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1、 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教学中一个重动物生物化学实验技术教学中一个重要实验之一。要实验之一。 可以带动生化实验技术综合型实验工程的开设。 如：蛋白质盐析沉淀提取 葡聚糖凝胶层析分别 DEAE-纤维素分别提纯蛋白质 蛋白质纯度鉴定、蛋白质分子量测定等。一、实验目的一、实验目的经过该实验使学生掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理；掌握该技术的操作方法根底性很强，运用范围宽阔；运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。二、实验原理二、实验原理 n带带电电质质点点在在电电场场中中向向带带有有异
2、异相相电电荷荷的的电电极极挪挪动动，这种景象称为电泳。这种景象称为电泳。n电泳分类：挪动界面电泳、区带电泳等。电泳分类：挪动界面电泳、区带电泳等。n区区带带电电泳泳 是是在在半半固固相相或或胶胶状状介介质质上上加加一一个个点点或或一一薄薄层层样样品品溶溶液液，然然后后加加电电场场，分分子子在在支支持持介质上或支持介质中迁移。介质上或支持介质中迁移。 区带电泳运用不同的支持介质，有滤区带电泳运用不同的支持介质，有滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，如今那么多用琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺PAGEPAGE
3、和琼脂糖凝胶。和琼脂糖凝胶。 一分类一分类 PAGEPAGE根根据据其其有有无无浓浓缩缩效效应应，分分为为延延续续系统和不延续系统两大类：系统和不延续系统两大类： 1. 1. 延延续续系系统统：电电泳泳体体系系中中缓缓冲冲液液pHpH值值及及凝凝胶胶浓浓度度一一样样，带带电电颗颗粒粒在在电电场场作作用用下下，主主要要靠靠电电荷和分子筛效应。荷和分子筛效应。 2.2.不不延延续续系系统统：由由于于缓缓冲冲液液离离子子成成分分、pHpH、凝凝胶胶浓浓度度及及电电位位梯梯度度的的不不延延续续性性，带带电电颗颗粒粒在在电电场场中中泳泳动动不不仅仅有有电电荷荷效效应应，分分子子筛筛效效应应，还还具具有有
4、浓浓缩缩效效应应，因因此此其其分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。分别条带明晰度及分辨率均较前者佳。 二特点：二特点： SDS- SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDSSDS十二十二烷基磺酸钠。烷基磺酸钠。 蛋蛋白白质质在在一一定定浓浓度度的的含含有有强强复复原原剂剂的的SDSSDS溶溶液液中中，与与SDSSDS分分子子按按比比例例结结合合，构成带负电荷的构成带负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物。蛋白质复合物。 蛋蛋白白质质丧丧失失了了原原有有的的电电荷荷形形状状构构成成仅仅坚坚持持原原有有分分子子大大小小为为特特征征的的
5、负负离离子子团团块块，降降低低或或消消除除了了各各种种蛋蛋白白质质分分子子之之间间天然的电荷差别，因此在进展电泳时，天然的电荷差别，因此在进展电泳时，蛋白质分子移速度取决于分子大小。蛋白质分子移速度取决于分子大小。当分子量在当分子量在15000KD15000KD到到200000KD200000KD之间时，之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。合下式：性关系。合下式： ，式中，式中 将知分子量的规范蛋白质的迁将知分子量的规范蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条移率对分子量对数作图，可获得一条规范曲线，未知蛋白质在一样条件下规范曲线，未知蛋白质在一样
6、条件下进展电泳，根据它的电泳迁移率即可进展电泳，根据它的电泳迁移率即可在规范曲线上求得分子量。在规范曲线上求得分子量。图1 规范蛋白质与待测样品电泳图谱 图2 电泳迁移率与logMW之间的关系 94 00062 00043 00031 00020 10014 400胶槽胶槽123注：胶槽1 规范蛋白；胶槽2、3 样品蛋白得到同行专家赞 采采用用SDS-SDS-聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳法法测测蛋蛋白白质质分分子子量量时时，必必需需完完全全翻翻开开蛋蛋白白质质之之间间的的二二硫硫键键，使使蛋蛋白白质质分分子子被被解解聚聚，SDSSDS才才干干定定量量地地结结合合到到亚亚基基上上。因因此
7、此在在用用SDSSDS处处置置样样品品同同时时用用巯巯基基乙乙醇醇处处置置。巯巯基基乙乙醇醇是是一一种种强强复复原原剂剂，它它使使被被复复原原的的二二硫硫键键不不易易再再氧氧化化，从从而而使使很很多多不不溶溶性性蛋蛋白白质质溶溶解解而而与与SDSSDS定定量结合。量结合。 三、三、 实验试剂和器材实验试剂和器材 资料 实验试剂 1.低分子量规范蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血洁白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200l蒸馏水，置-20保管
8、，运用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。 2. 30%丙烯酰胺丙烯酰胺Acr：称：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 Bis0.8g，加蒸馏水至，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，过滤后置棕色瓶中 3. 10%SDS十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠 4. 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取缓冲液：称取Tris18.2gPH计计 710%过硫酸铵过硫酸铵(AP) 8TEMED四甲基乙二胺四甲基乙二胺 9样品溶解液：样品溶解液：SDS100mg+巯基乙醇巯基乙醇0.1ml+ 溴酚蓝溴酚蓝2mg+甘油甘油2
9、g +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl2ml，最后定容至，最后定容至10ml。 10固定液：取固定液：取50%甲醇甲醇454ml，冰乙酸，冰乙酸46ml混匀。混匀。 11染色液：称取考马斯亮蓝染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固，加上述固定液定液 250ml， 过滤后备用。过滤后备用。 12脱色液：冰乙酸脱色液：冰乙酸75ml，甲醇，甲醇50ml，加蒸馏水定容，加蒸馏水定容至至1000ml。 13电极缓冲液内含电极缓冲液内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液pH8.3：称：称Tris6.0g，甘，甘 氨酸
10、氨酸28.8g，参与，参与SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。 实验器材实验器材n 垂直板电泳安装垂直板电泳安装n直直流流稳稳压压电电源源电电泳泳厚厚胶胶浓浓度度后后要要做做8各各小时，薄胶小时，薄胶5各小时各小时n 电泳仪电泳仪n 规范型酸度计规范型酸度计TLD80-2Bn 离心机等离心机等 四、四、实验过程程 如：免疫球蛋白如：免疫球蛋白G G 分子量的分子量的测定定 一血清一血清-球蛋白的提取球蛋白的提取 硫酸胺硫酸胺盐析沉淀法析沉淀法 二二 - -球蛋白脱球蛋白脱盐纯化化 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶过滤柱柱层析法除析法除去硫酸胺，得到去硫酸胺，得到-球
11、蛋白去年完球蛋白去年完成的基金工程成的基金工程 三三纯化免疫球蛋白化免疫球蛋白G G DEAE- DEAE-离子交离子交换纤维素法素法纯化免疫球化免疫球蛋白蛋白G G。 四四 SDS- SDS-聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳法泳法测定血液免疫球蛋白定血液免疫球蛋白G G的分子的分子量量 延延续四个四个单项实验。 1 1制胶简单表达双层胶，探制胶简单表达双层胶，探求胶浓度求胶浓度 A. A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, , 预备预备2 2个干净的锥形瓶。把玻璃板在灌个干净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。胶支架上固定好。 B. B.按比例配好分别胶，溶液立刻按比例配好分别
12、胶，溶液立刻倾入制胶模板中倾入制胶模板中(1 5(1 5模板模板) )，加少，加少许蒸馏水，待胶凝固后，倒出水并用许蒸馏水，待胶凝固后，倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，延续平稳参与浓缩胶至离边浓缩胶，延续平稳参与浓缩胶至离边缘缘5mm5mm处，样梳需一次平稳插入，静置处，样梳需一次平稳插入，静置4040分钟，待模板中的胶定型后，悄然分钟，待模板中的胶定型后，悄然取出梳形样品槽模具，梳口处不得有取出梳形样品槽模具，梳口处不得有气泡，拔出样梳后，在上槽内参与缓气泡，拔出样梳后，在上槽内参与缓冲液。冲液。 C. C.拔出拔出样梳后梳后, ,在上槽内参
13、与在上槽内参与缓冲液冲液, , D. D.加加样探求加探求加样量量 取取10l10l规范蛋白溶解液范蛋白溶解液于于EPEP管内，再参与管内，再参与10l 210l 2倍倍样品品缓冲液，上冲液，上样量量为20l20l。 取取10l10l样品溶液，再参与品溶液，再参与10l 210l 2倍倍样品品缓冲液，冲液，上上样量分量分别为5l 5l 和和10l10l。 E. E.用微量注射器距槽底三分之一用微量注射器距槽底三分之一处进样, ,加加样前前, ,样品在沸水中加品在沸水中加热3 3分分钟，去掉，去掉亚稳态聚合。聚合。 F. F.电泳槽中参与泳槽中参与缓冲液，接通冲液，接通电源，源，进展展电泳，开泳
14、，开场电流恒定在流恒定在8mA8mA，电流、流、电压当当进入分入分别胶后改胶后改为16mA16mA，溴酚，溴酚蓝距凝胶距凝胶边缘约5mm5mm时，停，停顿电泳。泳。 G. G.凝胶板剥离与染色凝胶板剥离与染色 电泳泳终了后，撬了后，撬开玻璃板，将凝胶板做好开玻璃板，将凝胶板做好标志后放在大培育皿志后放在大培育皿内，参与染色液，染色内，参与染色液，染色 过夜。夜。 H. H.脱色脱色 染色后的凝胶板用蒸染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗水漂洗数次，再用脱色液脱色数次，再用脱色液脱色 。剥胶剥胶时要小心要小心, ,坚持胶完好无持胶完好无损, ,染色要充分。染色要充分。图1 规范蛋白质与待测样品电泳图谱 图
15、2 电泳迁移率与logMW之间的关系 五、实验结果分析五、实验结果分析94 00062 00043 00031 00020 10014 400胶槽胶槽123注：胶槽1 规范蛋白；胶槽2、3 样品蛋白六、分析计算六、分析计算绘制规范曲线：按下式计算绘制规范曲线：按下式计算 电泳迁移率电泳迁移率 = 样品迁移间隔样品迁移间隔/溴酚篮迁移间隔溴酚篮迁移间隔 以每个蛋白规范的分子量对数对它的以每个蛋白规范的分子量对数对它的相对迁移率作图得规范曲线，量出未知蛋白相对迁移率作图得规范曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子
16、量测定才线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。具有可靠性。 规范蛋白分子量规范试剂盒： 97400kD、66200kD、43000kD、 31000kD、20210kD、14400kD。 采用不延续SDS-PAGE电泳法对所分别纯化的蛋白质进展纯度鉴定，发现图中电泳图谱可以明晰的看到两条蛋白带。 两条蛋白带代表绵羊免疫球蛋白G的重链和轻链。 计算分析结果阐明： 绵羊血清lgG重链和轻链的分子量分别为50000和28000Kd。普通说来，当蛋白质的分子量在200000至15000 kD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系 。实验结果各谱带所代表的成分的分子量的范围均在此之间。
17、用SDS-PAGE垂直板电泳测得绵羊血清具有一定的可信度 。 七、思索题七、思索题n在不延续体系SDS-PAGE中,当分别胶加完后,需在其上加一层水,为什么?n在不延续体系SDS-PAGE中,分别胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?n样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟? 十二、到达预期目的十二、到达预期目的 1. SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳技术是动物生物化学实验技术教技术是动物生物化学实验技术教学中一个综合性实验工程，学中一个综合性实验工程， 且是且是一个较高程度的一个实验工程。一个较高程度的一个实验工程。 蛋白蛋白质盐析沉淀提取析沉淀提取 凝胶凝胶层析分析分
18、别上年基金工程已完成上年基金工程已完成 DEAE-纤维素分素分别提提纯蛋白蛋白质 蛋白蛋白质分子量分子量测定、生物分子定、生物分子纯度度鉴定等定等综合工程五合工程五个个单项实验工程。工程。 2. 该工程的完成对我们课程的建立起到了促进开展的作用，到达了我们预期目的。 3. 该实验工程的开工程的开设，使学生掌，使学生掌握了利用聚丙稀握了利用聚丙稀酰胺凝胶胺凝胶电泳技泳技术分分别蛋白蛋白质 、SDSPAGE测定蛋白定蛋白质分子量的根本分子量的根本实际及及实验技技术。 4. 经过对生物大分子的分别、经过对生物大分子的分别、纯化、鉴定等过程的学习，使学生纯化、鉴定等过程的学习，使学生在综合性实验技术方面在综合性实验技术方面 有了一个系有了一个系统的认识及动手才干统的认识及动手才干, 为在现代分为在现代分子生物学技术等手段方面的运用打子生物学技术等手段方面的运用打下了良好的根底。下了良好的根底。 5.“SDS 聚丙稀聚丙稀酰胺凝胶胺凝胶电泳法泳法测定蛋白定蛋白质分子量一分子量一实验的开的开设到达了与国内同到达了与国内同类院校相当的院校相当的较高高程度。程度。 对本科生的本科生的实验教学、本科生的教学、本科生的论文文设计、研、研讨生的高生的高级生化生化实验等等方面都充方面都充实了内容。了内容。
