糖，许多多这样的的长链构成微构成微纤丝。l它它是是构构成成细胞胞壁壁的的骨骨架架，细胞胞壁壁的的机机械械强度度主主要要来来自于微自于微纤丝。;15植物次生细胞壁植物次生细胞
12、壁 某某些些植植物物细细胞胞，当当生生长长停停顿顿后后，在在细细胞胞质质和和初初生生细细胞胞壁壁之之间间构构成成了了次次生生细细胞胞壁壁。次次生生壁壁普普通通较较厚厚(4m(4m以上以上) )，常有三，常有三层组层组成。成。在在次次生生壁壁中中，纤纤维维素素和和半半纤纤维维素素含含量量比比初初生生壁壁添添加加很很多多，纤纤维维素素的的微微纤纤丝丝陈陈列列得得更更严严密密和和有有规规那那么么，而且存在木而且存在木质质素的堆素的堆积积。 因因此此次次生生壁壁的的构构成成提提高高了了细细胞胞壁壁的的巩巩固性，使植物固性，使植物细细胞具有很高的机械胞具有很高的机械强强度。度。;16研研 磨磨15.2
13、15.2 细胞破碎技细胞破碎技术术;17机械破碎机械破碎捣碎法研磨法匀浆法超声法 物理破碎物理破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：外表活性剂：酸碱酶促破碎促破碎自溶法外加酶制剂法经过机械运机械运动产生的剪切生的剪切力，使力，使组织、细胞破碎。胞破碎。经过各种物理要素的作用，各种物理要素的作用，使使组织、细胞的外胞的外层构造破构造破坏，而使坏，而使细胞破碎。胞破碎。经过各种化学各种化学试剂对细胞胞膜的作用，而使膜的作用，而使细胞破碎胞破碎经过细胞本身的胞本身的酶系或外系或外加加酶制制剂的催化作用，使的催化作用，使细胞外胞外层构造遭到破坏，构造遭到破坏，而到达而到达细胞破碎胞破碎
14、细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理;18一机械法机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法高压匀浆破碎法homogenizationhomogenization高速珠研磨破碎法高速珠研磨破碎法bead grindingbead grinding超声波破碎法超声波破碎法ultrasonicationultrasonication;19采用高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成。采用高压匀浆器由高压泵和匀浆阀组成。1.高压匀浆法高压匀浆法High-pressure homogenization细胞悬浮液自高压室针细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出
15、高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改动方向击环上，被迫改动方向从出口管流出。细胞在从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程这一系列高速运动过程中阅历了高速剪切、碰中阅历了高速剪切、碰撞及压力骤降，呵斥细撞及压力骤降，呵斥细胞破碎。胞破碎。;20;21高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多：高压匀浆器的种类较多：WABWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MRAVP Gaulin 31MR型型Bran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi
16、高压匀浆机高压匀浆机;22高压匀浆法运用时本卷须知高压匀浆法运用时本卷须知u高高压匀匀浆器的操作温度上升器的操作温度上升约- -/10MPa/10MPa为了控制温度的升高，可在了控制温度的升高，可在进口口处用干冰用干冰调理温理温度，使出口温度度，使出口温度调理在理在2020左右。左右。u可以采用可以采用单次次经过匀匀浆器或多次循器或多次循环经过等方等方式。式。u在工在工业规模的模的细胞破碎中，胞破碎中，对于酵母等于酵母等难破碎破碎的及的及浓度高或度高或处于生于生长静止期的静止期的细胞，常采用胞，常采用多次循多次循环的操作方法。的操作方法。;23高压匀浆法适用的范围高压匀浆法适用的范围大大规规模
17、模细细胞破碎的常用方法胞破碎的常用方法高高压压匀匀浆浆法适用的范法适用的范围围：酵母和大多数酵母和大多数细细菌菌细细胞的破碎；胞的破碎；料液料液细细胞胞浓浓度可以很高，度可以很高，20%左右。左右。不宜运用高不宜运用高压压匀匀浆浆法。法。易呵斥堵塞的易呵斥堵塞的团团状或状或丝丝状真菌，状真菌，较较小的革小的革兰兰氏阳性菌，氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌含有包含体的基因工程菌 因包含体巩固，易因包含体巩固，易损伤损伤匀匀浆阀浆阀 ;24影响高压匀浆器细胞破碎要素影响高压匀浆器细胞破碎要素被破碎的被破碎的细胞分率符合如下公式：胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNP ln1/(1-R)=
18、KNP (15-1) (15-1) 式中式中 R R 破碎率，破碎率，为N N次循次循环后，蛋白后，蛋白质的的释放量放量RnRn与最大与最大释放量放量RmRm之比；之比； K K 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数； P P 操作操作压力，力，MPaMPa； 与微生物种与微生物种类有关的常数。有关的常数。;25l升高压力有利于破碎，升高压力有利于破碎，l减少细胞的循环次数，甚至一次经过匀浆阀就可减少细胞的循环次数，甚至一次经过匀浆阀就可到达几乎完全的破碎，这样就可防止细胞碎片不至到达几乎完全的破碎，这样就可防止细胞碎片不至过小。过小。l但但p p大到一定值时对匀浆器的磨损添加，也有实验
19、大到一定值时对匀浆器的磨损添加，也有实验阐明阐明p p超生一定值时，超生一定值时，R R添加但很慢。添加但很慢。l在工业消费中，通常采用的压力为在工业消费中，通常采用的压力为555570Mpa70Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同l大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，l生长在简单的合成培育基上的大肠杆菌比生长在生长在简单的合成培育基上的大肠杆菌比生长在复杂培育基上容易破碎。复杂培育基上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎要素影响高压匀浆器细胞破碎要素;26高压匀浆法高压匀浆法-X-X-挤压器挤压器l改良的高
20、改良的高压方法：将方法：将浓缩的菌体的菌体悬液冷却至液冷却至- -2525至至-30-30构成冰晶体，利用构成冰晶体，利用500MPa500MPa以上的高以上的高压冲冲击，冷，冷冻细胞从高胞从高压阀小孔中小孔中挤出。出。l细胞破碎是由于冰晶体在受胞破碎是由于冰晶体在受压时的相的相变，包埋，包埋在冰中的在冰中的细胞胞变形所引起的。形所引起的。l主要用于主要用于实验室中。室中。l优点是适用的范点是适用的范围广，破碎率高，广，破碎率高，细胞碎片的胞碎片的粉碎程度低以及活性的保管率高粉碎程度低以及活性的保管率高l对冷冷冻一融解敏感的生化物一融解敏感的生化物质不适用。不适用。;272珠磨法 bead m
21、illu珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂直径小于1mm一同快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的相互剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。u在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机;28高速珠磨机任务原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起l在出口处，旋转园盘和出口平在出口处，旋转园盘和出口平l板之间的狭缝很小，
22、可阻挠玻板之间的狭缝很小，可阻挠玻l离小珠，使不被料液带出。离小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量，l故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷l却细胞悬浮液和玻离小珠。却细胞悬浮液和玻离小珠。;29Netzsch LM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却安装的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分别器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口l园盘以两种位置交错地安装在轴上，l一种处于径向，一种与轴倾斜，l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘那么产生轴向运动。l由于交错的运动，提高了破碎效率。;30珠磨机破碎
23、作用方程u破碎作用是相破碎作用是相对于于时间的一的一级反响速度反响速度过程，程，符合以下公式：符合以下公式：u ln1/(1-R)=Kt ln1/(1-R)=Kt 15-2 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一一级反响速度常数；反响速度常数；t t一一 时间。uK K与与搅拌拌转速、速、细胞胞悬浮液浮液浓度和循度和循环速度、速度、玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等相关。珠磨法的破碎率普通控制在珠磨法的破碎率普通控制在80%80%以下：降低能耗、减少大分以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不子目的产物的失
24、活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分别而给后续操作带来的困难。易分别而给后续操作带来的困难。;313超声波破碎l超声波破碎法超声波破碎法Ultrasonication)Ultrasonication)利用超声波利用超声波振荡器发射的振荡器发射的15-25kHz15-25kHz的超声波探头处置细胞的超声波探头处置细胞悬浮液。悬浮液。l超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，普通破碎效果后者比前者好。质两种型式，普通破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。
25、声波的声频、声能有关。;32超声波破碎的机理JY92-II D超声波超声波细细胞粉碎机胞粉碎机(普通以为在超声波作用下液体发生空化作用普通以为在超声波作用下液体发生空化作用cavitation),cavitation),(液体中部分空穴的构成、增大和闭合产生极大液体中部分空穴的构成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞上呵斥了剪切力，使细胞内液体发生流动，从上呵斥了剪切力，使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。而使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进展。外部冷
26、却的容器中进展。;33超声波破碎的适用范围超声波破碎是很剧烈的破碎方法，适用于多数超声波破碎是很剧烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。微生物的破碎。普通杆菌比球菌易破碎，普通杆菌比球菌易破碎，G-G-细菌比细菌比G+G+细菌易破细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自在基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自在基团能使某些敏感性活性物质失活。活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，但在实验室小规模细胞破碎中常用。但在实验室小规模细胞破碎中常用。;
27、34技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法(孔型孔型)须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎适中适中 便宜便宜匀浆法匀浆法(片型片型)细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌
28、器劈碎适中适中 适中适中动物组织及动物细动物组织及动物细胞胞不同机械破碎方法的比较;35非机械破碎方法非机械破碎方法酶溶破碎法酶溶破碎法enzyme lysisenzyme lysis化学破碎法化学破碎法chemical treatmentchemical treatment去垢剂破碎法去垢剂破碎法detergentsdetergents浸透压冲击破碎法浸透压冲击破碎法osmotic shockosmotic shock冻融破碎法冻融破碎法freezing and thawingfreezing and thawing;36二二 非机械法非机械法非机械方法很多1 酶解2 化学法溶胞3 物理法浸
29、透压冲击冻结和融化枯燥法其中酶法和化学法溶胞运用最广。二;37 1 酶解酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解细胞壁的酶处置菌体细胞，使细胞壁遭到破坏后，再利用浸透压冲击等方法破坏细胞膜。1外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌溶菌酶、-1，3-葡聚糖葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖葡聚糖酶、蛋白蛋白酶、甘露糖甘露糖酶、糖苷糖苷酶、肽键内切内切酶、壳多糖壳多糖酶等等;38外加酶法n酶解法的特点是解法的特点是专注性注性强，因此在，因此在选择酶系系统时，必，必需根据需根据细胞的构造和化学胞的构造和化学组成来成来选择。n溶菌溶菌酶lysozyme)lysozyme)能能专注性地分解注性地分解细胞壁
30、上胞壁上肽聚糖分聚糖分子的子的-1,4-1,4糖苷糖苷键，因此主要用于，因此主要用于细菌菌类细胞壁的裂胞壁的裂解。革解。革兰氏阳性菌氏阳性菌悬浮液中参与溶菌浮液中参与溶菌酶，很快就，很快就产生生溶壁景象。但溶壁景象。但对于革于革兰氏阴性菌，氏阴性菌，单独采用溶菌独采用溶菌酶无无效果，必需与螯合效果，必需与螯合剂EDTAEDTA一同运用。一同运用。n放放线菌的菌的细胞壁构造胞壁构造类似于革似于革兰氏阳性菌，以氏阳性菌，以肽聚糖聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌主要成分，所以也能采用溶菌酶，n酵母和真菌由于酵母和真菌由于细胞壁的胞壁的组分主要是分主要是纤维素、葡聚糖、素、葡聚糖、几丁几丁质等，常用等
31、，常用蜗牛牛酶、纤维素素酶、多糖、多糖酶等。等。n植物植物细胞壁的主要成分是胞壁的主要成分是纤维素，常采用素，常采用纤维素素酶和和半半纤维素素酶裂解。裂解。;39外加酶法有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，参有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，参与时需确定相应的次序。与时需确定相应的次序。 对酵母细胞采用酶法破碎时，先参与蛋白酶作对酵母细胞采用酶法破碎时，先参与蛋白酶作用蛋白质用蛋白质- -甘露聚糖构造，使二者溶解，再参与甘露聚糖构造，使二者溶解，再参与葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时假设缓冲液的浸透压变化，那么细胞质体，这
32、时假设缓冲液的浸透压变化，那么细胞膜破裂，释出胞内产物。膜破裂，释出胞内产物。;40酶解法的特点 优点：发生酶解的条件温暖能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完好缺陷：缺陷：溶酶价钱高，溶酶价钱高，溶酶法通用性差不同菌种需选择不同的酶溶酶法通用性差不同菌种需选择不同的酶) )产物抑制的存在。产物抑制的存在。 ;41酶解-自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体本身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。l自溶作用：改动其生长环境温度、缓冲液，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶
33、，以到达自溶目的。l缺陷是：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。;42某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、外表活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、外表活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改动细胞壁或膜的通透抗生素、金属螯合剂等，可以改动细胞壁或膜的通透性浸透性，从而使胞内物质有选择地浸显显露来。性浸透性，从而使胞内物质有选择地浸显显露来。2 化学浸透法化学浸透法Chemical permeation该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的构造与组成。该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的构造与组成。 ;43n酸处置可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HC
34、l。n碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。n本钱低，反响猛烈，不具选择性。1酸、碱处置法酸、碱处置法;44细胞破碎常用的外表活性剂：细胞破碎常用的外表活性剂：十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠SDSSDS，阴离子型；。，阴离子型；。非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温和吐温TweenTween等等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。放出来。2 2外表活性剂外表活性剂无论外表活性剂是阴离子、阳离子还是
35、非离子型，无论外表活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，构成微泡，使膜的通能与细胞壁上的脂蛋白结合，构成微泡，使膜的通透性添加或溶解透性添加或溶解;45能分解细胞壁中的磷脂，使细胞构造破坏，胞内物能分解细胞壁中的磷脂，使细胞构造破坏，胞内物质被释放出来。质被释放出来。有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 3 3有机溶剂有机溶剂4 4EDTAEDTA螯合剂螯合剂处置处置G-G-细菌，对细胞壁外层有破坏作用。细菌，对细胞壁外层有破坏作用。G-G-细
36、菌的壁外层构造通常靠二价阳离子细菌的壁外层构造通常靠二价阳离子Ca2+Ca2+或或Mg2+Mg2+结合脂多结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦糖和蛋白质来维持，一旦EDTAEDTA将将Ca2+Ca2+或或Mg2+Mg2+螯合，大量的脂螯合，大量的脂多糖分子将零落，使细胞壁外层膜出现洞穴。多糖分子将零落，使细胞壁外层膜出现洞穴。;46u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，普通胞内物质释放率不超越时间长，效率低，普通胞内物质释放率不超越50%50%；u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。u化学试剂的参与常会给随后产物的纯化带来困难，化学试剂的参与常会给随后产物的纯化带来困难， 并影响最终产物纯度并影响
37、最终产物纯度化学浸透法特点：化学浸透法特点：缺陷缺陷l对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完好，碎片少，浆液粘度低，易于固液细胞外形完好，碎片少，浆液粘度低，易于固液分别和进一步提取。分别和进一步提取。优点优点;473 3 物理法物理法u浸透压冲击法浸透压冲击法u冻结冻结-融化法融化法u枯燥法枯燥法;481浸透压冲击法 浸透压冲击是较温暖的一种破碎方法，将细胞放在高浸透压的溶液中如一定浓度的甘油
38、或蔗糖溶液，由于浸透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当到达平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于浸透压的忽然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处置或在培育过程中参与某些抑制剂如抗生素等，使细胞壁有缺陷，强度减弱。;49 2冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻约-15，然后在室温中融化，反复多次而到达破壁作用。一方面能使细胞膜的疏水键构造破裂，从而添加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，构成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中能够引起某些蛋白量变性
39、。 ;50使使细胞胞结合水分合水分丧失，从而改失，从而改动细胞的浸透性。当采用丙胞的浸透性。当采用丙酮、丁醇或丁醇或缓冲液等冲液等对枯燥枯燥细胞胞进展展处置置时，胞内物，胞内物质就容易被抽就容易被抽提出来。提出来。气流枯燥主要适用于酵母菌，普通在气流枯燥主要适用于酵母菌，普通在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空枯燥多用于真空枯燥多用于细菌。菌。冷冷冻枯燥适用于不枯燥适用于不稳定的生化物定的生化物质3 3枯燥法枯燥法气流枯燥气流枯燥真空枯燥真空枯燥喷雾枯燥喷雾枯燥冷冻枯燥冷冻枯燥;51;52选择破碎方法的根据：选择破碎方法的根据：u细胞处置量；细胞处置量； u细胞壁强度和构造细
40、胞壁强度和构造( (高聚物交联程度、种高聚物交联程度、种类和壁厚度类和壁厚度) )；u目的产物对破碎条件的敏感性；目的产物对破碎条件的敏感性； u破碎程度；破碎程度；u目的产物的选择性释放目的产物的选择性释放;53选择性释放目的产物的普通原那么仅破坏或破碎存在目的产物的位置周围当目的产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法、浸透压冲击法和冻结融化法等。当目的产物存在于细胞质内时，那么需采用剧烈的机械破碎法当目的产物处于与细胞膜或细胞壁结合的形状时，调理溶液PH值，离子强度或添加与目的产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、外表活性剂等，使目的产物容易溶解释放。(2)机械破碎法和化学法并用可
41、使操作条件更加温暖，在一样的目的产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。;54 讨论题讨论题：青霉素：青霉素酰酰化化酶酶细细胞破碎的研胞破碎的研讨讨 一一. 化学法化学法 20%(W/V)大大肠肠杆菌杆菌悬悬浮液浮液 + B.A 37搅搅拌拌 高速离心高速离心 测测上清液上清液酶酶活。活。1.处处置置时间时间 R% 2.5h2. 丁丁酯酯用量用量条件：条件：37 ，搅搅拌拌3小小时时适宜的适宜的B.A加量加量为为12% ，释释放率放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活;55二二. 化学法化学法冻融法融法结合合 加加B.A(12%,37搅拌拌3h 菌菌悬液液 冻融融(冻结14h 融
42、化融化) 释放率放率70%；比活；比活2.69 u/mg 三三. 化学化学超声波振超声波振荡法法结合合 先丁先丁酯处置，再超声波置，再超声波90秒，秒，释放率放率72% 小型小型设备，不能工，不能工业大大规模消模消费。四四. 高高压匀匀浆法法 20%(W/V)菌菌悬液，液，P=50MPa，N=3。释放率放率R=38.4%， 缘由由:细胞破碎后胞破碎后,仍有仍有较多多酶吸附在吸附在细胞碎片上。胞碎片上。五五. 高高压匀匀浆化学法化学法结合合 先高先高压匀匀浆，再加，再加10%丁丁酯，37搅拌拌3h，高速离心，高速离心(3万万rpm)，释放率：放率：R=60%六六. 珠磨珠磨 直径直径0.4mm玻
43、璃珠。玻璃珠。释放率：放率：R=95%;56破碎率的测定破碎率的测定细胞胞破破碎碎后后，大大量量带电荷荷的的内内含含物物被被释放放到到水水相相，使使导电率上升。率上升。 1)1)直接测定法直接测定法2)2)目的产物测定法目的产物测定法3)3)导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的采用染色法把破碎的细胞与未破碎的胞与未破碎的细胞区胞区别开来。开来。如破碎的革如破碎的革兰氏阳性菌可染成革氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的氏阴性菌的颜色；色；采用革采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完好的氏染色法染色酵母破碎液，完好的细胞呈紫胞呈紫色，而受色，而受损害的害的细胞呈亮胞呈亮红色。色。将破碎后的将破碎后的细胞
44、胞悬浮液离心，浮液离心，测定上清液中目的定上清液中目的产物含量物含量或活性，并与或活性，并与100%100%破碎率的破碎率的规范范值比比较，计算其破碎率。算其破碎率。;57破碎技术的研讨方向破碎技术的研讨方向1)1)多种破碎方法相结合多种破碎方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、浸透压法结合酶法与高压匀浆、超声波震荡、鳌合剂、浸透压法结合如用溶解酶预处置面包酵母，然后高压匀浆，如用溶解酶预处置面包酵母，然后高压匀浆，95MPa95MPa压压力下匀浆力下匀浆4 4次，总破碎率接近次，总破碎率接近100%100%。而单独采用高压匀。而
45、单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只需浆法，同样条件下破碎率只需32%32%。有机溶剂与冻融法、枯燥法结合有机溶剂与冻融法、枯燥法结合;58破碎技术的研讨方向破碎技术的研讨方向- -与上游过程相结合与上游过程相结合v在发酵培育过程中，培育基、生长期、操作参数如在发酵培育过程中，培育基、生长期、操作参数如pHpH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等等要素都对细胞壁温度、通气量、搅拌转速、稀释率等等要素都对细胞壁膜的构造与组成有一定的影响。膜的构造与组成有一定的影响。v在生长后期，参与某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑在生长后期，参与某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂制剂( (如青霉素如青霉素
46、) )，继续培育一段时间后，新分裂的细胞其，继续培育一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；细胞壁有缺陷，利于破碎；v选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；v用基因工程的方法对菌种进展改造，如在细胞内引进噬菌用基因工程的方法对菌种进展改造，如在细胞内引进噬菌体基因，培育终了后，控制一定条件如温度等，激活体基因，培育终了后，控制一定条件如温度等，激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。;59破碎技术研讨方向破碎技术研讨方向-与下游工程相结合与下游工程相结合举例：萃取破碎
47、法提取酵母醇脱氢酶举例：萃取破碎法提取酵母醇脱氢酶;60 inclusion bodies IBs)15.4 15.4 基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化基因工程菌培育液不同表达方式的前基因工程菌培育液不同表达方式的前处置置胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心,搜集液相搜集液相浓缩纯化。化。胞内表达：胞内表达：胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心,搜集菌体搜集菌体细胞破碎胞破碎离心，离心，搜集上清搜集上清纯化化胞内周胞内周质表达：离心表达：离心,搜集菌体搜集菌体低低浓度溶菌度溶菌酶或浸或浸透透压冲冲击等溶解目的物等溶解目的物离心离心,搜集上清液搜集上清液纯化。化。不溶性包涵体：离
48、心不溶性包涵体：离心,搜集菌体搜集菌体细胞破碎胞破碎离心离心,搜搜集沉淀集沉淀包涵体洗包涵体洗涤目的蛋白目的蛋白变性溶解性溶解复性复性纯化。化。;61外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区- -人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成
49、包涵体;62Z包涵体：一种蛋白包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目的蛋白、菌体蛋白等。不溶性聚集体，包括目的蛋白、菌体蛋白等。目的蛋白一目的蛋白一级构造是正确的，但立体构造是构造是正确的，但立体构造是错误的，所以没有生的，所以没有生物活性。物活性。Z包涵体的构成：大包涵体的构成：大肠杆菌中目的杆菌中目的产物的表达程度物的表达程度过高，超越正常高，超越正常代代谢程度，程度，过多表达多表达产物聚集在物聚集在细胞内，构成不溶性的包涵体。胞内，构成不溶性的包涵体。Z高表达高表达产生的生的积聚物在聚物在细胞内部构成不溶物胞内部构成不溶物缘由？由？Z蛋白蛋白过量量积聚，超越溶解度，聚，超越溶解度，导致沉
50、淀；致沉淀；Z蛋白生成太快，分子蛋白生成太快，分子间疏水基疏水基团相互作用而聚集沉淀；相互作用而聚集沉淀；Z蛋白生成太快，分子内部二硫蛋白生成太快，分子内部二硫键的的错误衔接接导致沉淀；致沉淀；Z表达蛋白表达蛋白过多，与其多，与其结合合/ /诱导组分缺乏，不能构成溶解形状分缺乏，不能构成溶解形状Z 蛋白蛋白质本身不本身不稳定。定。包含体的构成;63搜集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤包涵体的洗涤目的蛋白的变性溶解目的蛋白的复性包含体的出现不仅添加了包含体的出现不仅添加了生物分别设计的难度，也生物分别设计的难度，也为蛋白质折叠机理研讨提为蛋白质折叠机理研讨提出了新的课题。出了新的课题。欲获得天然活性
51、态的目的欲获得天然活性态的目的产物，必需分别包含体后，产物，必需分别包含体后，溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目的蛋白恢复应有的天然活的蛋白恢复应有的天然活性。性。;64包涵体获得几种常见的工艺道路(一)机械破碎机械破碎( (高压匀浆、高速珠磨高压匀浆、高速珠磨离心提取包含体离心提取包含体加变性剂溶解加变性剂溶解除变性剂复性除变性剂复性;65特点特点: :是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复
52、性。性。优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分别纯化简单了。从这个素等杂质，使后面的分别纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的构成对分别纯化亦有益处。角度上讲，包含体的构成对分别纯化亦有益处。缺陷缺陷: :要经过几次离心才干除去大部分的细胞碎要经过几次离心才干除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。片，加工时间较长。道路道路1 的特点的特点;66包涵体获得几种常见的工艺道路二机械破碎膜分别获得包涵体加变性剂溶解包含体除变性剂复性除变性剂复性;67 道路二运用了膜分别技术，用微孔道路二运用了膜分别技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。膜除去可
53、溶性蛋白质。优点是封锁式操作，不污染环境也不受环优点是封锁式操作，不污染环境也不受环境污染，能量耗费也比离心法少。境污染，能量耗费也比离心法少。缺陷：细胞碎片和包含体一同被膜挡住，缺陷：细胞碎片和包含体一同被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化经难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化经常导致可溶性蛋白质的滞留。常导致可溶性蛋白质的滞留。道路道路2 的特点的特点;68包涵体获得几种常见的工艺道路三化学破碎加变性剂离心除细胞碎片除变性剂复性;69l用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了
54、设备和时间，比前两者更适宜于实节省了设备和时间，比前两者更适宜于实验室操作。验室操作。l缺陷是一切的可溶性杂质都没有除去，混缺陷是一切的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分别带来困难。杂在产物中间，给后续分别带来困难。 道路三：;701包涵体的洗涤包涵体的洗涤细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。洗涤的重要性：搜集的沉淀中，除包洗涤的重要性：搜集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目的肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目的蛋白一同复性构成杂交分子而聚集，蛋白一同复性构成杂交分子而聚集，给
55、后步纯化带来困难。给后步纯化带来困难。洗涤剂：温暖的外表活性剂、蔗糖、洗涤剂：温暖的外表活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂如尿素或脱氧低浓度的弱变性剂如尿素或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。质类杂质。洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原那么。体中表达产物为原那么。;71 2 目的蛋白的目的蛋白的变变性溶解性溶解 包涵体中不溶性的目的蛋白必需溶解到液相中，才干包涵体中不溶性的目的蛋白必需溶解到液相中，才干进进一步一步纯纯化。普通水溶液很化。普通水溶液很难难将其溶解，只需采用蛋将其溶解，只需采用蛋白量白量变变性才
56、干使其构成可溶性的方式。性才干使其构成可溶性的方式。 常用常用变变性性剂剂： 5-8 mol/L盐盐酸胍和酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子作用：破坏离子间间相互作用；相互作用； 外表活性外表活性剂剂如如1-2 SDS，作用：破坏蛋白作用：破坏蛋白质肽链间质肽链间的疏水相互作用。的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶的碱溶液和有机溶剂剂，运用，运用较较少。少。影响影响变变性要素：性要素：时间时间、pH、离子、离子强强度、度、变变性性剂剂种种类类和和浓浓度。度。;72原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性形状，即蛋白质高级构造被破坏
57、，但一级构造形状，即蛋白质高级构造被破坏，但一级构造和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。过程称复性。复性方法：复性方法：稀释法除变性剂稀释法除变性剂 参与大量水或缓冲液。参与大量水或缓冲液。膜分别法除变性剂膜分别法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析层析法：凝胶层析，高效疏水层析 3 目的蛋白的复性目的蛋白的复性;73 蛋白蛋白质质复性影响要素：复性影响要素：变变性性剂浓剂浓度度目的蛋白目的蛋白浓浓度；度；pH和离子
58、和离子强强度；度； 氧化复原条件。氧化复原条件。 复原复原剂剂： 二硫二硫苏苏糖醇、糖醇、-巯巯基乙基乙醇、复原型谷胱甘醇、复原型谷胱甘肽肽；氧化氧化剂剂： 氧化型谷胱甘氧化型谷胱甘肽肽; 碱性下通空气。碱性下通空气。 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐酸胍浓度盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L;74肿瘤坏死因子相关凋亡瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在配体蛋白在E.coliE.coli中的高密度中的高密度发酵酵过程中以两种方式表达：程中以两种方式
59、表达： 细胞内有活性的可溶性蛋白方式胞内有活性的可溶性蛋白方式约占目的蛋白的占目的蛋白的30%30% 无活性的包涵体方式无活性的包涵体方式约占目的蛋白的占目的蛋白的70%70%。 悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换层析阳离子交换层析溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析湿菌体湿菌体发酵液发酵液干净菌体干净菌体上清液上清液包涵体包涵体纯品纯品活性检测活性检测破壁液破壁液离心离心离心液离心液洗涤洗涤举例：举例：TRAIL的分别纯化的分别纯化;751. 1. 包涵体的洗包涵体的洗涤涤 粗制包涵体用粗制包涵体用 50mM 50mM磷酸磷酸盐缓盐缓冲液，含冲液，
60、含150mM NaCl 150mM NaCl pH=7.4 (1:3 w/v) pH=7.4 (1:3 w/v) 洗洗涤涤2-32-3次；次； 用含有用含有1M NaCl1M NaCl的磷酸的磷酸缓缓冲液洗冲液洗涤涤1 1次次 (1:3 w/v) (1:3 w/v)，将粘附其外表的大部将粘附其外表的大部 分蛋白及水溶性分蛋白及水溶性杂质杂质除去；除去； 用用6M6M尿素及尿素及0.5%TritonX-100 0.5%TritonX-100 结结合洗合洗涤涤1 1次次 (1:3 (1:3 w/v)w/v)，去除另一些，去除另一些 杂杂蛋白，蛋白，这时这时得得较纯较纯包涵体包涵体 纯纯度达度达80
61、%80%左右左右 ； 用用SDS-PAGESDS-PAGE电电泳泳检测纯检测纯度。度。 2. 包涵体的变性溶解 洗涤后包涵体用含有30mM DTT及5mol/l盐酸胍的Tris 缓冲液 pH =8.0 (1:5 w/v)变性溶解 室温搅拌2h，95%以上的包涵体可被溶解； 离心，13000rpm，20min 弃沉淀得到溶解液。;763. 3. 包涵体复性包涵体复性 间间歇式流加稀歇式流加稀释释复性法复性法 以含以含DTTDTT和和ZnSO4ZnSO4的的Tris-HClTris-HCl为为复性复性缓缓冲液，再添加冲液，再添加0.4M L-Arg0.4M L-Arg，0.5M0.5M尿素，尿素，
62、0.5M NaCl0.5M NaCl作作为为蛋白聚集抑蛋白聚集抑制制剂剂，变变性溶解液可多次流加，每次流加的性溶解液可多次流加，每次流加的时间时间是以上一是以上一次流加蛋白已到达部分复性次流加蛋白已到达部分复性为为准。本准。本实验实验中，流加中，流加间间隔隔时间时间确定确定为为90min90min，每次流加，每次流加浓浓度度为为150mg/L150mg/L，变变性液流加次数可高达性液流加次数可高达6 6次，最次，最终浓终浓度可到达度可到达1mg/ml1mg/ml，44缓缓慢慢搅搅拌一段拌一段时间时间，对对50mM Tris-HCl50mM Tris-HCl，300mM NaCl300mM Na
63、Cl，0.1M0.1M尿素及尿素及0.2mM 0.2mM ZnSO4 ZnSO4 混合液透析混合液透析过过夜，透析后离心除去复性夜，透析后离心除去复性过过程程中聚集的蛋白，中聚集的蛋白，超超滤浓缩滤浓缩 也可用硫酸也可用硫酸铵铵沉淀沉淀进进展展浓缩浓缩 得复性蛋白液。得复性蛋白液。;77 5. 复性后纯化 复性浓缩后蛋白 金属亲和层析 吸附 洗涤： 40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白 洗脱： 100mmol/L咪唑 目的蛋白 纯度达95%以上由SDS-PAGE和RP-HPLC鉴定 收率75%;78包含体产物分别工艺牛生长激素分别提取包含体产物分别工艺牛生长激素分别提取;79 来自发
64、酵罐的菌体经过离心除去培育来自发酵罐的菌体经过离心除去培育液后参与缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破液后参与缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、再添加溶菌酶、EDTAEDTA和促进剂以除去脂蛋白和和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进展变性溶解，溶解剂为展变性溶解，溶解剂为6mol/L6mol/L盐酸胍。溶解的盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误衔接的双硫键。同时通入空气氧化以打断错误衔接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再参与复性缓冲浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再参与复性缓冲液进展透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀液进展透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。用离心除去。包含体产物分别工艺包含体产物分别工艺牛生长激素分别提取牛生长激素分别提取;801.1.常用的细胞破碎方法有哪些常用的细胞破碎方法有哪些2.2.在选择细胞破碎方法时需求思索哪些在选择细胞破碎方法时需求思索哪些要素？要素？3.3.基因工程包含体的纯化方法。基因工程包含体的纯化方法。;
