《精减9分子生物学技术简介08硕》由会员分享，可在线阅读，更多相关《精减9分子生物学技术简介08硕（42页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第九章第九章 分子生物学技术简介分子生物学技术简介核酸纯化技术与电泳技术核酸纯化技术与电泳技术PCR技术技术分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术基因靶向技术基因靶向技术Contents一、核酸纯化技术一、核酸纯化技术-DNA纯化纯化 1. 1. 核酸混合物成分核酸混合物成分: : 结构类结构类- -细胞碎片，细胞器，其他细胞碎片，细胞器，其他大分子大分子- -DNA，RNA，Protein，糖类，脂类等糖类，脂类等小分子小分子- -氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无氨基酸，小分子糖类和脂类，水，无机物等机物等 2. 2. 关键关键: : DNA，RNAProtein 3. 3. 方案：方案： P
2、rotein变性变性苯酚：强变性苯酚：强变性 2525氯仿：弱变性氯仿：弱变性 2424异戊醇：消泡异戊醇：消泡 1 1酚氯仿抽提法酚氯仿抽提法4. 苯酚的处理：重蒸苯酚的处理：重蒸- -饱和饱和-pH 重蒸：去除醌类氧化物重蒸：去除醌类氧化物 饱和：防止核酸损耗饱和：防止核酸损耗 pH： pH7.0-8.0-核酸最适合核酸最适合 方法：蒸馏方法：蒸馏（183）- -收集（棕色瓶）收集（棕色瓶）- -饱和与调饱和与调pH（Tris-HCl pH8.0）-0.1% 8-羟基喹啉羟基喹啉- 4 或或-20 保存保存一、核酸纯化技术一、核酸纯化技术-DNA纯化纯化方法方法样品样品+ +等体积饱和苯酚
3、等体积饱和苯酚10kb以上轻柔混匀；以上轻柔混匀；10kb以下振荡以下振荡离心离心（12000*g）取上清取上清核酸相核酸相ProteinProtein变性相变性相有机相有机相电泳影响因素电泳影响因素1. DNA物理性质物理性质 质粒：质粒： CCL OC 线形：长度与泳动速度成负相关线形：长度与泳动速度成负相关2. 介质性质介质性质 分离范围：分离范围：agrose：100bp-60kb PAGE：5-500bp3. 电压：电压：5v/cm4. 缓冲液：缓冲液：TAE，TBE，TPETris碱碱三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 不同二级结构形态及其电泳速度不同二级结构形态及其电泳速度Line
4、ar DNA. LOpen Circle DNA OC relexed formSupercoiled circleCovalent Closed Circle CCC点样孔点样孔核酸定量的原理核酸定量的原理核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在苷、核苷酸和核酸在240-290nm240-290nm的紫外波段的紫外波段有一强烈吸收峰，最大吸收值在有一强烈吸收峰，最大吸收值在260nm260nm附近。附近。纯核酸能用此法定量测定含量，但不纯样品纯核酸能用此法定量测定含量，但不纯样品不能用此法作定量检测。不能用此法
5、作定量检测。琼脂糖凝胶电泳分离出区带，用琼脂糖凝胶电泳分离出区带，用EBEB染色后在染色后在紫外灯下粗略估计含量。紫外灯下粗略估计含量。核酸定量的原理核酸定量的原理双螺旋双螺旋DNA：1OD260=50ug/ml单链单链DNA/RNA：1OD260=40ug/mloligonucleotide ：1OD260= 20 g/ml纯度：纯度：OD260/OD280=1.8-2.0小于小于1.8，表明有蛋白质污染，表明有蛋白质污染大于大于2.0，表明有，表明有RNA污染。污染。配配10M的引物贮液的引物贮液加多少加多少L ddH2ODouble-distilled核酸纯化技术与电泳技术核酸纯化技术与
6、电泳技术PCR技术技术分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术基因靶向技术基因靶向技术Contents二、二、PCR技术技术 PCR(polymerase chain reaction)即即聚聚合合酶酶链链反反应应技技术术，是是指指利利用用耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的反反复复作作用用，通通过过变变性性- -延延伸伸- -复复性性的的循循环环操操作作，在在体体外外迅迅速速将将DNA模模板板扩扩增增数数百百万万倍倍的的一一种种操操作作技术。技术。理论上可在理论上可在2小时内将一个小时内将一个DNA分子扩增到分子扩增到106-109倍，倍，从而大大提高了对其进行分析研究从而大大提高了对其进行分析研究的
7、速度。的速度。 PCR技术与技术与Nobel Prize Kary B. MullisMichael SmithPolymerase Chain Reaction-a copying machine for DNA molecules DNA molecules can be mass-produced from incredibly small amounts of material with PCR. Mullis discovery allows the chemist to mimic the cells own natural DNA replication process in a
8、 test tube. It has now become much easier to characterise and compare the genetic material from different individuals and organisms.From a drop of bloodExtracted DNAAbout 95,the ds are separated About 55,the primers bind to the strands at the correct positionsAbout 72,the DNA polymerase which is add
9、ed builds up two new complete copies of the DNA strands By cycling through the three temperatures the strands are separated and built up again. PCR反应系统的组成反应系统的组成 PCR反应系统应包括：反应系统应包括：1 1耐耐热热DNA聚聚合合酶酶（Taq酶酶）：这这是是由由耐耐热热细细菌菌体体内内提提取取的的一一种种DNA聚聚合合酶酶，可可保保证证在在95，30分钟以上不会变性失活。分钟以上不会变性失活。2 2模模板板DNA(template)：即
10、即待待分分析析的的目目的的DNA。3 3两两种种引引物物( (primers)：为为了了保保证证DNA聚聚合合酶酶能能够够对对两两条条互互补补链链均均能能进进行行延延伸伸，需需要要两两种种引引物物，分分别别位位于于两两条条互互补补模模板板DNA链链的的3 3- -端。端。 4 4四四种种脱脱氧氧核核糖糖核核苷苷酸酸( (dNTP) )：用用作作底底物的物的dNTPS。5 5缓缓冲冲溶溶液液（buffer）：保保证证DNA聚聚合合酶催化时所需的适当的溶液酶催化时所需的适当的溶液pH值。值。 PCR的反应原理的反应原理 PCR反反应应时时，一一般般采采用用变变性性- -复复性性- -延延伸伸三步循
11、环，也可采用三步循环，也可采用变性变性- -延伸延伸两步循环。两步循环。1 1变变性性：通通常常采采用用加加热热变变性性，即即将将模模板板DNA或或延延伸伸后后的的双双链链DNA加加热热到到950C，使双螺旋使双螺旋DNA解开成为单链。解开成为单链。 2 2复复性性：通通过过降降低低反反应应温温度度至至550C，使使两两种种引引物物能能与与两两条条解解开开的的DNA互互补补链链的的3端端粘粘合合，以以提提供供DNA聚聚合合酶酶催催化化聚聚合合所所需的需的3-OH。3 3延延伸伸：将将反反应应温温度度提提高高到到约约700C，在在耐耐热热DNA聚聚合合酶酶的的催催化化下下，根根据据模模板板DNA
12、提提供供的的碱碱基基顺顺序序，合合成成两两条条互互补补链链，从从而使模板而使模板DNA扩增一倍。扩增一倍。按按照照上上述述步步骤骤重重复复操操作作约约30次次，即即可可将将模板模板DNA扩增数百万倍。扩增数百万倍。 Cycle#1Cycle#2Cycle#3flashfilmPCR的主要用途的主要用途 （一）目的基因的克隆：（一）目的基因的克隆： 利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为模板，获得已知的目的基因；为模板，获得已知的目的基因； 利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文库中获得具有同源性的文库中获得具有同源性的DNA片段；片段； 利利用
13、用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文库中随机获得目的基因。文库中随机获得目的基因。 （二）基因的体外突变：（二）基因的体外突变：采采用用随随意意设设计计的的引引物物，在在体体外外对对基基因因进进行嵌合、缺失、点突变等改造。行嵌合、缺失、点突变等改造。（三）（三）DNA的微量分析：的微量分析：由由于于PCR技技术术具具有有高高度度敏敏感感性性，故故可可用用于微量于微量DNA的分析检测。的分析检测。 核酸纯化技术与电泳技术核酸纯化技术与电泳技术PCR技术技术分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术基因靶向技术基因靶向技术Contents（一）分子杂交：（一）分子杂交：不不同同来来源
14、源的的单单链链核核酸酸（DNA或或RNA），只只要要它它们们具具有有大大致致相相同同的的碱碱基基序序列列，经经过过退退火火处处理理，就就能能重重新新形形成成杂杂种种双双螺螺旋旋，这这一一现现象象称称为为分分子子杂交杂交（molecular hybridization）。利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组组DNA分子中的同源基因或同源序列分子中的同源基因或同源序列。 三、分子杂交与印渍技术三、分子杂交与印渍技术（二）印迹技术：（二）印迹技术：首先由首先由Edwen So
15、uthern在在1975年提出年提出。其其基基本本操操作作过过程程是是：将将DNA片片段段在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中电电泳泳分分离离后后，置置NaOH液液中中浸浸泡泡，从从而而将将凝凝胶胶中中的的DNA变变性性为为单单链链；然然后后将将一一张张硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜铺铺在在凝凝胶胶上上，上上面面放放上上大大量量吸吸水水纸纸巾巾，利利用用吸吸水水纸纸巾巾的的毛毛细细作作用用，将将单单链链DNA从从凝凝胶胶中中转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，再再将将膜膜置置80烘烘干干并并使使单单链链DNA分分子子固定固定在膜上，再用于分子在膜上，再用于分子杂交杂交分析。分析。用用于于DNA印印渍渍
16、的的技技术术又又称称为为Southern Blotting或或Southern 杂交。杂交。 Southern Blotting酶标记的探针杂交酶标记的探针杂交显色显色不同内切酶切基因组不同内切酶切基因组DNA变性、转移至硝酸纤维素膜上变性、转移至硝酸纤维素膜上酶切后的基因组酶切后的基因组DNA电泳电泳（三）探针技术：（三）探针技术：将将已已知知序序列列的的核核酸酸片片段段用用放放射射性性同同位位素素、生生物物素素、酶酶或或荧荧光光染染料料进进行行标标记记，然然后后用用于于分分子子杂杂交交，杂杂交交后后通通过过放放射射自自显显影影、荧荧光光检检测测或显色技术，使杂交区带显现出来。或显色技术，使
17、杂交区带显现出来。 印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用 （一）（一）DNA印迹技术：印迹技术： 又称又称Southern杂交，杂交，即即DNA-DNA杂交分析杂交分析。（二）二）RNA印迹技术：印迹技术： 又称又称Northern杂交，即杂交，即RNA-DNA杂交分析杂交分析。（三）蛋白质印迹技术：（三）蛋白质印迹技术： 又又称称Western杂杂交交，或或免免疫疫印印迹迹技技术术，即即利利用用抗抗原原-抗抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。（四）（四） Eastern杂交杂交， 通通过过电电转转移移法法将将等等电电聚聚焦焦分
18、分离离的的蛋蛋白白质质转转移移到到硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，利利用用抗抗原原-抗抗体体反反应应，检检测测转转移移到到膜膜上上特特异异性性蛋白质。蛋白质。* * 是是是是SouthernSouthern于于于于19751975年创建用以鉴定年创建用以鉴定年创建用以鉴定年创建用以鉴定DNADNA中中中中某一特定的基因片段的技术，也称为某一特定的基因片段的技术，也称为某一特定的基因片段的技术，也称为某一特定的基因片段的技术，也称为SouthernSouthern印迹（印迹（印迹（印迹（Southern BlotSouthern Blot）。）。）。）。* 通过标记的探针通过标记的探针通过标记的探
19、针通过标记的探针DNADNA与靶与靶与靶与靶DNADNA结合，检测结合，检测结合，检测结合，检测目的基因的存在及大小。目的基因的存在及大小。目的基因的存在及大小。目的基因的存在及大小。SouthernSouthern杂交杂交NorthernNorthern杂交杂交* * 也称为也称为也称为也称为NorthernNorthern印迹（印迹（印迹（印迹（Northern BlotNorthern Blot），），），），用以用以用以用以检测某一特定的检测某一特定的检测某一特定的检测某一特定的RNARNA（通常是通常是通常是通常是mRNAmRNA）片段的片段的片段的片段的存在及表达量。存在及表达量。
20、存在及表达量。存在及表达量。* 因与因与因与因与DNADNA的杂交（的杂交（的杂交（的杂交（Southern Southern 杂交）相对应，杂交）相对应，杂交）相对应，杂交）相对应，故被趣称为故被趣称为故被趣称为故被趣称为NorthernNorthern杂交。杂交。杂交。杂交。Western(Western(印迹印迹) )杂交杂交* * 蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经即检测蛋白质与标记
21、的特定蛋白抗体结合，经即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。质表达量。质表达量。质表达量。* 与与与与DNADNA、RNARNA水平上的水平上的水平上的水平上的SouthernSouthern杂交、杂交、杂交、杂交、NorthernNorthern杂交相对应，称为杂交相对应，称为杂交相对应，称为杂交相对应，称为WesternWestern杂交。杂交。杂交。杂交。* 常结合常结合常结合常结合NorthernNorthern印迹
22、技术，检测基因表达调控。印迹技术，检测基因表达调控。印迹技术，检测基因表达调控。印迹技术，检测基因表达调控。核酸纯化技术与电泳技术核酸纯化技术与电泳技术PCR技术技术分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术基因靶向技术基因靶向技术Contents四、基因靶向技术四、基因靶向技术“基因靶向基因靶向”技术是指利用细胞脱氧核糖核酸技术是指利用细胞脱氧核糖核酸( (DNA) )可与外源性可与外源性DNA同源序列发生同源重组同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。的性质，定向改造生物某一基因的技术。CapecchiEvansSmithies2007 Nobel Prize for physi
23、ology or medicine四、基因靶向技术四、基因靶向技术Gene targeting is a genetic technique that uses homologous recombination to change an endogenous gene. The method can be used to delete a gene, remove exons, and introduce point mutations. Gene targeting can be permanent or conditional. Conditions can be a specific t
24、ime during development / life of the organism or limitation to a specific tissue, for example. Gene targeting requires the creation of a specific vector for each gene of interest. However, it can be used for any gene, regardless of transcriptional activity or gene size. 基因敲除基因敲除 基因敲除（基因敲除（gene knock
25、-out）：利用基因利用基因打靶技术，用无功能的外源基因转入细打靶技术，用无功能的外源基因转入细胞与基因组中胞与基因组中同源序列同源序列进行进行同源重组同源重组，把具有功能的同源序列把具有功能的同源序列置换置换出来，造成出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。因敲除。关于诺贝尔奖关于诺贝尔奖两次获得两次获得NP的科学家的科学家波兰裔法国女物理学家、化学家居里夫人波兰裔法国女物理学家、化学家居里夫人 发现放射性物质荣获发现放射性物质荣获1903年诺贝尔物理学奖年诺贝尔物理学奖 发现并提炼出镭和钋发现并提炼出镭和钋1911年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖美
26、国物理学家巴丁因美国物理学家巴丁因 发明世界上第一支晶体管获发明世界上第一支晶体管获1956年诺贝尔物理学奖年诺贝尔物理学奖 提出超导微观理论获提出超导微观理论获1972年诺贝尔物理学奖年诺贝尔物理学奖美国化学家鲍林美国化学家鲍林 将量子力学应用于化学领域并阐明了化学键的本质获将量子力学应用于化学领域并阐明了化学键的本质获1954年化学奖年化学奖 致力于核武器国际控制并发起反对核实验运动荣获致力于核武器国际控制并发起反对核实验运动荣获1962年和平奖年和平奖 英国生物化学家桑格英国生物化学家桑格 发现胰岛素分子结构获发现胰岛素分子结构获1958年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 确定核酸的碱基排列顺
27、序及结构获确定核酸的碱基排列顺序及结构获1980年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 获诺贝尔奖的夫妇获诺贝尔奖的夫妇获获1903年诺贝尔物理学奖的法国科学家皮埃尔居年诺贝尔物理学奖的法国科学家皮埃尔居里和玛丽居里夫妇。里和玛丽居里夫妇。 获获1935年诺贝尔化学奖的法国科学家约里奥居里年诺贝尔化学奖的法国科学家约里奥居里夫妇。夫妇。 获获1947年诺贝尔生理学和医学奖的科里夫妇。年诺贝尔生理学和医学奖的科里夫妇。 获诺贝尔奖的父子获诺贝尔奖的父子共同荣获共同荣获1915年诺贝尔物理学奖的布拉格父子年诺贝尔物理学奖的布拉格父子分别荣获分别荣获1906年和年和1937年诺贝尔物理学奖的汤姆逊父子。年
28、诺贝尔物理学奖的汤姆逊父子。 分别荣获分别荣获1929年年诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖和和1970年诺贝尔生理学年诺贝尔生理学/ /医学奖的奥伊勒父子医学奖的奥伊勒父子分别荣获分别荣获1922年和年和1975年诺贝尔物理学奖的玻尔父子年诺贝尔物理学奖的玻尔父子分别荣获分别荣获1924年和年和1981年诺贝尔物理学奖的西格巴恩父年诺贝尔物理学奖的西格巴恩父子子分别荣获分别荣获1959年诺贝尔生理年诺贝尔生理/医学奖和医学奖和2006年诺贝尔化年诺贝尔化学奖的科恩伯格父子学奖的科恩伯格父子复习题复习题Southern blottingNorthern blotting Western blottingGene targetingGene knock-out
