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1、第五章分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术扉页：当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强
2、调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它生命科学技术的根本特征。重组DNA技术发展史上的三大里程碑：一、20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题。Generalized model of semiconservative replication of DNA. New synthesis is shown in blu
3、e.三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。Crick于1954年所提出的遗传信息传递规律（即中心法则）。中心法则的演变1954年首次年首次提出的提出的“中心法则中心法则” 1970-1980年年的的“中心法则中心法则” 21世纪后修正世纪后修正的的“中心法则中心法则” 上个世纪中下叶以来，现代分子生物学的迅猛发展源自工具酶的发现。5.1基因操作的基本工具（一）限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAAT
4、TC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。Werner Arber, Hamilton Smith and Daniel Nathans were awarded the 1978 Nobel Prize for their work on REs. 图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 RE切割随机DNA分子（假定4种碱基在DNA中均匀分布）的概率由该酶所识别的碱基数目按照4n来计算，如一个6碱基切割酶平均每4096
5、bp核DNA有一个酶切位点（46），而一个4碱基切割酶平均每256bp核DNA就有一个酶切位点（44）。重组重组DNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶 类类功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通通过过磷磷酸酸二二酯酯键键把把两两个个或或多多个个DNADNA片片段段连连接接成一个成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）大肠杆菌）按按55到到33方方向向加加入入新新的的核核苷苷酸酸，补补平平DNADNA双双链中的缺口链中的缺口反转录酶反转录酶按按照照RNARNA分分子子中中
6、的的碱碱基基序序列列，根根据据碱碱基基互互补补原则合成原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把把磷磷酸酸基基团团加加到到多多聚聚核核苷苷酸酸链链的的5-OH5-OH末末端端（进行末端标记实验或用来进行（进行末端标记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚或单核苷酸末端加上多聚或单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位
7、于DNADNA链末端的磷酸基团链末端的磷酸基团嘌呤嘌呤腺嘌呤腺嘌呤鸟嘌呤鸟嘌呤嘧啶嘧啶胞嘧啶胞嘧啶尿嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶胸腺嘧啶组成组成DNA和和RNA分子的五种含氮碱基的结构式分子的五种含氮碱基的结构式多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程多聚核苷酸链中新生磷酸糖苷键的产生过程单核苷酸5-磷酸基团向核酸链的3-OH发起进攻（二）基因克隆的载体载体三要素：自我复制能力携带外源基因片段大小插入位点多少易于鉴定识别程度大肠杆菌质粒载体:1、pSC101质粒载体长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性
8、核酸内切酶的单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因，会导致tetr失活。大大 肠肠 杆杆 菌菌pSC101质质粒粒 载载 体体 示示意图。意图。是第一个基因克隆载体。缺点：它是一种严紧型复制控制的低拷贝质粒，平均每个寄主细胞仅有12个拷贝，从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101DNA，产量很低。2、ColE1质粒载体松弛型复制控制的多拷贝质粒。一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制，细胞的生长也随之停止。松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10
9、003000个，占细胞总DNA的50%左右。3、pBR322质粒载体由三个不同来源的部分组成的：第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨苄青霉素抗性基因（AmpR）；第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因（tetr）；第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点（ori）。优点是具有较小的分子量(4363bp)，易于纯化。即使携带了6-8kb的外源DNA片段，操作仍较便利。有两种抗生素抗性基因作为转化子的选择标记。有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增，每个细胞可累积10003000个拷贝，便于制备重组体DNA。4、pUC质粒载体（包括四个部分）：来自pBR322质粒的
10、复制起点（ori）氨苄青霉素抗性基因（ampr）大肠杆菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）启动子及编码-肽链的DNA序列。特称为lacZ基因位 于 lacZ基 因 5-端 的 一 段 多 克 隆 位 点（MCS），外源基因插入破坏lacZ基因功能LacZ编码-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸的-肽，IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导该基因表达，所合成的-半乳糖苷酶-肽与宿主细胞编码的缺陷型-半乳糖苷酶互补，产生有活性的-半乳糖苷酶，水解培养基中的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚。含X-gal培养基中非转化菌落呈蓝色，含有重组DNA分子的菌落为白色。优点：更
11、小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时，平均每个细胞即可达500700个拷贝。ColE1质粒质粒DNA复制起始部位调控因子之间关系复制起始部位调控因子之间关系前体RNA(RNAII)的转录起始于复制起点上游，需经RNaseH加工后产生有555个核苷酸的引物，起始DNA合成。RNA1在RNA2的5末端，转录方向相反，因此能通过氢键配对与后者相互作用，阻止RNaseH加工RNA2，使其不能转化为有活性的引物，阻碍复
12、制起始。没有Rop蛋白，RNA1基因就不能起始转录。pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，可用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。具有多克隆位点MCS区段，可以把具两种不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8质粒载体上。5、pGEM-3Z质粒长度为2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。含有两个噬菌体启动子(T7和SP6)，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。加入T7或SP6RNA聚合酶，所克隆的外源基因便会转录出相应的mRNA。6、 穿 梭 质 粒 载 体 （ sh
13、uttle plasmidvector）由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。这类质粒载体可保证外源DNA序列在不同物种(原核和真核)的细胞间得到扩增，用途广泛。7、pBluescript噬菌粒载体pBluescript是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体，简称为pBS（+/-），如今则更多地叫作pBluescriptKS（+/-）或pBluescriptSK（+/-）。SK表示多克隆位点区的取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。f1（+）起点表示当pBluescript
14、噬菌粒载体和辅助噬菌体共感染寄主细胞时，能够回收到lacZ基因的有 意 义 链 DNA； 而 f1（ -） 起 点 则 表 示 当pBluesript噬菌粒载体与辅助噬菌体共感染寄主细胞时，可回收到lacZ基因的无意义链DNA。(i)在多克隆位点区（MCS）的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向指导插入在多克隆位点上的外源基因的转录活动；(ii)具有单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，保证pBluescript噬菌粒载体在有或无辅助噬菌体共感染的不同情况下，按照不同的复制形式分别合成出单链或双链DNA；(iii）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，作为转化
15、子克隆的选择标记；(iv)含有一个lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG组织化学显色法筛选噬菌粒载体的重组子。仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖（图5-3）。5.2DNA操作技术5.2.1
16、核酸的凝胶电泳自 从 琼 脂 糖 （ agarose） 和 聚 丙 烯 酰 胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。一一种种分分子子被被放放置置到到电电场场中中，它它就就会会以以一一定定的的速速度度移移向向适适当当的的电电极极。我我们们把把这这种种电电泳泳分分子子在在电电场场作作用用下下的的迁迁移移速速度度，叫叫做做电电泳泳的的迁迁移移率率，它它与与电电场场强强度度和和电电泳泳分分子子本本身身所所携携带带的的净净电电荷荷数数成正比，与片段大小成反比。成正比，与片段
17、大小成反比。生生理理条条件件下下，核核酸酸分分子子中中的的磷磷酸酸基基团团呈呈离离子子化化状状态态，所所 以以 ， DNADNA和和 RNARNA又又 被被 称称 为为 多多 聚聚 阴阴 离离 子子（polyanionspolyanions），），在电场中向正电极的方向迁移。在电场中向正电极的方向迁移。由由于于糖糖- -磷磷酸酸骨骨架架在在结结构构上上的的重重复复性性质质，相相同同数数量量的的双双链链DNADNA几几乎乎具具有有等等量量的的净净电电荷荷，因因此此它它们们能能以以同同样样的速度向正电极方向迁移。的速度向正电极方向迁移。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围
18、为0.2-50kb0.2-50kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1 1到到10001000个碱基对之间。个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。孔隙越小，其分辨能力就越强。表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 00030
19、0 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501图图5-4 5-4 溴溴化化乙乙锭锭染染料料的的化化学学结结构构及及其其对对DNADNA分分子子的的插插入入作作用用。由由于于插插入入了了溴溴化化乙乙锭锭分分子子，在在紫紫外外光光照照射射下下，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中DNADNA的的条条带带便便呈呈现现出出橘橘黄黄色荧光，易于鉴定。色荧光，易于鉴定。图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 5. 2. 2 5. 2. 2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNADNA分子的增殖分子的增殖
20、通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNADNA分子分子导入宿主细胞中。外源导入宿主细胞中。外源DNADNA通过自身载体上的复通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。纯化出来。细菌转化（细菌转化（transformationtransformation），），是指一种是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNADNA而而导致性状特征发生遗传改变的过程。导致性状特征发生遗传改变的过程。
21、为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取增加其获取DNADNA的能力。经过这种处理的细胞被的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞称作感受态细胞（competent cellscompetent cells）。CaClCaCl2 2法法将将快快速速生生长长期期大大肠肠杆杆菌菌置置于于经经00预预处处理理的的低低渗渗CaClCaCl2 2溶溶液液中中，细细胞胞膨膨胀胀，膜膜通通透透性性改改变变，易易与与外外源源DNADNA相相粘附。粘附。将将该该体体系系转转移移到到4242下下做做短短暂暂的的热热刺刺激激，外外源源DNADNA就就可可能能被
22、被细细胞胞吸吸收收。将将经经过过转转化化后后的的细细胞胞置置于于选选择择性性培培养基上，筛选阳性克隆。养基上，筛选阳性克隆。转转化化效效率率可可达达到到5 510106 6-2-210107 7个个转转化化子子/ /g g超超螺螺旋旋质质粒粒DNADNA。 电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，介质中的会转变为亲水性孔洞，介质中的DNADNA进入细胞进入细胞质。质。将将生生长长至至对对数数中中期期的的E. E. colicoli菌菌液液冷冷却却至至4
23、4后后离离心心，洗洗菌菌后后用用10%10%的的甘甘油油悬悬浮浮，将将高高密密度度菌菌液液（2210101010/ml/ml）置置于于特特制制的的电电极极杯杯中中进进行电击。行电击。获获 得得 最最 大大 转转 化化 效效 率率 时时 场场 强强 一一 般般 为为12.515kV/cm12.515kV/cm，时间跨度一般为时间跨度一般为4.55.54.55.5毫秒。毫秒。电电击击转转化化与与温温度度有有关关，一一般般在在0404进进行行。由由于于转转化化载载体体上上常常带带有有LacLacZ Z基基因因，多多用用带带有有不不同同抗抗生生素素的的选选择择性性培培养养基基结结合合-互互补补蓝蓝白白
24、斑斑筛选法鉴定转化细胞。筛选法鉴定转化细胞。 5. 2. 35. 2. 3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCRPCR）技术技术聚聚合合酶酶链链式式反反应应是是快快速速扩扩增增DNADNA序序列列最最常常用用的的方法。方法。PCRPCR反反应应的的模模板板DNADNA若若是是基基因因组组上上的的某某个个片片段段，就就称称为为genomic genomic PCRPCR，若若是是mRNAmRNA反反转转录录产产生生的的cDNAcDNA，就称为就称为RT-PCRRT-PCR。图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术技术 图图5-8 PCR指指数数扩扩增增时时循循环环次次数数与与DN
25、A产产物物数数量量的的比比较较19891989年年1212月，月， 著名的自然科学杂志著名的自然科学杂志“SCIENCE”SCIENCE”将将PCRPCR和它所使用的聚合酶命名为第一个和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子年度分子”。主编主编Daniel Koshland Jr. Daniel Koshland Jr. 写道：第一篇有关写道：第一篇有关PCRPCR的论的论文发表于文发表于19851985年。自那以后，年。自那以后，PCRPCR已经发展成为日益强已经发展成为日益强大的和有广泛用途的技术。大的和有广泛用途的技术。 有了有了PCRPCR，极少量遗，极少量遗传物质也能扩增产生大量一般
26、实验室都能得到的、可传物质也能扩增产生大量一般实验室都能得到的、可用于生化分析和鉴定的材料。用于生化分析和鉴定的材料。“SCIENCE”SCIENCE”确实在确实在19851985年发表了第一篇关于年发表了第一篇关于PCRPCR的的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCRPCR技术技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信：“这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期拟录用的稿件那样积
27、极。所以，尊稿无力竞争本刊拟录用的稿件那样积极。所以，尊稿无力竞争本刊有限的版面。有限的版面。”凯利凯利穆利斯博穆利斯博士，（英文名士，（英文名Kary Banks Mullis，1944年年12月月28日），日），美国生物化学家。美国生物化学家。1993年因发明聚年因发明聚合酶链锁反应合酶链锁反应（PCR），与迈），与迈克尔克尔史密斯分史密斯分享诺贝尔化学奖。享诺贝尔化学奖。同年还获得日本同年还获得日本国际奖。国际奖。凯利凯利穆利斯（穆利斯（Kary MullisKary Mullis），），19441944年出生，年出生，19621962年在佐治亚理工学院化学工程专业毕业年在佐治亚理工学院
28、化学工程专业毕业. .受受同学们的蛊惑同学们的蛊惑，19661966年报考加州伯克利大学生化专年报考加州伯克利大学生化专业研究生被录取。业研究生被录取。19681968年一个人在年一个人在NATURENATURE发表发表“时间反演的宇宙学意义时间反演的宇宙学意义”论文并论文并侥幸侥幸通过了博士生资格考试。通过了博士生资格考试。19721972年，以年，以“微生物铁转运因子的结构与有机合成微生物铁转运因子的结构与有机合成”获得博士学位。获得博士学位。毕业后，尝试写小说，但因毕业后，尝试写小说，但因“不能使一部分人物具有不能使一部分人物具有不幸的遭遇不幸的遭遇”而失败，又因而失败，又因厌恶天天宰杀
29、实验小鼠厌恶天天宰杀实验小鼠而而两次丢掉工作。两次丢掉工作。他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：他有一条知名的可能引起不少同学共鸣的学习曲线：刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣刚开始时，对拓宽自身知识面表现出极大的兴趣知知识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶识迅速上升，然后徘徊不前，最终进入失望和不安阶段段辞职辞职以后去一家小咖啡馆当了两年经理。以后去一家小咖啡馆当了两年经理。1979年加入西特年加入西特斯公司，负责斯公司，负责DNA合成。合成。正是费时费力的正是费时费力的DNA合成（单引物，以算术级数增长）合成（单引物，以算术级数增长），激发了他的思维。，激发了他
30、的思维。1983年年8月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关月，穆利斯第一次在公司正式作了一个有关PCR原理原理的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，的学术报告。人们对这个报告的反应冷谈，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，只有少数几个实验技术人员有些兴趣。穆利斯回忆说，“绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，绝大多数人要么在我结束报告之前就离开了会场，要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡要么故意留下来给我出难题。他们认为这些肯定是胡说八道。说八道。” 普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出普遍的观点是，虽然我不够聪明，没看出问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不
31、行，问题的要害所在，但肯定有理由证明这个方法不行，要不为什么从前没人想到呢？要不为什么从前没人想到呢？PCRPCR技术的原理技术的原理首首先先将将双双链链DNADNA分分子子在在临临近近沸沸点点的的温温度度下下加加热热分分离离成成两两条条单单链链DNADNA分分子子，DNADNA聚聚合合酶酶以以单单链链DNADNA为为模模板板并并利利用用反反应应混混合合物物中中的的四四种种脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸和和实实验验中中提提供供的的引引物物序序列列合合成成新新生生的的DNADNA互补链。互补链。 DNADNA解链（变性）解链（变性） 引物与模板引物与模板DNADNA相结合（退火）相结合（退火） D
32、NADNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经经不不断断重重复复循循环环之之后后，反反应应混混合合物物中中所所含含有有的的双双链链DNADNA分分子子数数，即即两两条条引引物物结结合合位位点点之之间间的的DNADNA区区段段的的拷拷贝数，理论上的最高值应是贝数，理论上的最高值应是2 2n n, ,实得实得1.81.8n n. .将将含含有有待待扩扩增增DNADNA样样品品的的反反应应混混合合物物放放置置在在高高温温（9494）环环境境下下加加热热1 1分分钟钟，使使双双链链DNADNA变变性性，形成单链模板形成单链模板DNADNA。94加热，淬火加热，淬火降降低低反反应应温温度度（退
33、退火火，约约5050），约约1 1分分钟钟，使使寡寡核核苷苷酸酸引引物物与与两两条条单单链链模模板板DNADNA结合在靶结合在靶DNADNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。5060，退火，退火引物与模板引物与模板DNA相相结合结合将将反反应应混混合合物物的的温温度度上上升升到到7272左左右右保保温温1-1-数数分分钟钟，在在DNADNA聚聚合合酶酶的的作作用用下下，从从引引物物的的3-3-端端加加入入脱脱氧氧核核苷苷三三磷磷酸酸，并并沿沿着着模模板板分分子子按按5353方方向向延延伸伸，合合成成新新生生DNADNA互补链。互补链。PCR扩增，扩增，72左右左右, 按按每每
34、分钟分钟1000个碱基对设计个碱基对设计循环往复循环往复应用实例：应用实例：实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析实验中通过对拟南芥基因芯片数据分析, 鉴定鉴定出一个受干旱胁迫诱导的出一个受干旱胁迫诱导的cDNA。干旱、紫外。干旱、紫外线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理线、脱落酸、高盐以及水杨酸等胁迫条件处理后表达量均有显著提高后表达量均有显著提高, 特别是干旱处理特别是干旱处理3h后后表达量极表达量极显著显著提高。提高。多序列比对和系统进化分析发现该基因含多序列比对和系统进化分析发现该基因含有典型的有典型的AP2/EREBP DNAAP2/EREBP DNA结合结构域，且结合结构域，且属于
35、属于DREBDREB亚家族。由于其亚家族。由于其N N端富含谷氨酰端富含谷氨酰氨残基氨残基, , 将它命名为将它命名为QRAP2 (Glutamine-QRAP2 (Glutamine-rich AP2)rich AP2)。常规常规PCRPCR技术能扩增两引物之间的技术能扩增两引物之间的DNADNA区段，区段，然而，有时我们也希望扩增位于靶然而，有时我们也希望扩增位于靶DNADNA区区段之外的未知段之外的未知DNADNA序列，这就需要应用序列，这就需要应用反反向向PCRPCR（reverse PCRreverse PCR）技术技术。用用一一种种在在靶靶序序列列上上没没有有酶酶切切位位点点的的核
36、核酸酸限限制制性内切酶消化性内切酶消化DNADNA；产产生生大大小小不不同同的的线线性性DNADNA片片段段群群体体，其其中中靶靶DNADNA区区段段的的DNADNA分分子子长长度度不不超超过过23kb23kb，经经连连接后重新环化；接后重新环化；按按靶靶序序列列设设计计的的一一对对引引物物与与互互补补序序列列退退火火结结合，其延伸方向如箭头所指；合，其延伸方向如箭头所指；反反向向PCR的的基基本本操操作作程程序序。波波纹纹线线表表示示靶靶DNA区区段段，箭箭头头表表示示限限制制性性内内切切酶酶位位点点，分分别别用用方方框框表表示示靶靶DNA区区段段的的左左侧侧和和右右侧序列。侧序列。RACE
37、RACE技技术术（rapid rapid amplification amplification of of cDNA cDNA endsends）(Page 183)(Page 183)在在已已知知cDNAcDNA序序列列基基础础上上克克隆隆5 5或或3 3端端缺缺失失序序列列的的技技术术。根根据据已已知知序序列列设设计计基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物，由由该该片片段段向向外外侧侧进进行行PCRPCR扩扩增增得得到到目目的的序序列列。用用于于扩扩增增5 5端端的的方方法法称称为为5 5RACERACE，用于扩增用于扩增3 3端的称为端的称为3 3RACERACE。5 5 RACE
38、RACE在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性在反转录酶的作用下，以基因片段内部特异性引物（引物（GSP1GSP1）启始）启始cDNAcDNA第一条链合成。第一条链合成。RNaseRNase降解模板链降解模板链mRNAmRNA，纯化第一链。，纯化第一链。用末端转移酶在用末端转移酶在cDNAcDNA链链3 3端加入连续的端加入连续的dCTPdCTP。以连有以连有oligo(dG) oligo(dG) 的锚定引物和基因片段内部的锚定引物和基因片段内部特异的特异的nestednested引物进行引物进行PCRPCR扩增，得到目的片扩增，得到目的片段，用段，用nest PCRnest PCR检测。检
39、测。3RACE1、用用oligo(dT)锚锚定定引引物物启启始始cDNA第第一一链的合成链的合成.2、降解模板、降解模板mRNA.3、用用通通用用锚锚定定引引物物UAP和和基基因因片片段段内内部部特特异异引引物物进进行行PCR扩扩增增得得到到目目的的3片片段段，用用nest PCR法检测法检测.5. 2. 4 5. 2. 4 实时定量实时定量PCRPCR（real time quantitative PCRreal time quantitative PCR，Q-PCRQ-PCR）由由于于PCRPCR敏敏感感性性高高，扩扩增增产产物物总总量量变变异异系系数数大大，定定量量不不准准确确。9090
40、年年代代末末期期出出现现了了Q-Q-PCRPCR， 利利用用荧荧光光检检测测PCRPCR仪仪绘绘制制DNADNA扩扩增增过过程程中中的的累累积积速速率率动动态态变变化化图图，基基本本消消除除在在测测定定终终端端产产物物丰丰度度时时变变异异系系数数较较大大的的问问题。题。混混合合在在PCRPCR反反应应液液中中的的荧荧光光探探针针只只有有与与大大片片段段DNADNA结结合后，才能够被激发出荧光。合后，才能够被激发出荧光。随随着着新新合合成成DNADNA片片段段的的增增加加，由由于于结结合合到到DNADNA上上的的荧荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。非非
41、序序列列特特异异性性荧荧光光染染料料SYBR SYBR Green Green I I , , 激激发发光光波波长长520nm520nm。 SYBR Green I作作探探针针的的实实时时定定量量PCR实实验验过程图示过程图示 CtCt值值是是产产物物荧荧光光强强度度首首次次超超过过设设定定阈阈值值时时，PCRPCR反反应应所所需需的的循循环环数数。利利用用标标准准曲曲线线，可可以以确定样品中待检测靶确定样品中待检测靶DNADNA的绝对含量。的绝对含量。 图5-11用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量A 扩增曲线循环数荧光强度Log值循环数B标准曲线Han P., Li Q., a
42、nd Zhu Y.X. (2008) The Plant Cell 20:1482-1493.为为确确保保荧荧光光检检测测的的确确实实是是靶靶DNADNA，又又设设计计了了仅仅能能与与目的目的DNADNA特异结合的荧光探针。特异结合的荧光探针。TaqManTaqMan探探针针是是一一段段与与靶靶DNADNA序序列列中中间间部部位位结结合合的的单单链链DNADNA，长长50bp-150bp50bp-150bp，该该DNADNA的的5 5和和3 3端端带带有有短短波波长长和和长长波波长长两两个个不不同同荧荧光光基基团团，由由于于彼彼此此距距离离靠靠近近，在在荧荧光光共共振振能能量量转转移移（FRE
43、TFRET）作作用用下下发发生生荧荧光光淬灭，因而检测不到荧光。淬灭，因而检测不到荧光。随随着着PCRPCR反反应应的的进进行行，TaqMan TaqMan 探探针针结结合合到到目目的的DNADNA序序列列上上，并并且且会会被被具具有有外外切切酶酶活活性性的的Taq Taq DNADNA聚聚合合酶酶逐逐个个切切除除而而降降解解。切切下下来来的的荧荧光光基基团团解解除除了了荧荧光光淬淬灭灭的的束束缚缚，会会在在激激发发光光下下发发出出荧荧光光，因因此此，产产生生的荧光强度直接反映了所扩增靶的荧光强度直接反映了所扩增靶DNADNA的总量。的总量。TaqMan探探针针 实实 时时 定定量量 PCR技
44、技术术 线性范围的确定线性范围的确定5. 2. 5 5. 2. 5 基因组基因组DNADNA文库构建文库构建把把某某种种生生物物的的基基因因组组DNADNA切切成成适适当当大大小小，分分别别与与载载体体组组合合，导导入入微微生生物物细细胞胞，形形成成克克隆隆。汇汇集集包包含含基基因因组组中中所所有有DNADNA序序列列的的克克隆隆（理理论论上上每每个个序序列列至至少少有有一一个个代代表表），这这样样的的克克隆隆片片段段的的总总汇汇，称称为为基基因因组组DNADNA文库。文库。 构构建建基基因因组组文文库库最最常常用用的的是是噬噬菌菌体体载载体体（克克隆隆能能力力约约151520kb20kb）和
45、和限限制制性性内内切切酶酶部部分分消消化化法法。例例如如用用识识别别4 4个个核核苷苷酸酸的的核核酸酸限限制制性性内内切切酶酶Sau3ASau3A，与与BamHIBamHI是是一一对对同同尾尾酶酶消消化化DNADNA，由由Sau3ASau3A酶酶切切产产生生的的DNADNA片片段段可可插插入入到到经经BamHIBamHI消消化的化的噬菌体载体上。噬菌体载体上。图图5-13 用用Sau3A限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化真真核核生生物物基基因因组组DNA并并利利用用 噬噬菌菌体体载载体体构构建建基基因因组文库的过程图示。组文库的过程图示。 噬噬菌菌体体作作为为克克隆隆载体载体此此外外，还
46、还有有很很多多大大容容量量克克隆隆载载体体，如如柯柯斯斯质质粒粒、细细菌菌人人工工染染色色体体（BACBAC）、P1P1源源人人工工染染色色体体（PACPAC）、酵酵母母人工染色体（人工染色体（YACYAC）等都可用于基因组文库的构建。等都可用于基因组文库的构建。它它们们的的优优点点是是可可以以插插入入更更大大片片段段DNADNA，但但是是稳稳定定性性一一般般较较差差，在在大大量量复复制制的的过过程程中中容容易易出出现现缺缺失失现现象象。操操作也相对较困难。作也相对较困难。5. 3 RNA5. 3 RNA基本操作技术基本操作技术真真核核生生物物基基因因组组DNADNA庞庞大大，有有大大量量重重
47、复复序序列列，很很难难直直接接分分离离得得到到靶靶基基因因片片段段。而而cDNAcDNA来来自自反反转转录录的的mRNAmRNA，无无冗冗余余序序列列，通通过过筛筛选选cDNAcDNA文文库库，可较快地分离到相关基因。可较快地分离到相关基因。细细胞胞中中的的总总RNARNA包包括括mRNAmRNA，rRNA rRNA ，tRNAtRNA以以及及一一些些小小RNARNA（sRNAsRNA）。）。一个典型的动物细胞约含一个典型的动物细胞约含1010-5-5g RNAg RNA，其中：，其中：80%-85%80%-85%为为rRNArRNA15%-20%15%-20%为为tRNAtRNA及及sRNA
48、sRNAmRNAmRNA约占总约占总RNA RNA 的的1%-5%1%-5%rRNArRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是特别是28S28S和和18S18S特征性条带是电泳鉴定特征性条带是电泳鉴定总总RNARNA纯度和完整性的重要参数。纯度和完整性的重要参数。图图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯的分离纯化过程简图。化过程简图。RNARNA的的浓浓度度和和纯纯度度可可以以通通过过测测定定其其ODOD260260和和ODOD280280 来来判判断断。ODOD260260为为1 1时时相相当当于于浓浓度度为为40g/ml40g/ml，而而O
49、DOD260260/OD/OD280280的的比比值值如如果果在在1.8-2.01.8-2.0之之间间，表表示示所所提提取取的的RNARNA纯纯度度较较好好，如如果果样样品品中中有有蛋蛋白白质质或或酚酚污污染染，则则ODOD260260/ / ODOD280280的的比比值值将将明明显显低低于于1.81.8。由由于于RNARNA分分子子敏敏感感脆脆弱弱，在在自自然然状状态态下下难难以以被被扩扩增增，为为了了研研究究mRNAmRNA所所包包含含的的功功能能基基因因信信息息，一一般般将将其其反反转转录录成成稳稳定定的的DNADNA双双螺螺旋旋（cDNAcDNA，complementary comp
50、lementary DNADNA），再再插插入入到到可可以以自自我我复复制的载体中。制的载体中。 图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰因因为为绝绝大大多多数数大大肠肠杆杆菌菌细细胞胞都都会会切切除除带带有有5-5-甲甲基基胞胞嘧嘧啶啶的的外外源源DNADNA，所所以以实实验验中中常常选选用用mcrAmcrA- - mcrB mcrB- -菌株以防止菌株以防止cDNAcDNA被降解。被降解。 cDNAcDNA文库的构建文库的构建cDNAcDNA的长度一般在的长度一般在0.5-8 kb0.5-8 kb之间，质粒载体和噬菌
51、体类之间，质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。载体都能满足要求。cDNAcDNA文库常用文库常用Uni-zap XRUni-zap XR（一种一种噬菌粒载体）做载体，噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳的便利，可容纳0-10 kb DNA0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含有pBluescriptpBluescript载体的全部序列。载体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo ExcisionIn Vivo Excision）将）将cDNAcDNA插
52、入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。分析。 基因文库的筛选基因文库的筛选基基因因文文库库的的筛筛选选是是指指通通过过某某种种特特殊殊方方法法从从基基因因文文库库中中鉴鉴定定出出含含有有所所需需重重组组DNADNA分分子子的的特特定定克克隆隆的的过过程程。筛筛选选的的方方法法有有很很多多种种，如如核核酸杂交法，酸杂交法，PCRPCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。核酸杂交法：核酸杂交法： 核核酸酸杂杂交交法法以以其其广广泛泛的的适适用用性性和和快快速速性性成成为为基基因因文文库库筛筛选选中中最最常常用用的的一一种种方方法法，用用
53、放放射射性性标标记记的的特特异异DNADNA探探针针适适用用于于高高密密度度的的菌菌落落杂交筛选。杂交筛选。 将将待待筛筛选选菌菌落落转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。图 5-17 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图通过核酸杂交筛选目的克隆流程图取取出出已已经经长长有有菌菌落落的的膜膜，用用碱碱液液处处理理，使使菌菌落落发发生生裂裂解解，DNADNA随随之之变变性性。用用蛋蛋白白酶酶K K处处理理硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜去除蛋白质，形成菌落去除蛋白质，形成菌落DNADNA的印迹。的印迹。8080烘烘烤
54、烤滤滤膜膜，将将DNADNA固固定定在在膜膜上上。将将滤滤膜膜与与放放射射性性标标记记的的DNADNA或或RNARNA探探针针杂杂交交，通通过过放放射射性性自自显显影影显显示示杂杂交交结结果果。通通过过对对应应于于平平板板上上的的位位置置找找到到相相应应克克隆。隆。PCRPCR筛选法筛选法将将整整个个文文库库（以以质质粒粒的的形形式式或或者者细细菌菌的的形形式式均均可可）保保存存在在多多孔孔培培养养板板上上，用用设设计计好好的的目目的的基基因因探探针针对对每每个个孔孔进进行行PCRPCR筛筛选选，鉴鉴定定出出阳阳性性的的孔孔，把把每每个个阳阳性性孔孔中中的的克克隆隆再再稀稀释释到到次次级级多多
55、孔孔板板中中进进行行PCRPCR筛筛选选。重重复复以以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。免疫筛选法免疫筛选法 该该法法仅仅适适用用于于对对表表达达文文库库的的筛筛选选。若若实实验验中中靶靶基基因因的的序序列列完完全全未未知知但但是是有有针针对对该该基基因因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。图5-18 噬噬菌菌体体表表达达文文库的的免免疫疫化化学学筛选法示意法示意图 5. 4 5. 4 基因克隆（基因克隆（cloneclone）技术技术在在多多细细胞胞的的高高等等生生物物个个体体水水平平上
56、上，克克隆隆表表示示由由具具有有相相同同基基因因型型的的同同一一物物种种的的两两个个或或数数个个个个体体组组成成的的群群体体。从从同同一一受受精精卵卵分分裂裂而而来来的的单单卵卵双双生生子子（monozygotic monozygotic twinstwins）便便是是属属于于同同一一克克隆。隆。在在细细胞胞水水平平上上，克克隆隆一一词词是是指指由由同同一一个个祖祖细细胞胞（progenitor progenitor cellcell）分分裂裂而而来来的的一一群群带带有有完完全全相相同同遗传物质的子细胞。遗传物质的子细胞。在在分分子子生生物物学学上上，人人们们把把将将外外源源DNADNA插插入
57、入具具有有复复制制能能力力的的载载体体DNADNA中中，使使之之得得以以永永久久保保存存和和复复制制这这种种过过程程称为克隆。称为克隆。 5. 4. 1 cDNA5. 4. 1 cDNA差示分析法差示分析法(RDA, (RDA, Representation Difference Analysis)Representation Difference Analysis)通通过过降降低低cDNAcDNA群群体体复复杂杂性性和和更更换换cDNAcDNA两两端端接接头头等等方方法，特异性扩增目的基因片段。法，特异性扩增目的基因片段。因因为为TesterTester和和DriverDriver在在接接受
58、受差差示示分分析析前前均均经经一一个个4 4碱碱基基切切割割酶酶处处理理，形形成成平平均均长长度度256bp256bp的的代代表表群群，保保证证绝大部分遗传信息能被扩增。绝大部分遗传信息能被扩增。每每次次T T减减D D反反应应后后仅仅设设置置7272复复性性与与延延伸伸，9494变变性性这这两两个个参参数数共共2020个个PCRPCR循循环环，PCRPCR产产物物的的特特异异性性和和所所得探针的纯度高。得探针的纯度高。5. 4. 2 Gateway5. 4. 2 Gateway大规模克隆技术大规模克隆技术GatewayGateway技技术术利利用用噬噬菌菌体体进进行行位位点点特特异异性性DN
59、ADNA片片段段重重组组，实实现现了了不不需需要要传传统统的的酶酶切切联联接接过过程程的基因快速克隆和载体间平行转移。的基因快速克隆和载体间平行转移。Gateway大大规规模模克克隆策略隆策略TOPO反应反应:将将目目的的基基因因PCR产产物物连连入入Entry载载体体。载载体体上上的的CCCTT被被拓拓扑扑异异构构酶酶所所识识别别，通通过过与与切切口口处处的的磷磷酸酸基基团团形形成成共共价价键键，将将该该酶酶偶偶联联在在载载体体上上。5GTGG粘粘性性末末端端攻攻击击PCR产产物物的的互互补补性性末末端端并并与与接接头头序序列列CACC退退火火，使使PCR产物以正确方向连入产物以正确方向连入
60、Entry载体。载体。 LRLR反应：反应：将将目目的的片片段段从从Entry Entry 载载体体中中重重组组入入表表达达载载体体。EntryEntry载载体体上上基基因因两两端端具具有有attL1attL1和和attL2attL2位位点点，目目的的载载体体上上含含有有attR1attR1和和attR2attR2位位点点，在在重重组组蛋蛋白白的的作作用用下下发发生生定定向向重重组组，形形成成新新的的位位点点attB1attB1和和attB2attB2，将目的基因转移到表达载体中。将目的基因转移到表达载体中。Get Entry VectorGet Expression VectorGet cD
61、NATOPOLR5. 5. 4. 4. 3 3 基基 因因 的的 图图 位位 克克 隆隆 法法 （ Map-based Map-based cloningcloning）所所有有具具有有某某种种表表现现型型的的基基因因都都可可以以通通过过该该方方法法克克隆得到。隆得到。通通过过构构建建遗遗传传连连锁锁图图，将将目目的的基基因因定定位位到到某某个个染染色色体体的的特特定定位位点点，并并在在其其两两侧侧确确定定紧紧密密连连锁锁的的RFLPRFLP或或RAPDRAPD分子标记。分子标记。通通过过对对不不同同的的生生态态型型及及限限制制性性内内切切酶酶和和杂杂交交探探针针的的分分析析，找找出出与与目目
62、的的基基因因距距离离最最近近的的分分子子标标记记，通通过过染染色色体体步步移移法法将将位位于于这这两两个个标标记记之之间间的基因片段克隆并分离出来的基因片段克隆并分离出来.图图5-26 染色体步移法克隆基因示意图染色体步移法克隆基因示意图在在RFLPRFLP作作图图中中，连连锁锁距距离离是是根根据据重重组组率率来来计计算算的的，1cM1cM（厘厘摩摩）相相当当于于1%1%的的重重组组率率。人人类类基基因因组组中中，1cM1000kb1cM1000kb；拟拟南南芥芥菜菜中中，1cM290kb1cM290kb；小麦中，小麦中，1cM3500kb1cM3500kb。 用用图图位位克克隆隆法法获获得得
63、水水稻稻脆脆杆杆基因基因BCL A.将将BCL定定位位于于水水稻稻3号号染染色色体体（Chr3）分分子子标标记记C524a和和RM16之间；之间；B.B. 覆盖覆盖BCL位点的位点的BAC大片段。大片段。C. BCL位位点点的的精精细细定定位位。BCL位位点点被被定定位位于于分分子子标记标记P2和和P4之间与之间与P3共分离。共分离。D. BCL基基因因结结构构。红红色色为为编编码码区区，白白色色为为5和和3非非翻翻译译区区，黑黑色色线线段段为为内内含含子子。bcl-1和和bcl-2表示两个突变位点。表示两个突变位点。5. 5 5. 5 蛋白质与蛋白质组学技术蛋白质与蛋白质组学技术蛋蛋白白质质
64、组组学学是是蛋蛋白白质质（proteinprotein）和和基基因因组组（genomegenome）研研究究在在形形式式和和内内容容两两方方面面的的结结合合，该该技技术术致致力力于于研研究究某某一一物物种种、个个体体、器器官官、组组织织或或细细胞胞在在特特定定条条件件、特特定定时时间间所所表表达达的的全部蛋白质图谱。全部蛋白质图谱。蛋蛋白白质质组组与与基基因因组组既既相相互互对对应应又又有有显显著著不不同同，基基因因组组是是确确定定的的，每每个个个个体体只只有有一一个个基基因因组组，而而基基因因的的表表达达调调控控水水平平（蛋蛋白白组组）却却会会发发生生显著的变化。显著的变化。双向电泳技术双向
65、电泳技术TwoTwoDimensional ElectrophoresisDimensional Electrophoresis，2-D2-D等等电电聚聚焦焦（Isoelectric Isoelectric focusingfocusing，IEFIEF）及及SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶（SDS-PAGESDS-PAGE）双双向向电电泳泳技技术术。蛋蛋白白质质是是两两性性分分子子，在在不不同同pHpH缓缓冲冲液液中中表表现现出出不不同同的的带带电电性性，因因此此，在在两两性性电电解解质质电电泳泳体体系系中中，不不同同等等电电点点的的蛋蛋白白质质会会聚聚集集在在介介质质上上不不同
66、同的的区区域域（等等电电点点）从而被分离。从而被分离。蛋蛋白白质质的的分分子子量量决决定定了了SDS-SDS-蛋蛋白白复复合合物物在在凝凝胶胶电电泳泳中中的的迁迁移移率率，因因为为聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中的的SDSSDS带带有有大大量量的的负负电电荷荷，与与之之相相比比，蛋蛋白白质质所所带带电电荷荷量量可可忽忽略略不不计计。因因此此，蛋蛋白白质质在在SDSSDS凝凝胶胶电电场场中中的的运运动动速速度度和和距距离离完完全全取取决决于其分子量。于其分子量。 2D-EmapofproteinfromArabidopsisseeds30haftergermination蛋白质的质谱分析技术蛋白
67、质的质谱分析技术现现行行质质谱谱仪仪主主要要有有三三个个连连续续的的组组成成部部分分，即即离离子子源源，离子分离区和检测器。离子分离区和检测器。较常用的有基质辅助的激光解析电离较常用的有基质辅助的激光解析电离- -飞行时间质谱飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight spectrometryTime-Of-Flight spectrometry，MALDI-TOFMALDI-TOF）和电和电喷雾质谱（喷雾质谱（Elec
68、trospray ionizationElectrospray ionization，ESI-MSESI-MS）。）。MALDI-TOFMALDI-TOF的的工工作作原原理理：将将蛋蛋白白质质酶酶解解成成小小肽肽段段后后与与基基质质（主主要要是是有有机机酸酸）混混合合，将将样样品品混混合合物物点点到到金金属属靶靶表表面面上上并并使使之之干干燥燥结结晶晶，然然后后用用激激光光轰轰击击，将将呈呈离离子子化化气气体体状状态态的的待待分分析析物物从从靶靶表表面面喷喷射射出出去去。离离子子化化气气体体肽肽段段在在电电场场中中被被加加速速后后到到达达检检测测器器的的时时间间由由肽肽段段的质量和其所带电荷数
69、的比值（的质量和其所带电荷数的比值（m/zm/z）决定。决定。蛋白质免疫印迹实验（蛋白质免疫印迹实验（Western BlottingWestern Blotting）：）：是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠是检测样品中是否存在蛋白抗原的一种可靠方法。主要分为方法。主要分为a a、蛋白样品的制备；蛋白样品的制备；b b、SDS-PAGESDS-PAGE分离分离; ;c c、转膜载并封闭膜上未反应位点，减少非特转膜载并封闭膜上未反应位点，减少非特异性吸附；异性吸附；d d、与相应非标记抗体（一抗）反应；与相应非标记抗体（一抗）反应；e e、洗去多余的一抗，加酶偶联或放射性同位洗去多余的一抗，加酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。测凝胶中的蛋白成分。
