《各種疾病的分子基礎.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《各種疾病的分子基礎.ppt(43页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、各種疾病的分子基礎檢測DNA質變的方法單基因突變的檢測方法物理特性DGGE變性梯度明膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis PCR產物跑電泳的分析方法瓊脂凝膠電泳:可知大略大小、但長度差異小無法分別聚丙烯醯胺凝膠電泳:差一兩個鹼基可分開電泳的速度與片段大小有關,跟DNA 的組成及序列無關,不能分辨鹼基之間是否有突變 DNA雙鏈上發生部分的解鏈,會使電泳速度大大減慢DNA被變性的難易程度與DNA的長度及組成排列有關片段長及CG-rich需較高的溫度 DGGE的基本原理雙鏈的DNA部分解鏈成單鏈時,在凝膠電泳速度會大大減慢有鹼基發生突變時,正常與突變
2、跑出來的速度就會不一 樣DNA解鏈的溫度還與凝膠中尿素或甲醯胺的濃度有關,濃度會改變電泳速度DNA雙鏈的解鏈常是一個小區段接著一個小區段發生,這種小區段稱為變 性區變性區有微小的改變,會改變電泳的速度,藉由電泳的不同將正常與突變檢測出來變性梯度即尿素或甲醯胺的濃度,從陰極向陽極逐漸增強解鏈強度較低的DNA片段先達到其變性梯度而解鏈,電泳速度減慢解鏈強度高的DNA片段保持原來的速度繼續前進,直到達到特定變性梯度區才減慢速度結果將長度相同而序列有差別的DNA片段分離使用溴化乙錠或銀染就 可以觀測區帶的變化設計PCR引子時,擴增片段只含一個變性梯度區引子的5端增加2040 bp左右的CG,即CG c
3、lamp,可讓DNA區充分解鏈有時單個鹼基的替換無法改變解離強度將PCR後的兩個檢體產物混合,加熱變性,然後緩慢降溫使形成雜合雙鏈,雜合雙鏈在突變部位形成錯配雜合雙鏈的變性溫度與純合雙鏈有明顯的差別,雜合雙鏈能顯示出突變的存在 一般DGGE使用polyacrylamide gel(含尿素甲醯胺的濃度梯度也可改成溫度梯度,稱為TGGE固定變性凝膠電泳CDGE (constant denaturant gel electrophoresis)DGGE的缺點引子設計複雜必須只有單一的melting domain較難控制電泳條件 PCR為基礎的相關技術 ARMS (Amplified refracto
4、ry mutation system) 設計一對Primer可以特異地跟正常或突變的對偶基因結合Allele-Specific PCR可用來檢測單鹼基的突變或微小缺失突變缺點:突變與正常的基因型要分開來做, 不能同時在一管中進行1993 Rust et al.建立MS-PCR (Mutagenically separated-PCR)在正常(或突變)的引子5端多加了20 bp以Primer長度不同或不同螢光染料來區分靠近3端多加一、二個mismatch的鹼基,以增加反應的特異性多個鹼基的改變會使引子與正常或突變序列結合的穩定性不同,這樣就增加引子的特異性。 設計三種引子,第一種是針對正常基因設
5、計的短引子,第二種是針對突變基因設計的長引子,第三種引子則是共用的互補引子短片段者為正常型,為抗緊迫豬,而僅有長片段者為突變型,為緊迫豬,同時具有長和短兩個片段者則為雜合型,各具有一正常和突變基因,外表型表現與抗緊迫豬同 ACRS (Amplified Created restriction site) 偵測鹼基變異沒有產生限制酶切位時設計一個與正常有一、三個鹼基差異的mismatch primer 此primer設計在變異的鹼基附近PCR後,其產物在primer上的mismatch鹼基及鄰近序列合併變異的鹼基即可產生限制酶的切位設計一個mismatch的primer來產生二種不一樣的PCR
6、產物,一種產物會被特定的限制酶切,另一種不會被切Mismatch base的互補關係較不穩定,設計不佳沒有產物,若溫度調降雜bands多,特異性不足應用ACRS時, Primer的設計就必須特別注意base互補的穩定性。要愈穩定愈好Allele 1,.AACC. Allele 2,.AATC. 設計的引子設計的引子GA,經由經由PCR就會產生二種產物就會產生二種產物Allele 1,.GACC. Allele 2,.GATC. 以以上上的的產產物物:Allele 2 產產生生一一個個 GATC Mbol辨辨識識的的序列。可以切的就是序列。可以切的就是Allele 2 多重PCR (multip
7、lex PCR)當DNA有大段缺損時,利用位於缺損部位的特殊標記,設計引子放大這些標記設計時將每個標記的PCR產物設計成大小不同,且可在同一種PCR狀態進行作用由結果產物的大小變化,即可了解缺損的部分及範圍可用於偵測多個點突變設計多組 Primer ,做PCR反應,將所有可能突變的位點或基因多個缺失熱點區,都擴增分析注意各primer pairs之間應具有相同或相近的擴增條件,相互間不產生非特異性擴增或primer-dimer的情形 各個產物片段長度要適當,必須做 一個正常的內對照組( positive control)以防止擴增的假陰性反應 SSCP單鏈構形多形性single strand
8、conformation polymorphism單鏈的DNA在溶液一定的條件下會形成鏈內的局部雙鏈,進而形成特定的立體結構等長的DNA片段,如果鹼基組成及序列的不同就會形成不 一樣的構形特殊的凝膠中電泳,立體構形會影響電泳速度利用已知樣本跑出來的條帶圖形與未知樣本比較,就可以找出待測樣本是否存在突變條帶圖形看起來不太一樣,可將不一樣的樣本做定序,看是否有新的突變位點影響SSCP的因素很多:DNA序列組成與排列,電泳的溫度及凝膠的組成,所分析DNA片段的長度(最好在l50300 bp左右)SSCP的結果判定是與正常樣品來比較含未變性徹底的雙鏈、及正鏈和負鏈有時在某些條件下會出現額外的band,
9、可能是某條鏈在這種條件下會形成兩種構形變性不徹底的雙鏈,有同源雙鏈外,還有更多異源雙鏈SSCP會隨著分析片段長度增加而降低檢出率最好的解析長度是250 bp左右1992年Sarkar等利用Sanger定序法原理,建立雙去氧指紋法( dideoxyl fingerprinting, ddF)ddF是將雙去氧終止法與SSCP結合的分析技術,以一側引子,對PCR產物進行雙去氧末端終止定序反應,以ddCTP加入反應系中, 就會產生一系列長短不一的單鏈DNA,然後再進行SSCP比較分析將 SSCP加上螢光及毛細管電泳的技術就可以提高ddF的靈敏度 異源雜合雙鏈分析Heteroduplex Analysi
10、s,HA HA 在非變性膠電泳上,雜合的雙鏈與純合雙鏈的電泳速度不同,雜合速度會減慢正常基因與突變基因的PCR產物,可以加熱後緩慢冷卻就會形成異源的雜合雙鏈個體是突變的純合子,則可以將其PCR產物與正常個體的PCR產物 以1:1混合因鹼基錯配,其分子的構形與同源雙鏈DNA不同,可區分開HA可分析大於1 kb的片段,但是片段愈大檢測的效率愈差使用溫和變性凝膠電泳,電泳的條件與SSCP類似,這種方法稱為comformation-sensitive gel electrophoresis (CSGE) 分析200 800 bp長度DNA片段的多形性 Carbodiimide修飾Carbodiimid
11、e Modification異源雜合的雙鏈,在C和T的錯配鹼基中,使用Carbodiimide來修飾錯配的地方這種雜合修飾過的錯配雙鏈,在電泳中會改變電泳的速度(被修飾的DNA會跑得比較慢) 藉由電泳 速度的不同來檢測突變的情形或使用primer做延伸反應,當到了被修飾的mismatch鹼基時就會停止引子的延伸,藉由引子延伸反應的中止而判斷突變的情形 DHPLC變性高效液相層析Denaturing high performance liquid chromatography 1995年史丹佛大學的Peter Oefner和Umderhill改進 HPLC分析DNA片段的技術分析150 1000
12、 bp長度多形性HPLC原理:使用高壓幫浦連續按一定流量將 溶劑打入層析性中,再將定量的樣品注入管柱頂端,接著連續洗脫管柱,樣品中各成分,依在管柱中留置的時間( retention time) 不同逐漸分離DHPLC也稱為TMHA (temperature-modulated heteroduplex analysis)由控制管柱的溫度,選擇一個適當溫度,在這溫度下,雜合的雙鏈在錯配鹼基中會發生部份解鏈,而有部份解鏈的DNA在管柱中結合能力會下降,所以比純合雙鏈更早被洗下。 如果溫度過低沒有發生部份變性的情況,DNA與層析管柱結合的能力取決於DNA的長度片段越大在管柱中留置的時間就愈長雜合雙鏈
13、產物的產生方法將PCR 產物野生型和突變型以約1 : 1混合95C加熱5 分, 慢慢降低溫度每一個cycle降1.5C,共45回會形成雜合雙鏈。然後將8 m ml樣本注入管柱PCR產物分離條件DNA片段的長度及鹼基的組成錯配的雜合子在管柱上的時間會明顯下降先找正常型的DNA片段的實驗條件(管柱的溫度,及緩衝液濃度梯度),得知野生型標準圖譜待測的樣品所跑出來的圖譜與正常的比較建立各種突變的標準圖譜,可藉此快速自動化檢測疾病突變跑出來的peak有問題,也可以進行直接定序分析DHPLC有許多優點:自動化操作,快速和靈敏度高,應用於單基因突變的篩檢可以在短時間內分析大量的樣品 化學特性錯配鹼基化學切斷
14、法Chemical cleavage of mismatch, CCM 將篩檢的PCR產物混合,形成異源雜合雙鏈錯配的雜合DNA上的C和T可使用羥胺hydroxylamine及四氧化鋨osmium tetroxide修飾用peperidine切斷DNA的磷酸雙酯鍵切下修飾過的錯配鹼基,依電泳片段的長度大小判斷突變的情形 用於1 kb或更長的DNA突變分析上,有極 高的檢出率缺點:須放射性標記及使用有毒的化學物質錯配鹼基的酶學切斷法Enzyme cleavage of mismatch T4內切酶VII,會切除錯配的雜合雙鏈單一鹼基的錯配及形成小圈環 ( small loop )都會被切斷可以使
15、用於超過1 kb長度,但有時會有非特異性切 斷產物,使得結果很難分析植物的內切酶CELI效果較好, 較少非特異性的背景產生 連接酶鏈鎖反應ligase chain reaction, LCR1991 Barany設計二個相鄰的特異性寡核苷酸,只有待測的序列與二個寡核苷酸互補以連接酶將二個相鄰的寡核苷酸連接起來,而有產物產生新的產物又可以在下回合加溫降溫反應中當成新的 模板,經過30回合後,產物跑電泳就可以分辨突變的有無 RFLP (restriction fragment length polymophisms)或PCR-RFLP 人類非編碼區大約20004000 bp中會有一個變異點,編碼區
16、大約1000 bp左右會有一個變異點這些變異是單鹼基(核苷酸)多形性(SNP)的基礎有時突變點會破壞或產生一個限制酶辨識位,這種變化可被DNA blotting或PCR-RFLP檢測出來SNP (Single nucleotide polymorphism) 基因組中特定位點的單一鹼基多形性,非編碼區比編碼區豐富人類基因組中超過三百萬,可以做為基因組的標記這個多形 性的Allele是正常的,或者在某種情況下有潛在致病傾向建構全基因組SNP的晶片,排除個體、種族和環境非疾病因素的影響,使用晶片來尋找致病基因 CFLP (cleavage fragment length polymorphism
17、) 單股的DNA在一定條件下會形成鏈內的二級結構,相同長度而序列有變異所形成的二級結構會不相同藉由structure-specific的內切酶 cleavase I來切,就會在正常與變異中形成不同的條帶圖形( band pattern) Muts 由E. coli所分泌, Muts蛋白可以跟錯配的DNA結合與錯配的DNA結合,造成錯配的DNA 電泳速度減慢 自動定序Automated sequencing 使用 Sanger所發明的雙去氧鏈終止法的原理利用DNA聚合酶,一個引子、四種dNTP、四種ddNTP、單股DNA 模板,類似PCR方法, DNA聚合酶催化53的複製因ddNTP沒有3-OH
18、,不能與後續加入的 dNTP的磷酸基團,形成磷酸雙脂鍵,所以鏈的延伸就會終止調整每個定序反應中ddNTP與dNTP的比例,任何相對的鹼基都有可能被ddNTP所取代,只要一取代就形成鏈的終止定序方法所得到的是大大小單股DNA 利用4種螢光分別標記4種不同的ddNTPs自動定序儀以雷射偵測器,偵測時間和不同螢光顏色, 以電腦加以判讀 Fluorescence dideoxy Method I參考資料:http:/www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics15.htmFluorescence dideoxy Method II一般大量檢體可以先用PCR-RF
19、LP來做或PCR-SSCP分析,有問題的檢 體再送定序檢體量少或很重要的檢體,可以做完PCR後就直接定序 所有篩選突變的方法,最終都必須定序來確定定序頭尾比較不正確,最好3端及5端以另一個引子做定序目前技術大概可一次定1000 bp 左右Minisequencing PCR時,是引子依據模板逐一加入互補的dNTP做延伸反應此方法則使用ddNTP。所以若在引子的3端加入一個雙去氧鹼基就終止了反應加ddNTP的位置就是要突變所在產物跑自動定序分析Minisequencing反應產生一個peak就是homozygote (同型合子,純合 子) , 2個peak就是heterozygote (異型合子,雜合子) 初步篩選突變比較常用的是Sequencing , SSCP及DHPLC定序是目前最好的方法趨勢是自動化的過程,包括自動化的資料未來分析解讀及自動 化的樣本操作關鍵技術是Microarray Sequencing分子診斷只是將DNA序列上可能的異常或突變與正常的比對而已異常及突變太複雜,目前不可能將所有人類的異常突變都點在一片晶片上