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1、第四节代谢调节的人工控制第四节代谢调节的人工控制微生物的正常代谢不会使代谢产物过微生物的正常代谢不会使代谢产物过量积累，发酵目的是尽可能多地积累代谢量积累，发酵目的是尽可能多地积累代谢产物，以此必须打破微生物的代谢调节机产物，以此必须打破微生物的代谢调节机制，使代谢产物大量积累。制，使代谢产物大量积累。方法方法改变微生物的遗传学特性改变微生物的遗传学特性控制发酵条件控制发酵条件一改变微生物的遗传学特性一改变微生物的遗传学特性（一）（一）.营养缺陷型和渗透缺陷型突变菌株的应用营养缺陷型和渗透缺陷型突变菌株的应用1.营养缺陷型：原菌株由于发生突变，致使营养缺陷型：原菌株由于发生突变，致使代谢途径中
2、某一步骤发生缺陷，从而丧失代谢途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某种物质的能力，必须在培养基中了合成某种物质的能力，必须在培养基中外源补加该营养物质才能正常生长的突变外源补加该营养物质才能正常生长的突变菌株。菌株。在培养过程中我们可以控制补加营养物质的在培养过程中我们可以控制补加营养物质的量也不造成反馈调节（阻遏或抑制）。量也不造成反馈调节（阻遏或抑制）。如如ABCDE限量添加限量添加E，就会造成，就会造成C大量积累大量积累枯草芽孢杆菌的精氨酸营养缺陷型，鸟氨枯草芽孢杆菌的精氨酸营养缺陷型，鸟氨酸积累量可到到酸积累量可到到25g/L.ABCFDGEABCFDGE协同反馈协同反馈ABCFDG
3、EABCFDGEH赖氨酸简介：赖氨酸简介：谷物中不含的必须氨基酸。谷物中不含的必须氨基酸。天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半醛天冬氨酸半醛赖氨酸赖氨酸高丝氨酸高丝氨酸甲硫氨酸甲硫氨酸苏氨酸苏氨酸异亮异亮氨酸氨酸天冬氨酸激酶（天冬氨酸激酶（AK)反反馈馈抑抑制制反反馈馈阻阻遏遏谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸谷氨酸棒状杆菌生产赖氨酸高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶(HSDH)利用谷氨酸棒状生产赖氨酸比利用大肠杆菌利用谷氨酸棒状生产赖氨酸比利用大肠杆菌的优势：的优势：（1）不存在天冬氨酸激酶或天冬氨酸半）不存在天冬氨酸激酶或天冬氨酸半醛脱氢酶受阻遏的问题；醛脱氢酶受阻遏的问题；（2）赖氨酸分支
4、的第一和第二个酶（双）赖氨酸分支的第一和第二个酶（双氢吡啶二羧酸合成酶和双氢吡啶二羧酸还原氢吡啶二羧酸合成酶和双氢吡啶二羧酸还原酶）不受赖氨酸的抑制或阻遏；酶）不受赖氨酸的抑制或阻遏；（3）赖氨酸产生菌中缺少）赖氨酸产生菌中缺少L-赖氨酸脱羧酶。赖氨酸脱羧酶。肌苷酸生成菌株肌苷酸生成菌株PRPP磷酸核糖基焦磷酸磷酸核糖基焦磷酸IMP肌苷酸肌苷酸S-AMP肌苷酸琥珀酸肌苷酸琥珀酸AMP腺嘌呤腺嘌呤5单磷酸单磷酸XMP黄苷酸黄苷酸GMP鸟嘌呤鸟嘌呤5单磷酸单磷酸PRPPIMPS-AMPAMPXMPGMPPRPP酰氨转移酶酰氨转移酶抑抑制制IMP脱氢酶脱氢酶S-AMP合成酶合成酶肌苷酸简介：很好的高
5、效调味品，也是重要肌苷酸简介：很好的高效调味品，也是重要的工业原料。的工业原料。产量达产量达13g/L2. 渗漏缺陷型渗漏缺陷型(leaky mutant): 一种不完全遗传障碍营养缺陷型，一种不完全遗传障碍营养缺陷型，能够自己合成某一代谢终产物但达不到能够自己合成某一代谢终产物但达不到反馈调节的浓度，所以不会造成反馈抑反馈调节的浓度，所以不会造成反馈抑制而影响中间代谢产物的积累。制而影响中间代谢产物的积累。与营养缺陷型的区别？与营养缺陷型的区别？（二）抗反馈调节突变菌株的应用（二）抗反馈调节突变菌株的应用抗反馈调节菌株：对反馈抑制作用不敏感，抗反馈调节菌株：对反馈抑制作用不敏感，或对反馈阻遏
6、有抗性，或二者兼而有之的或对反馈阻遏有抗性，或二者兼而有之的菌株。菌株。抗反馈抑制突变菌株的获得途径：抗反馈抑制突变菌株的获得途径：1.结构类似物抗性突变菌株结构类似物抗性突变菌株2.营养缺陷型回复突变菌株营养缺陷型回复突变菌株获得方法及其原理：获得方法及其原理： 结构类似物抗性突变菌株结构类似物抗性突变菌株将接除了反馈抑制的突变菌株筛选出来将接除了反馈抑制的突变菌株筛选出来A某种氨基酸某种氨基酸A某种氨基酸的类似物某种氨基酸的类似物A经过突变处理的菌株经过突变处理的菌株极少数极少数大大多多数数目标产物目标产物结构类似物结构类似物赖氨酸赖氨酸S-S-（2 2氨基乙基）氨基乙基）-L-L半胱半胱
7、氨酸氨酸-(AEC)-(AEC)苏氨酸苏氨酸 - -氨基氨基- - - -羟基戊酸羟基戊酸（AHV)AHV)异亮氨酸异亮氨酸乙硫氨酸乙硫氨酸精氨酸精氨酸D-D-精氨酸精氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸对氟苯丙氨酸营养缺陷型回复突变菌株营养缺陷型回复突变菌株获得方法及其原理：获得方法及其原理：营养缺陷型营养缺陷型出发菌株出发菌株催化亚基基因突变催化亚基基因突变催化和调节亚基均突变催化和调节亚基均突变催催化化亚亚基基回回复复催催化化亚亚基基和和调调节节回回复复催化亚基完全回复催化亚基完全回复催化亚基未完全回复催化亚基未完全回复抗反馈调节突变菌株与营养突变菌株比较：抗反馈调节突变菌株与营养突变菌株比
8、较：1.不受培养基中营养成分的限制，生产稳定；不受培养基中营养成分的限制，生产稳定；2. 易于筛选易于筛选3.可有效防止回复突变，易于保存可有效防止回复突变，易于保存对于分支合成途径使用抗性突变菌株要和营对于分支合成途径使用抗性突变菌株要和营养缺陷型结合育种，才会得到更高的产量。养缺陷型结合育种，才会得到更高的产量。葡萄糖葡萄糖天冬氨酸天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸磷酸高丝氨酸高丝氨酸苏氨酸苏氨酸AHVr甲硫氨酸甲硫氨酸Met -赖氨酸赖氨酸Lys-HDAK反馈抑制反馈抑制反馈阻遏反馈阻遏黄色短杆菌黄色短杆菌的苏氨酸合的苏氨酸合成途径成途径抗代谢类似物的筛选方法抗代谢类似物的筛选方法不含结构类似
9、物不含结构类似物含结构类似物含结构类似物3.抗分解阻遏突变体的应用抗分解阻遏突变体的应用例如：葡萄糖脯氨酸，筛选抗分解阻遏突变体例如：葡萄糖脯氨酸，筛选抗分解阻遏突变体利用葡萄糖类似物选育蔗糖酶、淀粉酶、利用葡萄糖类似物选育蔗糖酶、淀粉酶、纤维素酶纤维素酶4.选育组成型突变株和超产突变株选育组成型突变株和超产突变株如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而如果调节基因发生突变，以至产生无效的阻遏物而不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成不能和操纵基因结合，或操纵基因突变，从而造成结构基因不受控制的转录，酶结构基因不受控制的转录，酶 的生成将不再需要的生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物
10、或分解代谢物阻遏，这样诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏，这样的突变株称为的突变株称为 组成型突变株。少数情况下，组成组成型突变株。少数情况下，组成型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种型突变株可产生大量的、比亲本高的多的酶，这种突变株称为超产突变株。突变株称为超产突变株。组成型突变株组成型突变株 结构基因不受控制地转录，酶的结构基因不受控制地转录，酶的生成将不再需要诱导剂或不再被生成将不再需要诱导剂或不再被末端产物或分解代谢物阻遏。末端产物或分解代谢物阻遏。 调节基因发生突变调节基因发生突变产生无效的阻遏物而不产生无效的阻遏物而不能与操纵基因结合能与操纵基因结合操纵基因突变操纵基因
11、突变突变操纵基因不突变操纵基因不能与阻遏物结合能与阻遏物结合组成型突变组成型突变5.条件致死条件致死 例如在抗生素和酶制剂生产过程中的应用。例如在抗生素和酶制剂生产过程中的应用。6.细胞膜通透性突变体的应用细胞膜通透性突变体的应用使胞内的代谢产物迅速渗漏出去使胞内的代谢产物迅速渗漏出去,解除末端产物的反馈抑制。解除末端产物的反馈抑制。 1. 用生理学手段用生理学手段 直接抑制膜的合成或使膜受缺损直接抑制膜的合成或使膜受缺损 如如: 在在Glu发酵中把生物素浓度控制在发酵中把生物素浓度控制在亚适量亚适量可大量分泌可大量分泌Glu；控制生物素的含量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；控制生物素的含
12、量可改变细胞膜的成分，进而改变膜透性；当培养液中生物素含量较高时采用当培养液中生物素含量较高时采用适量添加青霉素适量添加青霉素的方法；的方法；再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是再如：产氨短杆菌的核苷酸发酵中控制因素是Mn2+； Mn2+的作用与的作用与生物素相似。生物素相似。2. 利用膜缺损突变株利用膜缺损突变株 油酸缺陷型、甘油缺陷型油酸缺陷型、甘油缺陷型如如:用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，用谷氨酸生产菌的油酸缺陷型，培养过程中，有限制地添加油酸，合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。合成有缺损的膜，使细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸产量。甘油缺陷型菌
13、株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸甘油缺陷型菌株的细胞膜中磷脂含量比野生型菌株低，易造成谷氨酸大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，大量渗漏。应用甘油缺陷型菌株，就是在生物素或油酸过量的情况下，也可以获得大量谷氨酸。也可以获得大量谷氨酸。7.增加有关基因的数量增加有关基因的数量增加结构基因或操纵基因的数量增加结构基因或操纵基因的数量 例如，例如，半乳糖苷酶、青霉素酶、氯半乳糖苷酶、青霉素酶、氯霉素转酰氨酶等可借助含有相应结构基因霉素转酰氨酶等可借助含有相应结构基因的质粒转移给受体培养物来增加产量；利的质粒转移给受体培养物来增加产量；利用含有对苯丙氨酸的结构
14、基因的转导噬菌用含有对苯丙氨酸的结构基因的转导噬菌体可使该酶产量增加体可使该酶产量增加15倍。倍。 通过操作基因与传统诱变技术和代谢调通过操作基因与传统诱变技术和代谢调控相结合提高产量。控相结合提高产量。 启动基因的突变增加启动基因的突变增加RNA聚合酶和聚合酶和DNA的亲和力，增加转录速率。的亲和力，增加转录速率。（二）发酵条件的控制（二）发酵条件的控制 DA B C E F(-)(-)(-)1.添加前体绕过反馈控制点添加前体绕过反馈控制点2. 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底
15、物的衍生物。物的衍生物。如：大肠杆菌如：大肠杆菌-半乳糖苷酶的最有效诱导剂半乳糖苷酶的最有效诱导剂是异丙酰是异丙酰-D-硫代半乳糖苷，它不被硫代半乳糖苷，它不被-半乳半乳糖苷酶分解。糖苷酶分解。 高浓度底物诱导剂的利用速率太快时，也高浓度底物诱导剂的利用速率太快时，也会引起分解代谢物的阻遏，对许多发酵生产会引起分解代谢物的阻遏，对许多发酵生产胞外酶，如果底物浓度过高，产量反而不高。胞外酶，如果底物浓度过高，产量反而不高。 有些底物类似物作为诱导剂，因为利用速有些底物类似物作为诱导剂，因为利用速度慢，可以消除代谢物的阻遏，显著提高酶度慢，可以消除代谢物的阻遏，显著提高酶的产量。的产量。3. 发酵
16、与分离过程耦合：发酵与分离过程耦合： 在发酵过程中及时将末端代谢产物移在发酵过程中及时将末端代谢产物移走，末端代谢产物保持较低水平，解除反走，末端代谢产物保持较低水平，解除反馈调节。馈调节。 耦合手段较多，有膜分离、离子交换耦合手段较多，有膜分离、离子交换分离和萃取等。这些分离装置应该具有分分离和萃取等。这些分离装置应该具有分离效率高、抗污染、易于重复使用等特定。离效率高、抗污染、易于重复使用等特定。4. 控制发酵的培养基成分：控制发酵的培养基成分： 通过各种加料方法来限制生长速率，通过各种加料方法来限制生长速率，使酶生产去阻遏。使酶生产去阻遏。 通过控制生物素来增加谷氨酸产生菌通过控制生物素
17、来增加谷氨酸产生菌细胞膜的通透性；添加青霉素抑制细胞壁细胞膜的通透性；添加青霉素抑制细胞壁后期合成，细胞壁不能形成完整的网状结后期合成，细胞壁不能形成完整的网状结构，引起磷脂和细胞壁成分的构，引起磷脂和细胞壁成分的UDP-N-乙酰乙酰己糖向外分泌使细菌的细胞壁和细胞膜的己糖向外分泌使细菌的细胞壁和细胞膜的合成受到损伤。合成受到损伤。 加入适量的无机离子例如加入适量的无机离子例如Mn2+可增加膜可增加膜的通透性。的通透性。例如：在发酵工业中，为了提高次级例如：在发酵工业中，为了提高次级代谢的产量。利用乳糖和葡萄糖的混代谢的产量。利用乳糖和葡萄糖的混合流加来提高青霉素的产量。乳糖非合流加来提高青霉素的产量。乳糖非青霉素的直接前体，是因为它能够缓青霉素的直接前体，是因为它能够缓慢应用从而使分解代谢产物处于较低慢应用从而使分解代谢产物处于较低水平，不至于阻遏青霉素合成。水平，不至于阻遏青霉素合成。
