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1、1发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术本章内容本章内容一、一、概念概念 二、二、发酵工业污染的防治策略发酵工业污染的防治策略三、三、发酵工业的无菌技术发酵工业的无菌技术四、四、培养基及设备灭菌培养基及设备灭菌 五、五、空气除菌空气除菌2发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术一、概念一、概念: :灭菌、消毒、除菌、灭菌、消毒、除菌、防腐防腐n灭灭菌菌(sterilization):用用化化学学或或物物理理方方法法杀杀死死物物料料或或设设备备中中所所有有有有生命物质的过程。生命物质的过程。消消毒毒(disinfection):用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死空空气气、地地表表以以及及容容器器和和器具
2、表面的微生物。器具表面的微生物。除除菌菌(degermation):用用过过滤滤方方法法除除去去空空气气或或液液体体中中的的微微生生物物及及其其孢孢子。子。 防防腐腐( (antisepsis):用用物物理理或或化化学学方方法法杀杀死死或或抑抑制制微微生生物物的的生生长长和和繁繁殖殖。n消毒与灭菌的区别消毒与灭菌的区别n消毒与灭菌在发酵工业中的应用消毒与灭菌在发酵工业中的应用3发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术二、发酵工业污染的防治策略二、发酵工业污染的防治策略（一）（一）污染的危害污染的危害（二）（二）污染的防治污染的防治 4发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术1.1.染菌的不良后果染菌的不良后果
3、n消耗营养消耗营养n合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难n改变改变pHn分解产物分解产物n噬菌体破坏极大噬菌体破坏极大5发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术2.染菌危害的具体分析染菌危害的具体分析（1 1）染菌对不同菌种发酵的影响）染菌对不同菌种发酵的影响A细菌细菌n谷谷氨氨酸酸：发发酵酵周周期期短短，培培养养基基不不太太丰丰富富，较较少少染杂菌，但噬菌体威胁大。染杂菌，但噬菌体威胁大。n肌肌苷苷：缺缺陷陷型型生生产产菌菌，培培养养基基丰丰富富，易易染染菌菌，营营养养成成分分迅迅速速被被消消耗耗，严严重重抑抑制制菌菌生生长长和和合合成成代谢产物。代谢产物
4、。6发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术B.霉菌霉菌nPenG：青青霉霉素素水水解解酶酶上上升升，PenG迅迅速速破破坏坏，发酵一无所获。发酵一无所获。n柠柠檬檬酸酸：pH2.0，不不易易染染菌菌，主主要要防防止止前前期期染染菌。菌。C.酵母菌酵母菌:易污染细菌以及野生酵母菌易污染细菌以及野生酵母菌D.疫疫苗苗：无无论论污污染染的的是是活活菌菌、死死菌菌或或内内外外毒毒素素，都应全部废弃。都应全部废弃。（1）染菌对不同菌种发酵的影响染菌对不同菌种发酵的影响7发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（2）染菌种类对发酵的影响染菌种类对发酵的影响n青霉素：怕染细短产气杆菌青霉素：怕染细短产气杆菌n链霉素：怕染
5、细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌n四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌n柠檬酸：怕染青霉菌柠檬酸：怕染青霉菌n肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌n谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染8发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响n种子扩大时期染菌种子扩大时期染菌: :n发酵前期染菌发酵前期染菌：n发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方，处理方法应根据各种发酵的特点和具
6、体情况来决定法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 抗生素发酵抗生素发酵 柠檬酸发酵柠檬酸发酵 a.污染细菌：加大通风，加速产酸，调污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制抑制细菌细菌b.污染酵母：加入污染酵母：加入0.0250.035g/LCuSO4抑制酵母；抑制酵母；通风加大，加速产酸。通风加大，加速产酸。灭菌后弃去灭菌后弃去应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种9发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响）不同发酵时期染菌对发酵的影响n柠檬酸发酵柠檬酸发酵c.染染黄黄曲曲霉霉：加加入入另另一一罐罐将将近近发
7、发酵酵成成熟熟的的醪醪液液，pH下下降，黄曲霉自溶。降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。很低下能够生长。提前放罐。n发发酵酵后期污染后期污染n染菌量不太多，可继续发酵染菌量不太多，可继续发酵n污染严重，则提前放罐污染严重，则提前放罐杀菌剂的添加：杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价发现后加入，效果要具体评价10发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响n丝状菌发酵被产酸菌污染：丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自不断下降，菌丝
8、大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：处理方法：将发酵液加热后再加助滤剂；将发酵液加热后再加助滤剂；先加絮凝先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀剂使蛋白质凝聚后沉淀n杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化极易发生乳化11发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术1. 染菌的检查与判断染菌的检查与判断n显微镜检查法显微镜检查法镜检出杂菌需要一定时间镜检出杂菌需要一定时间n平板划线培养或斜面培养检查法：菌落平板划线培养或斜面
9、培养检查法：菌落噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑n肉汤培养检查法肉汤培养检查法n发酵过程的异常现象判断发酵过程的异常现象判断nDO2水平异常变化水平异常变化npH异常变化异常变化n尾气尾气CO2异常变化异常变化12发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术1213发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术2. 污染原因分析污染原因分析n主要原因：主要原因：种子带菌种子带菌无菌空气带菌无菌空气带菌设备渗漏设备渗漏灭菌不彻底灭菌不彻底操作失误操作失误技术管理不善技术管理不善n14发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n从从污污染染时时间间看看：早早期期污污染染可可能能与与接接种种操操作作
10、不当有关；后期污染可能与不当有关；后期污染可能与及中间补料有关。及中间补料有关。n从杂菌种类看：从杂菌种类看：n耐热芽孢杆菌：与耐热芽孢杆菌：与有关有关n球菌、无芽孢杆菌：与球菌、无芽孢杆菌：与 有关有关n浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏n霉霉菌菌：与与有有关关，即即无无菌菌室室灭灭菌菌不不彻彻底底或或操操作作问问题题n酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长n从从染染菌菌幅幅度度看看：各各个个发发酵酵罐罐或或多多数数发发酵酵罐罐染染菌菌，且且所所污污染染的的是是同同一一种种杂杂菌菌，一一般般是是空空气气系系统
11、统问问题题，若若个个别别罐连续染菌，一般是设备问题。罐连续染菌，一般是设备问题。2. 污染原因分析污染原因分析15发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术3. 预防预防n种子带菌的防治种子带菌的防治 n灭菌彻底灭菌彻底n接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠靠n保藏可靠保藏可靠n过滤空气带菌的防治过滤空气带菌的防治n设备的渗漏或设备的渗漏或“死角死角”造成的染菌及其防治造成的染菌及其防治16发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术 “死角死角”n发酵罐的发酵罐的“死角死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅
12、拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口料管口 发酵罐罐底发酵罐罐底脓疱状积垢脓疱状积垢造成造成“死角死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀放汽边阀n管道安装不当或配置不合理管道安装不当或配置不合理形成的形成的“死角死角” 17发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术发酵罐罐底脓疱状积垢造成发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角死角”18发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术法兰连接不当造成的法兰
13、连接不当造成的“死角死角”19发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术灭菌时蒸汽不易通达的灭菌时蒸汽不易通达的“死角死角”及其消除方及其消除方法法20发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n培养基与设备灭菌不彻底的防治培养基与设备灭菌不彻底的防治n原料性状：大颗粒的原料过筛除去。原料性状：大颗粒的原料过筛除去。n实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。n灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶防止泡沫升顶n连消不彻底连消不彻底：最好采用自动控制装置：最好采用自动控制装置n灭菌后期罐压骤变灭菌后期罐压骤变n死角死角n操作不当造成染菌
14、操作不当造成染菌n噬菌体染菌及其防治噬菌体染菌及其防治 3. 预防预防21发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术采取哪些措施能够保持无菌发酵？采取哪些措施能够保持无菌发酵？n物料、培养基、中间补料要灭菌；物料、培养基、中间补料要灭菌；n发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；n好气发酵通入的空气要除菌；好气发酵通入的空气要除菌；n种子无污染；接种无菌操作过关种子无污染；接种无菌操作过关；n为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。22发酵工程余龙江版发酵工
15、业无菌技术三、发酵工业的无菌技术三、发酵工业的无菌技术灭菌方法灭菌方法n干热灭菌法干热灭菌法 n湿热灭菌法湿热灭菌法 n射线灭菌法射线灭菌法 n化学药剂灭菌法化学药剂灭菌法n过滤除菌法过滤除菌法n火焰灭菌法火焰灭菌法23发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术四、培养基及设备灭菌四、培养基及设备灭菌（一）（一）湿热灭菌原理湿热灭菌原理 （二）（二）分批灭菌（实罐灭菌）分批灭菌（实罐灭菌） （三）（三）连续灭菌（连消）连续灭菌（连消）（四）（四）分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较24发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术1. 热阻热阻2. 微生物热死定律：对数残留定律微生物热死定律：对数残留定律
16、3.灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素（一）湿热灭菌原理（一）湿热灭菌原理25发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术1. 热阻热阻n定义：定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死比死亡速率常数亡速率常数k来表示来表示 。 k，热阻热阻,t26发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n当温度当温度T一定时，一定时，k随微生物不同而不同，具体随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。值为标准。n当当T变化时，变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律
17、尼乌斯定律k=Aexp(-E/RT)k与微生物活化能及与微生物活化能及T有关有关1. 热阻热阻27发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术大肠杆菌在不同温度下大肠杆菌在不同温度下的残留曲线的残留曲线嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线温度下的死亡曲线28发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术29发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术2. 微生物热死定律：微生物热死定律：(1) 对数残留定律对数残留定律n在在一一定定温温度度下下，微微生生物物受受热热致致死死遵遵循循分分子子反反应应速速度度理理论论，微微生生物物受受热热死死亡亡的的速速率率-dN/dt与与任任何何瞬瞬间间残残留留的的活
18、活菌菌数数N成正比，即成正比，即 当当Nt=0时，时，t=， 既无意义，也不可能。既无意义，也不可能。一般采用一般采用Nt=0.001，即即1000次灭菌中只有一次失败次灭菌中只有一次失败。30发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术(2) 非对数残留定律非对数残留定律n某些微生物受热死亡的速率某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律不符合对数残留定律：如一些微：如一些微生物芽孢。生物芽孢。kRksNRNsNDdNR/dt=-kRNRdNs/dt=kRNR-ksNsNt/N0=KR/(kR-kS)ekst-ks/kRe-kRt式中式中NR：耐热性活芽孢数；耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数敏感性活
19、芽孢数ND：死亡的芽孢数死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率耐热性芽孢的比死亡速率；ks：敏感性芽孢的比死亡速率；敏感性芽孢的比死亡速率；N0：初始活芽孢数。初始活芽孢数。31发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n培养基中含有大量的不耐热的微生物和培养基中含有大量的不耐热的微生物和相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留曲线曲线 在在T相相同同时时，对对数数与与非非对对数数定定律律的的灭灭菌菌时时间间t不同。不同。32发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术3. 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择n培养物质受热破坏也可看作一级反应：培养物质受热破坏也可看作一级反应：
20、式中式中C：对热不稳定物质的浓度；对热不稳定物质的浓度；k：分解速度常数分解速度常数；k的变化也遵循阿累尼乌斯方程：的变化也遵循阿累尼乌斯方程： 都与相应的活化能及都与相应的活化能及T有关有关33发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术当当T1T2(k2/k1)/(k2/k1)=E/E1(EE)随随着着T上上升升，菌菌死死亡亡速速率率增增加加倍倍数数大大于于培培养养基基成成分分分分解解速速率率增增加加倍倍数数，故故一一般般选择高温快速灭菌选择高温快速灭菌 。 3. 灭菌温度和时间的选择灭菌温度和时间的选择34发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素n培养基
21、成分培养基成分n油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性物等增加微生物的耐热性n低浓度（低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。以上，则减弱微生物的耐热性。35发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术npH：pH6.0-8.0，微微生生物物最最耐耐热热，pH6.0，H+易易渗渗入入微微生生物物细细胞胞内内，改改变变细细胞胞的的生生理理反反应应促促使使其其死死亡亡。培培养养基基pH愈愈低低，灭灭菌菌所所需
22、需时时间间愈愈短。短。n培养基的物理状态培养基的物理状态n泡泡沫沫：泡泡沫沫中中的的空空气气形形成成隔隔热热层层，对对灭灭菌菌极极为为不利，可加入少量消泡剂不利，可加入少量消泡剂 。n培养基中的微生物数量培养基中的微生物数量4. 影响培养基灭菌的其它因素影响培养基灭菌的其它因素36发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术分空气过滤器灭菌分空气过滤器灭菌并用空气吹干并用空气吹干夹套或蛇管排冷水，开启排夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽可夹套内通蒸汽达达70左右左右取样管取样管放料管放料管通蒸汽通蒸汽120，1105pa保温保温保温阶段，凡液面以下各管保
23、温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定角，维持压力、温度恒定罐压接近空气压力罐压接近空气压力向罐内通无菌空气向罐内通无菌空气保温结束，依次关闭保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门各排汽、进汽阀门夹套或蛇管中通冷水夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度培养基降温到所需温度（二）分批灭菌（实罐灭菌）（二）分批灭菌（实罐灭菌）1.灭菌工艺过程灭菌工艺过程37发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进
24、行，故可以到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式简单地利用式(N/N0)=-kt来粗略估算灭菌所需时间。来粗略估算灭菌所需时间。2. 灭菌时间的估算灭菌时间的估算38发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术2. 灭菌时间的估算灭菌时间的估算n例例1：有有一一发发酵酵罐罐内内装装40m3培培养养基基，在在1210C温温度度下下实实罐罐灭灭菌菌，原原污污染染程程度度为为每每1ml有有2105个个耐耐热热细细菌菌芽芽孢孢，已已知知1210C时时灭灭菌菌速速度度常常数数k=1.8min-1，求求灭灭菌菌失失败败机机率为率为0.001时所需时间。时所需时间。解解：N0=401062105=8101
25、2(个)Nt=0.001(个)k=1.8(min-1)(Nt/N0)=-ktt=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(81015)=20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。故实际保温阶段时间比计算值要短。n39发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（三）连续灭菌（连消）（三）连续灭菌（连消）n工艺流程工艺流程n喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程n喷射加热连续灭菌流程喷射加热连续灭菌流程 n薄板式换热器
26、连续灭菌流程薄板式换热器连续灭菌流程 n灭菌时间的计算灭菌时间的计算 (Ct/C0)=ktt=2.303/klg(C0/Ct) 式中：式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。的含菌数。40发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n例例2某发酵罐内装某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为灭菌温度为1310C，原污染程度为每，原污染程度为每1ml含有含有2105个杂菌，已知个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为时灭菌速度常数为15min-1，求，求灭菌所需的维持时间。灭菌所需的维持时间。连续灭菌时间的估算连续灭菌时间的估算
27、解：解：C0=2105(个/ml)Ct=0.001/(40106)=2.510-11(个/ml)t=2.303/klg(C0/Ct)=2.303/15lg(2105)/(2.510-11)=2.37min41发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术喷淋冷却连续灭菌流程喷淋冷却连续灭菌流程42发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术43发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较n连续灭菌的优点：（适用于大型罐）连续灭菌的优点：（适用于大型罐） n可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；利于提高发酵产率；n发酵罐利用率高；
28、发酵罐利用率高； n蒸汽负荷均衡；蒸汽负荷均衡； n采用板式换热器时，可节约大量能量；采用板式换热器时，可节约大量能量；n适宜采用自动控制，劳动强度小；适宜采用自动控制，劳动强度小；n可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。44发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n缺点：缺点：n对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；n蒸汽波动时灭菌不彻底；蒸汽波动时灭菌不彻底；n当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防
29、止灭菌不彻底。以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。分批灭菌与连续灭菌的比较分批灭菌与连续灭菌的比较45发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术五、空气除菌五、空气除菌（一）（一）概述概述（二）（二）空气过滤除菌流程空气过滤除菌流程（三）（三）空气预处理空气预处理（四）（四）空气预处理流程设计应用举例空气预处理流程设计应用举例（五）（五）空气过滤介质空气过滤介质（六）（六）空气过滤除菌原理空气过滤除菌原理（七）（七）提高过滤除菌效率的措施提高过滤除菌效率的措施46发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（一）概述（一）概述n空气除菌的必要性空气除菌的必要性 以一个以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为的发酵罐为例，
30、若装料系数为0.7，要，要求每立方米发酵液每分钟通气求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期，培养周期170h，那么每个周期需通气量，那么每个周期需通气量2.86105m3(500.70.817060)，而每，而每立方米大气中立方米大气中约有约有103-104个微生物。个微生物。47发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n空气除菌方法空气除菌方法n辐辐射射杀杀菌菌：超超声声波波、高高能能阴阴极极射射线线，x射射线线、射射线线、射线、紫外线射线、紫外线(22653287)n加加热热杀杀菌菌：加加热热方方法法可可用用蒸蒸汽汽、电电和和空空气气压压缩缩机机产产生的热量生的热量n静静电电除除菌菌：常常
31、用用于于洁洁净净工工作作台台、洁洁净净工工作作室室所所需需无无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。n过过滤滤除除菌菌：采采用用定定期期灭灭菌菌的的介介质质来来阻阻截截流流过过的的空空气气所所含含的的微微生生物物而而取取得得无无菌菌空空气气。常常用用的的过过滤滤介介质质有有棉棉花花、活活性性炭炭、玻玻璃璃纤纤维维、有有机机合合成成纤纤维维、有有机机和和无机烧结材料等等。无机烧结材料等等。（一）概述（一）概述48发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术49发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术1. 对空气过滤除菌流程的要求对空气过滤除菌流程的要求n流程主要设备
32、：流程主要设备：空气压缩机空气压缩机 、空气过滤器空气过滤器 附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器50发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条流程的制定应根据所在地的地理、气候环境和设备条件综合考虑件综合考虑 n环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件；环境污染比较严重的地方，要考虑改变吸风的条件；n在温暖潮湿的南方，要加强除水设施在温暖潮湿的南方，要加强除水设施 ；n压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的压缩机耗油严重的设备流程中则要加强消除油雾的污染污染 ，也可采用无油润滑
33、的往复式压缩机；也可采用无油润滑的往复式压缩机；n往复式压缩机，要配备前置往复式压缩机，要配备前置粗过滤器及空气贮罐粗过滤器及空气贮罐。n通常要求压缩空气的相对湿度通常要求压缩空气的相对湿度=50%60%时通过过时通过过滤器为好。滤器为好。1. 对空气过滤除菌流程的要求对空气过滤除菌流程的要求51发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术2. 空气除菌流程的分析空气除菌流程的分析n空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、空气除菌系统包括：冷却、分离油水、加热、 过滤过滤n几种典型的设备流程几种典型的设备流程 两级冷却、加热除菌流程两级冷却、加热除菌流程 冷热空气直接混合式空气除菌流程冷热空气直接混合式空
34、气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程高效前置过滤空气除菌流程将空气冷却至露点以上的流程将空气冷却至露点以上的流程利用热空气加热冷空气流程利用热空气加热冷空气流程一次冷却和析水的空气过滤流程一次冷却和析水的空气过滤流程n52发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（三）空气预处理（三）空气预处理1. 原理：原理：n除尘除尘(外源空气的前处理外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；器寿命；n降温降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利n除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水
35、滴）塞（因水滴）n加热：保持相对湿度加热：保持相对湿度n稳压：防止压力波动，贮罐稳压：防止压力波动，贮罐 2. 预处理流程设计预处理流程设计的简繁关键：去湿问题的简繁关键：去湿问题措施：建吸风塔、粗过滤器措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器效前置过滤器53发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术两级冷却、加热除菌流程图两级冷却、加热除菌流程图1-粗过滤器；粗过滤器；2-空压机；空压机；3-贮罐；贮罐；4，6-冷却器；冷却器；5-旋风分离器；旋风分离器；7-丝网分离器；丝网分离器；8-加热器；加
36、热器；9-过滤器过滤器 54发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术 冷热空气直接混合式空气除菌流程图冷热空气直接混合式空气除菌流程图 1-粗过滤器；粗过滤器；2-压缩机；压缩机；3-贮罐；贮罐；4-冷却器；冷却器；5-丝网分离器；丝网分离器；6-过滤器过滤器55发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术 利用热空气加热冷空气的流程示意图利用热空气加热冷空气的流程示意图1-高空采风；高空采风；2-粗过滤器；粗过滤器；3-压缩机；压缩机；4-热交换器；热交换器；5-冷却器；冷却器；6，7-析水器；析水器；8-空气总过滤器；空气总过滤器；9-空气分过滤器空气分过滤器56发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术 将空气冷却至
37、露点以上的流程将空气冷却至露点以上的流程1高空采风；高空采风；2粗过滤器；粗过滤器；3压缩机；压缩机；4冷却器；冷却器；5冷却器；冷却器；6空气空气总过滤器；总过滤器；7空气分过滤器空气分过滤器57发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术 高效前置过滤空气除菌流程图高效前置过滤空气除菌流程图1高效前置过滤器；高效前置过滤器；2压缩机；压缩机；3贮罐；贮罐；4冷却器；冷却器；5丝网分离器；丝网分离器；6加热器；加热器；7过滤器过滤器58发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术 一次冷却和析水的空气过滤流程示意图一次冷却和析水的空气过滤流程示意图1高空采风；高空采风；2粗过滤器；粗过滤器；3压缩机；压缩机；4冷却
38、器；冷却器；5，6析水器；析水器；7贮罐；贮罐；8加热器；加热器；9空气总过滤器；空气总过滤器；10空气分过滤器空气分过滤器59发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术空气压缩和压缩空气的冷却空气压缩和压缩空气的冷却n空气的压缩过程可看作绝热过程，故压缩后的空气温度与空气的压缩过程可看作绝热过程，故压缩后的空气温度与被压缩的程度有关：被压缩的程度有关：T2=T1(P2/P1)(k-1)/k 式式中中T1,T2压缩前后空气的绝对温度，压缩前后空气的绝对温度，KP1,P2 压缩前后空气的绝对压强，压缩前后空气的绝对压强，Pak绝热指数，空气为绝热指数，空气为1.4 若压缩为多变过程，则可用多变指数若压缩为
39、多变过程，则可用多变指数m（对于（对于 空气空气m=1.2-1.3）代替绝热指数）代替绝热指数k。60发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n例例3：20oC的大气被压缩至表压的大气被压缩至表压 2.5kg/cm2时温时温度是多少？度是多少？ 解：解：T1=20+273=293kP2/P1=（2.5+1.033）/1.033=3.42m=1.3T2=T1(P2/P1)(m-1)/m=2933.420.3/1.3=389kt2=389-273=116oC61发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术空气预处理流程设计空气预处理流程设计62发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术3. 几个概念几个概念n空气的绝对湿度：空
40、气的绝对湿度：1m3 湿空气中含有的水蒸气绝对量湿空气中含有的水蒸气绝对量(kg)n空气的相对湿度（空气的相对湿度（）：）：空气的绝对湿度与同温度下饱空气的绝对湿度与同温度下饱和绝对湿度之比值或者空气中水蒸汽分压与同温度时的和绝对湿度之比值或者空气中水蒸汽分压与同温度时的饱和水蒸汽压之比值，称为空气的相对湿度。饱和水蒸汽压之比值，称为空气的相对湿度。=Pw/Ps 式中式中 Pw空气中水蒸气分压，空气中水蒸气分压，Pa Ps同温度下水的饱和蒸气压，同温度下水的饱和蒸气压，Pa， 它可由各类手它可由各类手册中查到。册中查到。n空气的湿含量（空气的湿含量（X）：1kg干空气中含有的水汽量干空气中含有
41、的水汽量（kg/kg干空气干空气）63发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术空气的湿含量（空气的湿含量（X）设设Ggkg干空气中含干空气中含Gwkg水蒸汽时，则水蒸汽时，则X=Gw/Gg又又Pw/Pg=nw/ng=(Gw/Mw)/(Gg/Mg)=(Gw/Gg)(Mg/Mw)（Mw，Mg分别为水和空气的分子量分别为水和空气的分子量）X=Gw/Gg=(PwMw)/(PgMg)=(18/28.94)(Pw/Pg)=0.622Pw/(P-Pw)（4-1）64发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（1）与与X的关系的关系将将Ps=Pw代入式代入式4-1中得中得X=0.622Ps/（P-Ps）所以，已知某一温度所以，
42、已知某一温度T时时值值，便可求得便可求得X。当当X一定时一定时，T1T2，导致导致12，则则X1=0.6221Ps1/(P1-1Ps1)X2=0.6222Ps2/(P2-2Ps2)X1=X22=1(PS1/PS2)(P2/P1)（式（式4-2）65发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术当当X发发生生变变化化，即即有有水水析析出出时时，X降降低低，此此时时2=100%，定定义义：当当=1时时，空空气气中中水水蒸蒸气气已已饱饱和和，此此时时温温度度称称为为露点露点Td。当当TP1)压缩比压缩比愈大，露点愈高愈大，露点愈高68发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术加热后空气的温度加热后空气的温度n设设析析出出水
43、水后后，在在升升温温阶阶段段X=0，根根据据式式4-2可可以以求求出出析析水水后后应应升升温温到到多多少少度度才才能能满满足足相相对对湿湿度保持度保持50-60%。后=dPsd/Ps后Ps后=dPsd/后Ps后T后69发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n例例4：温度：温度20、=85%的空气，当压缩至的空气，当压缩至2.0kg/cm2时，温度为时，温度为120，求此时空气相对湿度是多少？若在，求此时空气相对湿度是多少？若在压力不变的情况下将温度冷却至压力不变的情况下将温度冷却至40后，相对湿度又后，相对湿度又是多少？是多少？已知：已知：20时时，Ps1=0.0238kg/cm2,120时时，Ps
44、2=2.025kg/cm2，40时时，Ps3=0.0752kg/cm2解：解：120时，相对湿度为时，相对湿度为40时，相对湿度为时，相对湿度为70发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n例例5：若将例：若将例4中空气继续冷却，至水析出，求露点中空气继续冷却，至水析出，求露点td？（假定压力不变）（假定压力不变）解：已知解：已知4100%，X一定一定，P一定一定由由所以所以查蒸汽压表，查蒸汽压表，0.059kg/cm2饱和蒸汽压对应温度饱和蒸汽压对应温度td35。所以，当所以，当t35，继续冷却时，有水析出继续冷却时，有水析出。71发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n例例6：若将例：若将例5中的空气冷
45、却至中的空气冷却至28（压力不变），求其（压力不变），求其湿含量为多少？并求每公斤干空气将析出多少水分？湿含量为多少？并求每公斤干空气将析出多少水分？（已知：（已知：28时，时，Ps50.0385kg/cm2）解：解：而最初而最初所以，每公斤干空气将析出水分：所以，每公斤干空气将析出水分：XX1-X50.0124-0.00800.0044水水72发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n例例7：若将例：若将例6中空气加热至中空气加热至38时，求其时，求其6？（38时时，Ps60.0675kg/cm2）解：升温时解：升温时X不变，不变，56时时值下降值下降也可根据也可根据X6X50.0080不变，由不变
46、，由得得73发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（五）空气过滤介质（五）空气过滤介质n棉花棉花n玻璃纤维玻璃纤维n活性炭活性炭 n超细玻璃纤维纸超细玻璃纤维纸 n石棉滤板石棉滤板 n烧结材料过滤介质烧结材料过滤介质 n新型过滤介质新型过滤介质 74发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（六）空气过滤除菌原理（六）空气过滤除菌原理75发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（六）空气过滤除菌原理（六）空气过滤除菌原理n布朗扩散截留作用布朗扩散截留作用n拦截滞留作用拦截滞留作用n惯性碰撞滞留作用惯性碰撞滞留作用n n重力沉降作用重力沉降作用重力沉降作用重力沉降作用n n静电吸引作用静电吸引作用静电吸引作用静电吸引作
47、用76发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术（七）提高过滤除菌效率的措施（七）提高过滤除菌效率的措施n减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择减少进口空气的含菌数量，主要方法：正确选择进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤进风口；提高进口空气的采气位置；采用粗过滤预处理。预处理。 n设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质。的过滤介质。n针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，针对不同地区，设计合理的空气预处理工艺流程，以达到除油、水和杂质的目的以达到除油、水和杂质的目的 。77发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术n降低进入空气过滤器的空气
48、相对湿度，保证过降低进入空气过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：滤介质能在干燥状态下工作，主要方法：使用使用无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除无油润滑的空气压缩机；加强空气冷却和去除油、水；提高进入过滤器的空气温度。油、水；提高进入过滤器的空气温度。n稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。稳定压缩空气的压力，采用合适容量的贮气罐。（七）提高过滤除菌效率的措施（七）提高过滤除菌效率的措施78发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术本章小结本章小结n掌握有关无菌技术的基本概念掌握有关无菌技术的基本概念n了解发酵工业污染的原因及其防治策略了解发酵工业污染的原因及其防治策略n掌握培养基及设备灭菌的基本原理、基本方掌握培养基及设备灭菌的基本原理、基本方法及灭菌时间的估算法及灭菌时间的估算n掌握空气除菌基本原理、流程及空气预处理掌握空气除菌基本原理、流程及空气预处理设计设计79发酵工程余龙江版发酵工业无菌技术
