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1、1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序团风中学团风中学 吴建兵吴建兵1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取一、目的基因的获取( (一一) )、目的基因主要是、目的基因主要是_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些（二）、获取目的基因的常用方法有哪些? ?1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术
2、扩增3 3、人工合成、人工合成阅读教材阅读教材P8-11如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因（1 1）. .基因文库基因文库 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种
3、生物的不同基因，称为基因文库。不同基因，称为基因文库。种种类类基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子基因的结构基因的结构启动子启动子原核原核真核真核原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非非编码区编码区非非编码区编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子不编码蛋
4、白质。不编码蛋白质。：编码蛋白质：编码蛋白质 , ,连续不间断连续不间断编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构调控遗传信息表达调控遗传信息表达, ,上上 游的游的RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点: :启动子启动子真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显外显子：能编码蛋白质的序列子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：
5、有调控作用：有调控作用, ,上游有上游有RNARNA聚合聚合酶结合位点酶结合位点( (启动子启动子) )。非非编码序列：编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子非非编码序列：编码序列：包括非编码区和内含子包括非编码区和内含子与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的，边的，边_边边_编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的，先的，先_后后_相同点相同点都由都由能够编码蛋白质的能够编码蛋白质的_和具有和具有调控作用的调控作用的_区组成的区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续连续不连续不连
6、续编码区编码区非编码非编码转录转录翻译翻译转录转录翻译翻译1下列关于基因结构的认识中，正确的是下列关于基因结构的认识中，正确的是（）A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C大肠杆菌基因与大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的聚合酶结合位点位于编码区的下游下游D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是是（）A编码区都有能编码蛋白质的序列编
7、码区都有能编码蛋白质的序列B编码区都是连续的编码区都是连续的C非编码区都能调控遗传信息的表达非编码区都能调控遗传信息的表达D非编码区都有非编码区都有RNA聚合酶结合的位点聚合酶结合的位点DACD提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶酶切用适当的限制酶酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接重组载体重组载体基因组文库基因组文库导入受体菌中储存导入受体菌中储存（2 2）. .基因文库的构建方法基因文库的构建方法基因组文库的构建基因组文库的构建提取某种生物的提取某种生物的某器官某器官或或特定发育时期特定发育时期的的mRNAmRN
8、A单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段重组载体重组载体与载体连接与载体连接cDNAcDNA文库文库反（逆）转录酶反（逆）转录酶DNADNA聚合酶聚合酶导入受体菌中储存导入受体菌中储存 cDNA文库的构建文库的构建-逆转录法：逆转录法： mRNARNADNA杂合双链杂合双链单链单链DNA双链双链DNA逆逆转转录录（cDNA）DNA聚合酶聚合酶真核生物的基因用逆转录法得到真核生物的基因用逆转录法得到的的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？原核生物基因呢？思考思考？编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码
9、区非编码区DNA聚合酶聚合酶剪接有关的酶剪接有关的酶RNA聚合酶聚合酶mRNA前体前体mRNA单链单链DNAcDNA逆转录酶逆转录酶转录转录剪接剪接逆转录逆转录复制复制启动子启动子启动子启动子终止子终止子基因基因不含不含非编码非编码系列系列。即不。即不含含非编码区非编码区和和内含子内含子（3 3）构建基因文库的目的）构建基因文库的目的 怎样从基因文库中得到我们怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢所需的目的基因呢? ? 便于在便于在不知道目的基因核苷酸序列不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。的情况下，获得所需的目的基因。依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如
10、：根据基因的核苷酸序列如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因的功能 基因在染色体上的位置基因在染色体上的位置 基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA 基因翻译产物蛋白质等特性基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法）从基因文库中得到目的基因的方法直接分离法直接分离法( (鸟枪法鸟枪法) )直接分离法直接分离法供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶受体细胞受体细胞产生特定性状产生特定性状导入导入外源外源DNADNA扩增扩增目的基因目的基因分离分离( (鸟枪法鸟枪法) )回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？回顾必修课中
11、目的基因的获取方法有哪些？多用于原核生物多用于原核生物某生物体内全部某生物体内全部DNADNA 许多许多DNADNA片段片段受体菌群体受体菌群体限制酶限制酶与运载体连接导入与运载体连接导入基因组文库基因组文库cDNAcDNA反转录反转录受体菌群体受体菌群体与运载体连接导入与运载体连接导入部分基因文库部分基因文库（cDNA文库）文库）基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较某种生物某个时期的某种生物某个时期的mRNAmRNA基因组基因组DNADNA文库文库cDNAcDNA文库文库基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较基因组基因组D
12、NADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较构建基因组构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的文库时，首先应分离细胞的A、染色体、染色体DNAB、线粒体、线粒体DNAC、总、总mRNAD、tRNA目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个片段，导入某个生物生物体内，则这个生物就是一个基因文库体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组
13、文库、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文文库库AC2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术。的核酸合成技术。 原理：原理：_多聚酶链式反应多聚酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 DNADNADNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶DNADNADNADNA连接酶连接酶连接酶连接酶DNADNADN
14、ADNA复制复制复制复制的条件的条件的条件的条件：模板DNA、脱氧核苷酸脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物引物PCR技术技术v原理：原理：v前提：前提：v原料：原料：v优点优点过程：过程：PCR扩增仪扩增仪DNA复制复制已知目的基因的一段核苷酸序列已知目的基因的一段核苷酸序列：以：以_方式扩增，方式扩增， 在短时间内大量扩增目的基因在短时间内大量扩增目的基因指数指数模板模板DNA；DNA引物；四种脱氧引物；四种脱氧核苷酸；热稳定核苷酸；热稳定DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）；离子酶）；离子变性变性 复性复性延伸延伸过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-95
15、90-95）：）：双链双链DNADNA模板在热作用下，模板在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：）：系统温度降低，系统温度降低，引物引物与与DNADNA模模板结合，形成局部板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶酶的作用下，合成与模板的作用下，合成与模板互补的互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链d.重复重复a.b.ca.b.c步骤：每重复一步骤：每重复一次，目的基因增加次，目的基因增加_倍倍一一过程：过程：PCRPCR反应体系中目的基因成反应体系中目的基因成反应体系中目
16、的基因成反应体系中目的基因成指数指数指数指数(2(2n n) )形式扩增形式扩增形式扩增形式扩增方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循环的次数）环的次数）条件：条件：_、 _、_ _ 、 _ _ 、前提条件、前提条件:_:_ 结果：结果：模板模板DNA(DNA(含目的基因含目的基因) )四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使使_在短时间内成百万倍地扩增在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段DNA复制复制PCR技术技术场所场所原理原理
17、条件条件解旋方式解旋方式酶酶特点特点结果结果PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模四种脱氧核苷酸、模板、酶、板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、四种脱氧核苷酸、模板、酶、模板、酶、引物引物DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋解旋酶催化解旋半保留复制、半保留复制、边解旋变复制边解旋变复制半保留复制、半保留复制、全解旋再复制全解旋再复制体外复制体外复制主要在细胞核内主要在细胞核内大量的大量的DNA片段片段形成整个形成整个DNA分子分子热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合
18、酶、聚合酶、解旋酶、解旋酶、DNA连接酶等连接酶等 1 1个个DNADNA分子进行分子进行PCRPCR扩增扩增, ,循环循环4 4次，理论上至少需要次，理论上至少需要几个引物几个引物？2（2n-1）(n为循循环次数次数)（24-1）2=30蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因化学合成化学合成推测推测推测推测3、人工合成法：、人工合成法：在在基因较小，核苷酸序列已知的情况基因较小，核苷酸序列已知的情况下，下，可以利用可以利用DNA合成仪人工合成合成仪人工合成化学法合成的目化学法合成的目的基因含的基因含内含子、
19、启内含子、启动子和终止子动子和终止子吗？吗？反转录法反转录法目的基因的信使目的基因的信使RNARNA目的基因目的基因化学合成法化学合成法肽链氨基酸序列肽链氨基酸序列信使信使RNARNA序列序列基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因目的基因合成合成人工合成法（人工合成法（真核生物真核生物）推测推测推测推测单链单链DNADNA合成合成那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢？那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢？一、目的基因的获取一、目的基因的获取1 1、从基因文库中获取、从基因文库中获取2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增技术扩增3 3、人工合成、人工合成种种类类基因组文库：基因组文
20、库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因部分基因文库：部分基因文库：只包含了一种生物的只包含了一种生物的部分部分基因，基因，如：如：cDNA文库文库课堂小结：课堂小结：2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成反转录形成 从基因组文库中提取从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A. B. C. D.A. B. C. D.1在已知在已知基因的核苷酸基因的核苷酸序列的情况下，获取目的序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是基因的
21、最方便方法是A、化学合成法、化学合成法B、基因组文库法、基因组文库法C、CDNA文库法文库法D、聚合酶链反应、聚合酶链反应3 3、 在基因工程中，把选出的一个目的基因（共在基因工程中，把选出的一个目的基因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩增仪中扩增扩增仪中扩增4 4次，那么，在扩增次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（ ）个）个A.540B.8100C.17280D.75601.加热至加热至95摄氏度的目的是使摄氏度的目的是使DNA中的中的断
22、裂，这一过程在细胞内是通过断裂，这一过程在细胞内是通过解旋酶解旋酶的作用来完成的。的作用来完成的。2.当温度降低时，引物与模板末端结合，在当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成后合成2个个DNA分子，此过程中的原料分子，此过程中的原料，遵循的原则是，遵循的原则是。3.Taq酶的特点是（酶的特点是（）A.耐强酸耐强酸B.耐强碱耐强碱C.耐高温耐高温D.最适温度最适温度37摄氏度摄氏度4.请指出请指出PCR技术与技术与DNA复制过程的区别复制过程的区别在遗传工程中，若有一个控制有利性状的在遗传工程中，若有一个控制有利性状
23、的DNA分子分子片段为片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是技术进行人工复制，复制时应给予的条件是双链双链DNA分子为模板分子为模板ATGTG或或TACAC模板链模板链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种核苷酸四种核苷酸DNA聚合酶聚合酶热热稳定稳定DNA聚合酶聚合酶引物引物温度变化温度变化恒温恒温ABCDD在基因工程中，把选出的目的基因（共在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入个）放入DNA扩扩增仪中扩增增仪中扩增4代，那么，在
24、扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是苷酸的个数是A.540个个 B.8100个个 C.17280个个D.7560个个B在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是方法是A、化学合成法、化学合成法B、基因组文库法、基因组文库法C、cDNA文库法文库法D、聚合酶链反应、聚合酶链反应下列获取目的基因的方法中需要模板链的是下列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因利用利用PCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因反转录法反转录法通过通过DNA合成仪利合成仪利用化学方法人工合
25、成用化学方法人工合成ABC DAD（1 1）用一定的）用一定的_切切割质粒，使其出现一个切口，割质粒，使其出现一个切口，露出露出_。（2 2）用）用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。（3 3）将切下的目的基因片段插入质粒的）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量处，再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同1.1.过程过程: :v基因表达载体的构建质粒质粒目的基因目的基因限制酶处理限制酶处理一个切口一个
26、切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶表表达达载载体体同一种同一种Hin d限制性酶限制性酶Hin dIIIHin dIII目的目的DNA质粒质粒构建表达载体构建表达载体四环素抗性基因由于目的基因插入而失四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因DNA连接酶连接酶人类胰岛素的基因人类胰岛素的基因2.2.基因表达载体的基因表达载体的组成：组成：它们所处的位置和有什么作用？它们所处的位置和有什么作用？a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因位于基因的
27、位于基因的首端首端,是是mRNA结合位点结合位点位于基因的位于基因的末端末端,终终止转录止转录检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞3、基因表达载体的作用、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中、使目的基因在受体细胞中稳定存在稳定存在并并遗传遗传给子代给子代b、同时使目的基因能、同时使目的基因能表达和发挥作用表达和发挥作用思考：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有
28、其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表
29、达水平，往往还要增加一些其为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；他调控元件，如增强子等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。载体载体与与表达载体表达载体的区别：二者都有标记基因的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分和复制原点两部分DNADNA片段。表达载体在载体片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因
30、、启动子、终止子三部基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构分结构用到的工具酶：用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又既用到限制酶切割载体，又用到用到DNADNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子启动子、终止子对于目的基因表达必不可少对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表必需以表达载体的方式携带进去。达载体的方式携带进去。注意注意 目的基因与运载体结合所需的条件有目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶同一种限制酶 具有抗性基因的
31、质粒具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶聚合酶 目的基因目的基因 DNA连接酶连接酶 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 ATP A BC D（多选）一个基因表达载体的构建应包括（多选）一个基因表达载体的构建应包括A目的基因目的基因B启动子启动子C终止子终止子D标记基因标记基因ABCDD下列关于基因表达载体的叙述不正确的下列关于基因表达载体的叙述不正确的是是A启动子是与启动子是与RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的部位，是起始密码部位，是起始密码B启动子和终止子都是特殊结构的启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对短片段，对mRNA的转录起调控作用的转录起调控作用C标记基因是为了鉴别受体细胞中
32、是否标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选有目的基因从而便于筛选D基因表达载体的构建视受体细胞及导基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别入方式不同而有所差别A常用的受体细胞：常用的受体细胞：原核生物：大肠杆菌原核生物：大肠杆菌 枯草杆菌枯草杆菌 土壤农杆菌土壤农杆菌真核生物：酵母菌和动植物细胞真核生物：酵母菌和动植物细胞将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。v将目的基因导入受体细胞转化：转化： 目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过
33、程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌）农杆菌转化法转化法特点特点:能感染能感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对对大多数单子叶植物无感染能力大多数单子叶植物无感染能力Ti质粒质粒的的TDNA可可转移转移至受体细至受体细胞并胞并整合整合到其染色体上到其染色体上转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表达表达载体载体导入导入植植物物细细胞胞整合整合 植物细胞染植物细胞染色体色体DNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌整合整合到染色体上到染色体上转移转移至受体细胞至受体细胞（2）基因枪法）基因枪法 基因枪法又称微
34、弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的基因与其整合并表达的方法。常用于单子叶植物的转化方法（2）基因枪法基因枪法微弹轰击法微弹轰击法特点：成本高特点：成本高适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊（3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后
35、，花粉形成的花粉管还未愈合花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。因借助花粉管通道进入受体细胞。我国转我国转我国转我国转基因抗基因抗基因抗基因抗虫棉就虫棉就虫棉就虫棉就是用这是用这是用这是用这种方法种方法种方法种方法获得获得获得获得2、将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞方法方法: 显微注射技术显微注射技术操作程序操作程序:提纯含目的基提纯含目的基因表达载体因表达载体取受精卵取受精卵显微注射显微注射移植到子宫移植到子宫早期胚胎早期胚胎新性状动物
36、新性状动物2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）取卵（受精卵） 显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物3、将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞常用法常用法：Ca2+处理处理常用菌常用菌：大肠杆菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：繁殖快繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少、多为单细胞、遗传物质相对少过程：过程：Ca2+处理处理大肠杆菌大肠杆菌感受态感受态细胞细胞表达载体表达载体与感受态与感受态细胞混合细胞混合感受态细感受态细胞吸收胞吸收D
37、NA 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞转化转化农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理处理植物基因植物基因工程工程动物基因动物基因工程工程微生物基微生物基因工程因工程常用方法常用方法受体细胞受体细胞比较目的基因导入不同细胞的方法比较目的基因导入不同细胞的方法农杆菌转农杆菌转化法化法显微注显微注射法射法Ca2+处处理法理法体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞1、基
38、因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是为受体细胞，原因是A结构简单、操作方便结构简单、操作方便B繁殖速度快繁殖速度快C遗传物质含量少、简单遗传物质含量少、简单D性状稳定、变异少性状稳定、变异少2、基因工程常用的受体细胞有、基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌大肠杆菌枯草杆菌枯草杆菌支原体支原体动植物细胞动植物细胞ABCDBD3、基因工程是在、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A.人工合成基因人工合成基
39、因 B.目的基因与运载体结合目的基因与运载体结合C.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达目的基因的检测和表达Cv目的基因的表达和检测抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法DNA-RNADNA-RNA分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法DNADNA分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法受体是否具有受体是否具有受体是否具有受体是否具有转基因特征转基因特征转基因特征转基因特征个体个体个体个体水平水平水平水平目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基
40、因是否转录目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否导入分子分子分子分子水平水平水平水平方法方法方法方法检测对象检测对象检测对象检测对象检测检测导入检测：目的基因是否导入受体细胞导入检测：目的基因是否导入受体细胞方法方法 DNADNA分子杂交分子杂交表达检测表达检测转录检测转录检测分子杂交分子杂交翻译检测翻译检测抗原抗体抗原抗体杂交杂交分分子子检检测测法法鉴定鉴定抗虫鉴定抗虫鉴定抗病鉴定抗病鉴定活性鉴定等活性鉴定等个体水平的鉴定个体水平的鉴定v目的基因的表达和检测（一）、检测（一）、检测1 1、检测转基因生物染色体的、检测转基因生物染色体的DN
41、ADNA上是否插入上是否插入了目的基因了目的基因 ( (关键步骤关键步骤) ).首先取出转基因生物的基因组首先取出转基因生物的基因组DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用放射性同位片段用放射性同位素等作标记素等作标记,以此做探针以此做探针.使探针和转基因生物的基因组杂交使探针和转基因生物的基因组杂交,若显若显示出杂交带示出杂交带,表明染色体已插入染色体表明染色体已插入染色体DNA中中（1）方法方法: :DNADNA分子杂交分子杂交（2）过程）过程:DNADNA分子杂交示意图分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起
42、，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。 P P1515思考与探究思考与探究（二）、鉴定（个体生物学水平）（二）、鉴定（个体生物学水平）2 2、检测目的基因是否转录出了、检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA3 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法: :分
43、分 子子 杂杂 交交方法方法: :抗原抗体杂交抗原抗体杂交过程过程:用上述探针和转基因生物的用上述探针和转基因生物的mRNA杂交杂交,若出现杂交带若出现杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNA目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是道。下列属于目的基因检测和鉴定的是检测受体细胞中是否有目的基因检测受体细胞中是否有目的基因检测受检测受体细胞中是否有致病基因体细胞中是否有致病基因检测目的基因是否检测目的基因是否转录出转录出mR
44、NA检测目的基因是否翻译出蛋白检测目的基因是否翻译出蛋白质质ABCDC采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是入目的基因的做法正确的是将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将毒素蛋白质注射到棉受精卵中将编将编码毒素蛋白的码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中序列注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中重组，注射到棉的子房并进入受精卵中将编码毒素蛋白的将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，序列与质粒重组，导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养导人细菌感染棉的体细胞，再进行组织
45、培养ABCDC归纳: 基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、 Ca2+处理处理4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄
46、河三角洲等盐碱地的开发利增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于处。（填处。（填“a”或或“b”）练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻关
47、注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法有农杆菌转化法和法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用利用技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是和和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交作探针进行分子杂交检测，又要用检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。的耐盐性。有关基因工程的叙述
48、正确的是有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D有关基因工程的叙述中，错误的是（有关基因工程的叙述中，错误的是（）A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目
49、的基因不用限制性内切酶AC基因工程是在基因工程是在基因工程是在基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计施工的。在基因分子水平上进行设计施工的。在基因分子水平上进行设计施工的。在基因分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C C、将目的基因导入受体细胞、将目
50、的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞D D、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到类胰岛素，这一过程涉及到A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接B.把重组后的把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增分子导入受体细菌内进行扩增C.检测重组检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性分子是否导入受体细菌内并表达出性状状D.筛选出能产生胰岛素的筛选
51、出能产生胰岛素的“工程菌工程菌”ABCD培培养养培培养养培培养养导入导入含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌含有氨苄青霉素含有氨苄青霉素的完全培养基的完全培养基含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基两两种种培培养养基基均均不不能能生生长长大大肠肠杆杆菌菌 Ca2+处理细胞处理细胞形成感受态细胞形成感受态细胞检测检测（培养不具有氨苄青霉素（培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）抗性基因和四环素抗性积基因的大肠杆菌）只有氨苄青霉素只有氨苄青霉素抗性基因质粒抗性基因质粒只具有氨苄青霉素只具有氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌抗性基因大肠杆菌不不具具有有氨
52、氨苄苄青青霉霉素素抗抗性性基基因因和和四四环环素素抗抗性性积积基基因因的的大大肠肠杆杆菌菌完全培养基完全培养基导入导入接种培养接种培养接种培养接种培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大大肠肠杆杆菌菌不不含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因四环素四环素抗性基因抗性基因四环素四环素抗性基因抗性基因存存活活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？存活存活导入导入接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养接种接种培养培养含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基大大肠肠杆杆菌菌不不含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：不存活不存活含有四环素的含有四环素的完全培养基完全培养基证明：证明：大大肠肠杆杆菌菌含含抗抗四四环环素素基基因因证明：证明：大肠杆菌大肠杆菌的受体细胞含的受体细胞含有目的基因有目的基因四环素四环素抗性基因抗性基因四环素四环素抗性基因抗性基因完全培养基完全培养基存存活活如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？如何把导入了目的基因的受体细胞筛选出来？
