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1、聚丙烯酰胺凝胶双向电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳聚丙烯酰胺凝胶双向电泳第一部分第一部分 实验简介实验简介一、实验目的一、实验目的 通过双向电泳实验，初步掌握电泳的基本理论、双向电泳实验的设计原理和实验技能。二、实验原理 根据不同的蛋白质具有不同的分子量和等电点的特点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置，就是该蛋白质的相对分子量和等电点。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳三、三、实验流程 蛋白样品的制备 等电聚焦凝胶溶液的配制 灌
2、注毛细管凝胶 组装第一向电泳槽 聚焦电泳 停止电泳 取出毛细管胶 毛细管胶置平衡液中平衡聚丙烯酰胺凝胶双向电泳组装第二向电泳槽配制SDS-丙烯胺凝胶溶液灌装SDS-电泳胶第一向凝胶与第二向凝胶拼接接通电源进行SDS-电泳停止电泳取胶凝胶置固定液中固定 银染法显色 结果分析聚丙烯酰胺凝胶双向电泳第二部分第二部分 实验方法实验方法第一向电泳第一向电泳毛细管等电聚焦电泳（毛细管等电聚焦电泳（IEF）1.仪器准备仪器准备双向电泳系统一套（见清单）烧杯1000mL、50mL各1个量筒1000mL（或500mL）、100mL、10mL各1个注射器1mL（带长针头）、微量注射器100L（或50L）各1支大塑
3、料盒1个滴管1支聚丙烯酰胺凝胶双向电泳2溶液配制(1)覆盖溶液（25mL/班）含8mol/L尿素，1%两性电解质pH39.5，5%(w/v)NP40(NonidetP40Substitute)和100mmol/LDTT取12g尿素，0.25mL两性电解质(pH39.5)，12.5mL的10%的NP40和0.386gDTT，用重蒸水溶解后，定容到25mL。溶液不能受热,储存在冰箱中。(2)平衡溶液（250mL/班）Tris-HCl(pH6.8)缓冲液，含2%SDS，100mmol/LDTT和10%甘油15mLTris-HCl(pH6.8)，50mL10%SDS，3.86gDTT和29mL甘油，用
4、重蒸水定容到250mL，室温存放。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(3)30%Acrylamide第一向储液（100mL/班）含28.4%(w/v)acrylamide和1.6%(w/v)N,N-methylene-bis-acrylamide用重蒸水先将1.6gbisacrylamide溶解后，再加入28.4gacrylamide，溶解，用重蒸水定容到100mL。如果溶液混浊，需要进行过滤。溶液存放在棕色瓶中，4C贮藏，34星期内使用。(4)10%(w/v)NP40（20mL/班）配制100mL溶液，称量10gNP40，用重蒸水定容到100mL，室温存放。(5)20mmol/LNaOH配制500mL，
5、称0.4gNaOH用蒸馏水定容到500mL。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(6)10mmol/LH3PO4配制2000mL，量取1.35mLH3PO4(85%)用蒸馏水定容到2000mL。(7)固定液乙醇35mL，三氯乙酸10g，磺基水杨酸3.5g，加蒸馏水定容到100mL。(8)脱色液乙醇25mL，冰乙酸10mL，加蒸馏水定容到100mL。(9)10%过硫酸铵0.1g过硫酸铵溶于1mL重蒸水中，在4C冰箱中可保存34个星期。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳3实验步骤(1)准备玻璃管取4支18cm的长玻璃管，洗净晾干。(2)配制第一向凝胶溶液（8mL/4组）配制方法见表1。表1第一向凝胶溶液配方尿素3.84g重
6、蒸水2.0mL30%Acrylamide储液1.6mL搅拌溶解10%NP401.5mL两性电解质(pH39.5)0.50mL10%过硫酸铵*15LTEMED*10L聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(3)灌制第一向凝胶（每组2人共制作4根胶柱）取1支1mL注射器和一根长针头，吸取约0.5mL第一向凝胶溶液，再取1支玻璃管，用手指垫一块封口膜堵住玻璃管的一端，将长针头全部插入玻璃管中，一边注入凝胶溶液一边后退针头，注意针头不要露出胶面,直至凝胶溶液到达玻璃管顶端，撤出针头，用滤纸擦干玻璃管口的凝胶溶液，然后用封口膜封住该端管口，将玻璃管倒置，将长针头从玻璃管的另一端插入管内凝胶液面下，用同样方法加入凝胶溶液
7、至距管口2cm处，将玻璃管垂直放置，然后立即用微量注射器在胶面上加少量重蒸水覆盖，大约30min后凝胶聚合。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(4)加样待凝胶聚合后，用微量注射器吸去覆盖在胶上的重蒸水。在每根胶柱上加2030L蛋白质样品溶液，然后再加入覆盖溶液至管口。(5)安装电泳槽加样后将玻璃管插入电泳槽的架子上，在上槽中玻璃管上端露出1cm，剥去玻璃管下端的封口膜，准备电泳。在电泳槽的下槽加2000mL10mmol/LH3PO4溶液，将柱胶下端浸入到H3PO4溶液中，注意胶下端不可有气泡(如果有气泡，可以先用注射器将胶下端用H3PO4溶液灌满，再将柱胶插入H3PO4溶液中)。上槽倒入500mL20mm
8、ol/LNaOH溶液，盖上电泳槽盖，注意正负电极。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(6)聚胶电泳聚胶电泳在10001500V的电压下进行电泳，直至电流接近于为零(大约78h)停止电泳。如果聚焦好的凝胶不能马上进行第二向电泳，在管内放置了几小时以上,可在走第二向电泳之前再聚焦电泳12h，以消除样品受扩散的影响。(7)退胶电泳结束后，在整极端凝胶内插入约1cm长的铜丝作为标记，用洗耳球从玻璃管上样端轻轻挤入空气，将凝胶退胶或用10mL注射器和长针头吸入一定的蒸馏水，将长针头一边沿管壁推入一边注入蒸馏水使凝胶退出。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳（8）平衡）平衡:将推出的一条凝胶条放入盛有10ml平衡液的小烧杯中，浸泡
9、平衡20min，然后进行第二向电泳.(9)染色染色:另一条胶放入固定液中固定12h，用考马斯亮蓝R250染色1h，再用脱色液脱色，观察第一向聚焦效果。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 第二向电泳第二向电泳-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电（聚丙烯酰胺凝胶电（SDS-PAGE）1溶液配制溶液配制(1)30%Acrylamide第二向储液（500mL/班）含29.1%(w/v)acrylamide和0.9%(w/v)N,N-methylene-bis-acrylamide，配制方法同第一向储液。(2)10%SDS称10gSDS用重蒸水溶解，定容到100mL，室温存放。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 (3)分离胶缓冲液（30
10、0mL/班）1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.9。称Tris109g，取1mol/LHCl144mL，用重蒸水定容至300mL，4C保存。(4)浓缩胶缓冲液（300mL/班）0.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.9。称Tris6g，取1mol/LHCl48mL，用重蒸水定容至100mL，4C保存。(5)电极缓冲液（2500mL/2组）称6g的Tris，29g甘氨酸，2.5gSDS，用蒸馏水定容到2.5L。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 (5)电极缓冲液（2500mL/2组）称6g的Tris，29g甘氨酸，2.5gSDS，用蒸馏水定容到2.5L。(6)固定液乙醇50mL，冰醋酸1
11、0mL，用蒸馏水定容至100mL。(7)染色液0.25g考马斯亮蓝R-250，40mL乙醇，10mL冰醋酸，用水定容到100mL。(8)10%过硫酸铵、脱色液同第一向电泳。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳2实验步骤实验步骤(1)组装夹心式玻璃板、制胶支架底座调水平；取一块长玻璃板和一块带磨口槽的短玻璃板，将短玻璃板带磨口槽的一边位于上端与长玻璃相对，两玻璃板之间的左、右两端各放入一条间隔条，对齐，插入玻璃板固定夹，将上面的固定螺丝拧紧，将此夹心式玻璃板放入制胶支架底座，插入凸轮，向内侧推入并旋转180，夹心式玻璃板即被固定。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(2)分离胶配制分离胶按照凝胶浓度不同分为三层，自下而上浓
12、度递减，每层高度约45cm，分别按照表2配制，并依次灌制。试剂凝胶浓度18%12%7%30%Acrylamide储液/mL7.24.82.8分离胶缓冲液/mL3.03.03.0重蒸水/mL1.64.06.010%SDS/mL0.120.120.12TEMED/L20202010%AP/L303030总体积/mL121212聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(3)灌注分离胶首先将配制的第一层凝胶溶液用滴管沿着长玻璃板内侧缓缓加入凝胶腔，小心不产生气泡，然后用少量1/4浓度的分离胶缓冲液封胶面（高度约2mm），凝胶聚合大约30min。待凝胶聚合后用滤纸片吸干封胶缓冲液，灌注第二层凝胶溶液，并封胶面。凝胶聚合后
13、灌注第三层凝胶溶液，最终凝胶距离短玻璃板上沿3cm左右,最后用1/4浓度的分离胶缓冲液封胶面（约20mm）。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(4)配制和灌注浓缩胶用滤纸吸去分离胶上面封的分离胶缓冲液，然后加入浓缩胶溶液，插入样品槽模板，凝胶溶液应到达短玻璃板上沿，聚合0.51h。浓缩胶溶液配制方法见表3。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳试剂凝胶浓度5%30%Acrylamide储液/mL2.5浓缩胶缓冲液/mL2.0重蒸水/mL10.210%SDS/mL0.15TEMED/L3010%AP/L45总体积/mL15聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(5)安装第二向电泳装置在冷却槽上取下红色密封条，安装上白色密封条，将夹心式凝胶
14、板从灌胶支架底座上取下，安装在冷却槽上。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(6)凝胶拼接将平衡好的胶条用少量的电极缓冲液漂洗，摆放在一块干净的玻璃板上，胶条的正极端位于小加样槽一端。胶条两端各切去约2cm，使凝胶长度略短于加样槽；轻轻拔出样品槽模板，在小加样槽中加入510L标准蛋白质；用滴管将已加热融化的用电极缓冲液配制的1琼脂快速加在浓缩胶上，使琼脂在浓缩胶上铺开形成一层水平的胶层，琼脂高度为12mm；聚丙烯酰胺凝胶双向电泳待琼脂凝固，将放着胶条的玻璃板靠近短板，使胶条滑入槽内，平铺在琼脂上，将胶条与琼脂胶紧密结合；用滴管加融化的琼脂于胶条上，使到达短板上沿，将胶条包埋；滴加融化的琼脂到玻璃板与冷却槽交
15、接处，密封上槽。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(7)电泳将电泳装置放入电泳槽中，在上槽中灌入电极缓冲液，缓冲液高过短板，其余缓冲液到入下槽，应高过凝胶板下沿2cm。盖上电泳槽盖子，接通电源，恒压60V，电泳30min，样品进入凝胶后，调节恒压250V，电泳至溴酚兰到达分离胶底部1cm左右时停止。(8)固定倒去电极缓冲液，拆开电泳槽，取下凝胶板，放入固定液中，室温过夜。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳(9)染色和脱色用考马斯亮蓝R250染色液染色2h，用脱色液脱色，直至背景清晰。(10)实验结果凝胶扫描。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳蛋白质银染色技术1、准备试剂、准备试剂 甲醇、 1000ml 冰醋酸、 500ml 甲醛
16、 100ml DTT 500mg AgNO3 5000mg Na2CO3 60g聚丙烯酰胺凝胶双向电泳2、试剂配制（每个组）试剂配制（每个组）(1) 40甲醇10冰醋酸 150ml。(2) 10甲醇-5冰醋酸 150ml。(3) 5g/ml的DTT溶液 150ml。(4) 0.25AgNO3溶液 150ml。(5) 3Na2CO3溶液 150ml。(6) 3Na2CO3溶液（内含60-100l/100ml甲醛）150ml。(7) 5的冰醋酸溶液 150ml。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳3操作步骤操作步骤 将胶置于150ml 40甲醇10冰醋酸中浸泡，摇动固定过夜。 取出胶，置于120ml 10甲醇-
17、5冰醋酸中浸泡，摇动固定30min。 用去离子水将胶浸泡、漂洗，第一、二次，每次间隔20min。 去离子水摇动漂洗，第三、四次，每次间隔30min换水一次。 倾出去离子水，加入5g/ml的DTT溶液120ml，摇动浸泡30min。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳 用去离子漂洗一次，然后将胶放在120ml 0.25AgNO3中浸泡30min。 用大量的去离子水将胶漂洗约2-3min。 将凝胶放入120mL 3Na2CO3溶液中浸泡3-5min。 将凝胶放在3Na2CO3溶液（内含120l/120ml甲醛，可根据情况增减）的显影液中显影。 等蛋白斑点清楚后，将胶放在5的冰醋酸溶液中10min停止反应。用蒸馏水将胶漂洗干净。聚丙烯酰胺凝胶双向电泳
